陳紫涵，周 靜，王德成，晏 博

(1.三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽大學(xué)感染與炎癥損傷研究所，三峽大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌 443002；2.上海市(復(fù)旦附屬)公共衛(wèi)生臨床中心結(jié)核病研究中心，上海 201508)

谷胱甘肽是一種含硫醇的三肽，在真核生物中主要以還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的形式存在，其中GSH是真核生物維持和調(diào)節(jié)組織氧化還原穩(wěn)態(tài)所必需的[1，2]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究聚焦于GSH降解途徑[3，4]，以探討GSH穩(wěn)態(tài)對(duì)細(xì)胞功能的影響。γ-谷氨酰環(huán)轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyl cyclotransferase，γ-GCT，GGCT)是調(diào)節(jié)抗氧化劑GSH代謝的γ-谷氨酰循環(huán)的主要酶之一，其可以催化γ-谷氨酰肽氨基酸分解為5-氧代脯氨酸和游離氨基酸，同時(shí)也可以作為GSH限速酶，與γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys)作用從而調(diào)節(jié)GSH的合成[5]。近年來(lái)，還發(fā)現(xiàn)了一些新的能降解GSH的酶，2009年在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種定位于胞質(zhì)中的新型促凋亡蛋白CHAC1/MGC4504，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)，位于ATF4-ATF3-CHOP級(jí)聯(lián)通路的下游[6]，隨后chac1被證實(shí)屬于γ-GCT家族，有與γ-GCT家族成員類似的BtrG/γ-GCT折疊，作為一種新型特異性降解GSH的酶，在促凋亡信號(hào)傳導(dǎo)和氧化還原生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用[7，8]。

隨著研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)chac1的表達(dá)水平與多種疾病密切相關(guān)。chac1基因作為鐵死亡標(biāo)志物和促凋亡誘導(dǎo)因子[9]，在炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激、動(dòng)脈病變、實(shí)體腫瘤、白血病等疾病的發(fā)生或發(fā)展中發(fā)揮作用[10-16]。有趣的是，近期一項(xiàng)有關(guān)凋亡中性粒細(xì)胞的代謝組學(xué)研究提示，GSH代謝是凋亡中性粒細(xì)胞中最易受干擾的代謝途徑之一，chac1作為GSH降解酶，在凋亡的中性粒細(xì)胞中表達(dá)增加[17]。在肺部炎癥疾病中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提示chac1可能參與誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞(AM)的凋亡，從而加速炎癥的消退[18]。這些研究提示了chac1可能與先天免疫細(xì)胞的發(fā)育及功能相關(guān)，但具體機(jī)制還不清楚。為進(jìn)一步探索基于代謝和轉(zhuǎn)錄組的先天性免疫細(xì)胞功能提供了思路。

有研究顯示，在生物早期發(fā)育時(shí)注射嗎啉代反義寡核苷酸(morpholino antisense oligo，MO)下調(diào)斑馬魚(Daniorerio)chac1的表達(dá)[19]，發(fā)現(xiàn)chac1敲除胚胎致死率較高，提示chac1可能在斑馬魚早期發(fā)育中所必需，但其在斑馬魚胚胎和組織中的表達(dá)特征及在早期造血發(fā)育中扮演的角色仍不明確。本研究運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚chac1基因，并通過(guò)蘇丹黑B染色、qRT-PCR檢測(cè)髓系造血發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，以期了解chac1基因在早期造血發(fā)育過(guò)程中可能的作用，從而為相關(guān)疾病治療提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

RNAiso Plus購(gòu)自Takara(9109)，HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(R323-01)，Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix購(gòu)自翌圣生物科技股份有限公司(11184ES25)，Cas9 Nuclease購(gòu)自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司(E365-01A)，RNase-free water購(gòu)自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司(G4700-500ML)，蘇丹黑染料購(gòu)自BBI LIFE SCIENCES(4197-25-5)，三卡因(E10521-10G)、PTU(P7629-10G)購(gòu)自Alorich，PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，sgRNA購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。

顯微注射儀PCO-1500(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9032(Blue Pard)，凝膠成像系統(tǒng)Tanon-3500(上海天能科技有限公司)，生物顯微鏡ECLIPSE Ci(Nikon)，離心機(jī)5424R(Eppendorf)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀CFX96TM Real-Time System(BIO RAD)，Nanodrop 2000核酸濃度檢測(cè)儀(Thermo Fisher)，盤旋式混合器KB-3-D(其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 斑馬魚品系及養(yǎng)殖條件

本實(shí)驗(yàn)所用野生型AB斑馬魚成魚或胚胎均由本課題組繁育，專人飼養(yǎng)于(28.5±0.5)℃恒溫自動(dòng)循環(huán)水系統(tǒng)中，以光照養(yǎng)殖14 h后黑暗養(yǎng)殖10 h作為斑馬魚的光照周期，養(yǎng)殖環(huán)境為pH 7.0～8.0，鹽度0.25‰～0.50‰，電導(dǎo)率500～800 μS/cm。用于顯微注射的胚胎由雌魚和雄魚按照1 ∶1的比例放置于產(chǎn)卵缸中，用擋板分隔開，次日取單細(xì)胞時(shí)期受精卵進(jìn)行顯微注射操作后移入胚胎培養(yǎng)液(MgSO4·7H2O 0.163 g/L，KCl 0.03 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl20.04 g/L)中置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 序列和生物信息學(xué)分析

從Ensemble網(wǎng)站(http：//asia.ensembl.org/index.html)獲取人、小鼠、斑馬魚的Chac1蛋白氨基酸序列，使用CLC Sequence Viewer 8軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中CD-Search工具查找基因家族保守結(jié)構(gòu)域并做出標(biāo)識(shí)。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)HomoloGene板塊成對(duì)比較智人與不同物種(黑猩猩、恒河猴、家牛、大鼠、小鼠、非洲爪蟾、斑馬魚)之間氨基酸和核苷酸序列的一致性和相似性。

用MEGA 11軟件的Clustal W方法進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)[20]，NJ法(Neighbor-Joining Algorithm)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[21]。

1.4 基因表達(dá)分析

組織的基因表達(dá)譜分析：選擇3尾3個(gè)月以上的成年斑馬魚并分離出不同組織，斑馬魚在收集組織前禁食1天。斑馬魚死亡后解剖，取出心、鰾、腸道、卵巢、精巢、肌肉、肝臟、腎臟、眼睛、脾臟、腦，分別浸泡于1 mL RNAiso Plus中并用TRizol法提取總RNA。

胚胎期的基因表達(dá)譜分析：根據(jù)斑馬魚胚胎不同發(fā)育階段，收集野生型斑馬魚0、0.5、1、3、5、10、12、24、48、72、96、120 hpf共12個(gè)時(shí)相的胚胎樣本，每個(gè)時(shí)期隨機(jī)收集30個(gè)受精卵用于總RNA的提取。

TRizol法提取不同樣本的總RNA后測(cè)定其濃度和純度。通過(guò)HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)對(duì)1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃，2 min；37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋5倍作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模版，并置于-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.5 斑馬魚chac1基因的敲除和鑒定

在NCBI gene數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中找到目的基因序列，利用在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站CRISPRscan(https：//www.crisprscan.org/？page=gene)選擇得分最高的3條sgRNA序列。在金斯瑞生物科技公司合成sgRNA。將3條sgRNA與Cas9蛋白按1∶1體積混勻后，注射到單細(xì)胞時(shí)期野生型斑馬魚胚胎中，同批次等體積注射3條混合scramble sgRNA與Cas9的混合物作為對(duì)照[22]，chac1 sgRNA和scramble sgRNA靶序列見表1。收集1 dpf的突變組和對(duì)照組胚胎，50 mmol/L NaOH和1 mol/L Tris-HCl提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物sanger測(cè)序以進(jìn)行突變效率檢測(cè)。PCR擴(kuò)增引物序列見表2。同時(shí)，收集1、3、5、7 dpf的突變組和對(duì)照組的存活胚胎或幼魚各20枚，TRizol法提取總RNA后逆轉(zhuǎn)為第一鏈cDNA，qRT-PCR定量突變斑馬魚chac1的3個(gè)靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本活性，qRT-PCR引物序列見表3。

表1 chac1 sgRNA和scramble sgRNA靶序列Tab.1 chac1 sgRNA and scramble sgRNA target sequences

表2 PCR擴(kuò)增引物序列Tab.2 List of primers for PCR amplification

表3 qRT-PCR引物序列Tab.3 List of primers for qRT-PCR

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

以ef1a為內(nèi)參，利用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix在Real-Time PCR上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，反應(yīng)體系為10 μL：mix 5 μL，H2O 3.6 μL，Primer F 0.2 μL，Primer R 0.2 μL，cDNA 1 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃，2 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)；65 ℃，5 s，95 ℃。引物序列見表3。用2△△Ct法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出基因的相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 蘇丹黑染色

收取3 dpf的野生型和chac1突變型斑馬魚幼魚，放入1 mL 4%的多聚甲醛固定液中4 ℃過(guò)夜固定。第二天移除固定液并用1 mL PBST洗3次，加入500 μL蘇丹黑常溫染色30 min。70%乙醇洗凈后，用PBST搖洗3次×5 min。最后加入1 mL 70%甘油，置于-20 ℃保存。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)都顯示為平均值±SEM。用T-test方法進(jìn)行差異顯著性分析，對(duì)于所有比對(duì)結(jié)果，P>0.05表示無(wú)顯著性差異；0.01

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚Chac1蛋白的序列特征

從Ensemble網(wǎng)站獲取斑馬魚chac1基因序列，其CDS長(zhǎng)度為591 bp，編碼由197個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。將斑馬魚Chac1與其他11個(gè)不同物種的CHAC1進(jìn)行多序列比對(duì)，并用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示(圖1A)，斑馬魚Chac1的進(jìn)化分枝與哺乳動(dòng)物分開，且與大多數(shù)物種保持了高度的進(jìn)化關(guān)系，尤其與斑點(diǎn)叉尾的親緣關(guān)系最近，其次是塞內(nèi)加爾多鰭魚和青鳉。利用CLC Sequence Viewer 8軟件對(duì)人、小鼠和斑馬魚chac1進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ChaC樣結(jié)構(gòu)域作為專門降解谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)域在不同物種中高度保守(圖1B)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)HomoloGene板塊將人與不同物種chac1的氨基酸和核苷酸進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)斑馬魚與人的氨基酸一致性為60.6%，基因相似性為63.4%(表4)。

2.2 chac1基因在斑馬魚胚胎和成魚不同組織中的表達(dá)特征

為了確定chac1基因在斑馬魚發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，我們檢查了斑馬魚不同發(fā)育階段的胚胎和成魚不同組織chac1 mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示chac1從斑馬魚胚胎的合子期到囊胚期中均為高表達(dá)(圖2A)，提示斑馬魚chac1是母源基因。chac1基因在斑馬魚成魚不同組織(心、魚鰾、腸道、卵巢、精巢、肌肉、肝臟、腎臟、眼睛、脾臟、腦)中都有表達(dá)，但其表達(dá)水平在肌肉、卵巢、腦中明顯較高(圖2B)，提示chac1在這些組織中參與重要功能，可能導(dǎo)致不同類型的疾病。

圖2 chac1基因在斑馬魚中的表達(dá)特征Fig.2 Expression characteristics of chac1 gene in D.rerioA：chac1在斑馬魚胚胎發(fā)育不同階段的表達(dá)譜(以12hpf為對(duì)照組)；B：chac1在成年斑馬魚不同組織中的表達(dá)譜(以心臟組織為對(duì)照組)。“*”表示0.010.05)。下圖同

2.3 CRISPR/Cas9構(gòu)建chac1基因突變斑馬魚

我們通過(guò)CRIPSR/Cas9基因編輯工具構(gòu)建chac1基因突變斑馬魚模型，設(shè)計(jì)了3條具有不同靶位點(diǎn)的sgRNA(圖3A)，與Cas9混合后共注射到野生型斑馬魚單細(xì)胞時(shí)期胚胎中以構(gòu)建chac1的突變體(圖3C)。1天后對(duì)突變組胚胎的PCR產(chǎn)物進(jìn)行一代測(cè)序檢測(cè)其突變效率，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物在PAM序列之后出現(xiàn)亂峰(圖3B)，說(shuō)明Cas9對(duì)靶序列的切割導(dǎo)致斑馬魚chac1在基因水平上發(fā)生錯(cuò)亂，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前出現(xiàn)終止密碼子，進(jìn)而使基因沉默。3條sgRNA都能高效誘導(dǎo)靶位點(diǎn)發(fā)生突變，3條sgRNA聯(lián)合注射導(dǎo)致的突變效率為100%(表5)。同時(shí)，利用qRT-PCR技術(shù)分析突變斑馬魚chac1 3個(gè)靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本活性，結(jié)果顯示突變品系中chac1的mRNA水平在顯微注射后1、3、5、7天均存在不同程度的下降(圖3D)。chac1基因敲除斑馬魚模型構(gòu)建成功。

圖3 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建斑馬魚chac1突變體Fig.3 Targeting strategy for generating D.rerio chac1 crispant by CRISPR/Cas9A：chac1基因結(jié)構(gòu)與位點(diǎn)突變示意圖；B：基因敲除斑馬魚胚胎PCR產(chǎn)物一代測(cè)序峰圖，圖中紅色方框?yàn)镻AM區(qū)域；C：斑馬魚顯微注射示意圖；D：qRT-PCR檢測(cè)野生型及敲除品系的斑馬魚不同靶位點(diǎn)chac1的mRNA水平(每個(gè)樣本為3次生物學(xué)獨(dú)立重復(fù)收集，每次每組25尾幼魚)

表5 不同靶位點(diǎn)的sgRNA突變效率Tab.5 sgRNA mutation efficiency at different target sites

2.4 chac1突變促進(jìn)斑馬魚中性粒細(xì)胞的生成

通過(guò)蘇丹黑B染色觀察發(fā)現(xiàn)3 dpfchac1突變斑馬魚較野生型斑馬魚的蘇丹黑B染色陽(yáng)性信號(hào)明顯增多(圖4A)。進(jìn)一步利用qRT-PCR檢測(cè)了斑馬魚粒細(xì)胞標(biāo)志物mpo、lyz的mRNA表達(dá)量均升高(圖4B)。以上結(jié)果表明斑馬魚中性粒細(xì)胞的早期發(fā)育與chac1基因有關(guān)。

圖4 斑馬魚chac1基因突變表型分析Fig.4 Phenotype analysis of chac1 gene mutation in D.rerio larvagesA：(左)用于中性粒細(xì)胞量化的代表性圖片，紅色箭頭所指為中性粒細(xì)胞，(右)斑馬魚幼魚全身中性粒細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)(n=20)；B：斑馬魚中性粒細(xì)胞標(biāo)志物mRNA的水平變化(n=20)

2.5 斑馬魚chac1缺失影響髓系造血基因表達(dá)

為了解釋chac1敲除后早期中性粒細(xì)胞增多的現(xiàn)象，我們進(jìn)一步檢測(cè)了chac1敲除后pu.1、cebpa、cebp1等髓系造血發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的mRNA表達(dá)變化，并發(fā)現(xiàn)pu.1在chac1突變體中表達(dá)明顯上調(diào)(圖5)。該結(jié)果提示斑馬魚chac1可能通過(guò)調(diào)節(jié)髓系造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控骨髓祖細(xì)胞向中性粒細(xì)胞的分化過(guò)程。

圖5 造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子pu.1、cebpa、cebp1的mRNA水平變化Fig.5 Changes in mRNA levels of hematopoietic transcription factors such as pu.1，cebpa，and cebp1

3 討論

chac1作為UPR下游的促凋亡因子，是GSH分解代謝通路中的重要基因，在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原、鐵死亡等多種生物學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。目前現(xiàn)有研究中，因?yàn)閏hac1敲除胚胎致死率較高，所以仍缺少chac1敲除模型以深入研究chac1的生理病理功能。CRISPR/Cas9作為一種強(qiáng)大的基因編輯工具[23，24]，可對(duì)基因組DNA進(jìn)行修飾，在建立人類疾病模型[25]和個(gè)性化治療人類疾病中起重要作用[26]。本研究利用CRISPR/Cas9靶向基因編輯技術(shù)，探討了斑馬魚chac1基因的表達(dá)特征及其在髓系造血中的功能，發(fā)現(xiàn)斑馬魚chac1基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)髓系造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子從而影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的形成。這將有助于深入了解chac1基因在斑馬魚早期造血中可能發(fā)揮的作用，同時(shí)為分析相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及尋找潛在治療策略提供思路。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)斑馬魚chac1的ChaC樣結(jié)構(gòu)域作為專門降解GSH的結(jié)構(gòu)域，在不同物種中高度保守，表明CHAC1降解GSH的功能在生物進(jìn)化過(guò)程中非常重要，可能具有重要功能。同時(shí)chac1在發(fā)育過(guò)程中也具有獨(dú)特的表達(dá)模式，我們的結(jié)果首次證明chac1是母源表達(dá)基因，同時(shí)，chac1在斑馬魚卵巢及腦組織中均高表達(dá)，這與chac1在小鼠中的表型相吻合[27]，但與小鼠不同，chac1在斑馬魚的心臟、肝臟、心臟等組織中表達(dá)較低，這有可能是因?yàn)樵趥€(gè)體基因水平上，同一基因的發(fā)育軌跡在不同物種中進(jìn)展不同，chac1有可能是發(fā)育動(dòng)態(tài)基因，其編碼的蛋白質(zhì)在表達(dá)上呈現(xiàn)出時(shí)間差異有關(guān)[28，29]。

相關(guān)研究表明斑馬魚骨髓細(xì)胞分為粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞兩個(gè)亞類，他們與炎癥、腫瘤、感染等疾病有關(guān)[30-32]。為了深入了解chac1在斑馬魚骨髓細(xì)胞早期造血中的生理功能，我們分析了突變斑馬魚基因靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本活性以進(jìn)行突變效率的驗(yàn)證[33]，成功構(gòu)建了chac1 crispant斑馬魚。對(duì)斑馬魚進(jìn)行蘇丹黑染色，使成熟中性粒細(xì)胞染色[34]，發(fā)現(xiàn)3dpf的chac1 crispant斑馬魚全身蘇丹黑陽(yáng)性信號(hào)較對(duì)照組更多。提示在定向造血階段，斑馬魚中性粒細(xì)胞發(fā)育與chac1有關(guān)。有研究表明，骨髓細(xì)胞的成熟是由多種組織特異性轉(zhuǎn)錄因子決定的，骨髓祖細(xì)胞需要這些轉(zhuǎn)錄因子來(lái)促進(jìn)他們的成熟和分化[35]。PU.1是骨髓祖細(xì)胞(CMP)進(jìn)一步分化發(fā)展的重要轉(zhuǎn)錄因子，其缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠髓系和淋巴系細(xì)胞出現(xiàn)發(fā)育缺陷[36]。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)家族成員的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和C/EBPε在髓系形成中起重要作用[37，38]。因此，造血轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)差異在正常造血調(diào)控中十分重要，我們發(fā)現(xiàn)在定向造血階段，chac1 crispant的pu.1水平上調(diào)，與我們SB染色的結(jié)果相符。同時(shí)，CHAC1是一種促凋亡因子，中性粒細(xì)胞的凋亡可能與CHAC1消耗GSH有關(guān)，敲除CHAC1可能會(huì)影響中性粒細(xì)胞的凋亡。值得注意的是，C/EBPα和C/EBPε的斑馬魚同源物cebpa、cebp1這兩種與中性粒細(xì)胞發(fā)育成熟有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[39]，在本研究中其表達(dá)量并沒(méi)有改變，這有可能是因?yàn)槲覀冊(cè)谶@里測(cè)定的是3dpf斑馬魚整體的基因表達(dá)變化趨勢(shì)，包括免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞，其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究對(duì)斑馬魚chac1的序列表征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，分析了chac1在發(fā)育過(guò)程中表達(dá)模式。同時(shí)利用CRISPR/Cas9定向基因編輯技術(shù)敲除了斑馬魚chac1基因后，發(fā)現(xiàn)chac1基因突變斑馬魚可能通過(guò)調(diào)節(jié)髓系造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子pu.1進(jìn)而影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的形成。在接下來(lái)的研究中，我們將運(yùn)用chac1基因突變斑馬魚模型進(jìn)一步研究chac1在造血及免疫中的生理病理功能，以深入了解chac1在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。