陳 曦，朱 玲，李 靖，許國瑩，葉耘峰

（江蘇護理職業(yè)學院，江蘇 淮安 223003）

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，它對人類健康構(gòu)成嚴重威脅，在所有惡性腫瘤中的死亡率排名第四。結(jié)直腸癌在治療效果和預(yù)后方面存在高度異質(zhì)性，即使是病理類型和臨床分期相同，其療效和預(yù)后也可能存在顯著差異［1］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT） 是一類生物調(diào)控過程，是正常發(fā)育中所必需的。但EMT 也在纖維化的發(fā)生等多種病理條件下發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包含改變細胞結(jié)構(gòu)，促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和增殖等［2］。腫瘤的侵襲與遷移是導致腫瘤患者出現(xiàn)不良預(yù)后的主要原因之一，是惡性腫瘤重要的生物學特征。越來越多的研究證明EMT 在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。

積雪草酸是一種已知的三萜類物質(zhì)，具有抗炎、降低血糖血脂、神經(jīng)保護、抗抑郁等多種重要的生物活性［3］。目前已有研究報道積雪草酸對舌癌、乳腺癌等的惡性腫瘤具有良好的體外抑制作用［4-5］，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)積雪草酸能夠增強結(jié)腸癌HCT116 細胞對臨床常規(guī)化療藥物奧沙利鉑的敏感性。本研究以結(jié)腸癌HCT116、SW480 細胞為研究對象，探討積雪草酸對結(jié)腸癌細胞遷移及侵襲能力的影響，并基于Wnt/β-catenin 信號通路初步探討其作用機制，為積雪草酸用于結(jié)腸癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株 人結(jié)腸癌HCT116 與SW480 細胞購自美國ATCC 細胞庫，用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2、相對濕度95%的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物 積雪草酸（批號JXCS20200603） 購自南京春秋生物工程有限公司； 胎牛血清 （ 貨號SH30084.02）、RPMI 1640 培養(yǎng)基（貨號SH30809.01B） 購自美國HyClone 公司； CCK-8 試劑（貨號CA1210） 購自北京索萊寶科技有限公司； 二甲基亞砜 （DMSO，貨號276855）、Wnt/β-catenin 信號通路激動劑 LiCl （貨號L9650） 購自美國Sigma 公司； Giemsa 染液（貨號C0133）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； Transwell 小室（貨號3422a） 購自美國Corning 公司； Matrigel 基質(zhì)膠 （貨號356234） 購自美國BD 公司； SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（貨號BL502B）、4% 多聚甲醛（貨號BL539A） 購自合肥白鯊生物科技有限公司； NC 膜（貨號HF13502S25） 購自美國Millipore 公司； 波形蛋白（Vimentin，貨號5741T）、β-連環(huán)蛋白 （β-catenin，貨號 8480T）、c-myc （貨號18583S）、細胞周期蛋白1 （cyclin D1，貨號55506T）、存活蛋白（survivin，貨號2808T）、HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體（批號32935S） 購自美國Cell Signaling Technology 公司；肌動蛋白抗體（β-actin，貨號BS6007M） 抗體購自美國Bioworld 公司； 神經(jīng)性鈣粘附蛋白 （N-Cadherin，貨號A19083）、Snail （貨號A5243）、上皮性鈣粘附蛋白 （ECadherin，貨號A3044）、基質(zhì)金屬蛋白酶2 （MMP2，貨號A11144）、基質(zhì)金屬蛋白酶9 （MMP9，貨號A0289） 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 儀器 TS100 型倒置顯微鏡（日本尼康公司）； 細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）； MINI-4 小型垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（北京凱元信瑞儀器有限公司）； iMark酶標儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 藥物配制 精密稱取積雪草酸適量溶于無菌DMSO中，配制成積雪草酸溶液（母液20 mmol/L，-20 ℃保存），給藥時以培養(yǎng)基稀釋至實驗所需劑量； 精密稱量LiCl溶于無菌培養(yǎng)基中，給藥劑量為20 mmol/L。

2.2 CCK-8 法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期細胞，每孔5 000 個接種于96 孔板，約70% ～80% 細胞貼壁后加入含0.1%DMSO （對照組） 及10、20、30、40、50、60 μmol/L積雪草酸溶液的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清） 分別處理24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育2 h，于450 nm 波長處檢測光密度（OD）值，計算細胞存活率。

2.3 細胞形態(tài)觀察 收集對數(shù)生長期細胞均勻接種于6 孔板中，貼壁后設(shè)置積雪草酸低、中、高劑量組（10、20、30 μmol/L），另設(shè)置對照組給予含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 收集對數(shù)生長期細胞均勻接種于6 孔板中，按“2.3” 項下方法進行分組給藥。使用無菌槍頭垂直劃線，PBS 洗滌2 次后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別于0、48 h 觀察并拍照，計算細胞劃痕愈合率，公式為細胞劃痕愈合率＝ ［（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積） /0 h劃痕面積］ ×100%。

2.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移、侵襲能力 收集對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化后使用無FBS 培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后接種于小室上層，每孔200 μL （細胞密度為2.5×105/mL），小室下層加入600 μL 含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，按“2.3” 項下方法進行分組給藥。48 h 后棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3次，Giemsa 染液染色30 min，PBS 洗滌3 次，擦去小室上層細胞。隨機選擇3 個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。侵襲實驗則用無血清培養(yǎng)基按1 ∶10 比例稀釋Matrigel 膠，并將其均勻平鋪在Transwell 小室上層（每孔50 μL），培養(yǎng)箱水化2 h后，其余步驟同遷移實驗。

2.6 Western blot 法檢測細胞 MMP-9、MMP-2、Ncadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表達 收集對數(shù)生長期細胞，均勻接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞融合率達70% ～80% 后，按“2.3” 項下方法進行分組給藥，作用24 h 后，收集各組細胞，提取總蛋白。使用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液封閉30 min，TBST 洗膜3 次，每次5 min，一抗（1 ∶1 000） 4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜3次，每次5 min，二抗（1 ∶10 000） 孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次5 min，ECL 化學發(fā)光法顯影，Image J 軟件分析蛋白灰度值，β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達。

2.7 Wnt/β-cantenin 通路在積雪草酸調(diào)控結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲中的作用 收集對數(shù)生長期HCT116 細胞，均勻接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，設(shè)置對照組（0.1% DMSO）、積雪草酸組（20 μmol/L）、積雪草酸+LiCl 組（積雪草酸20 μmol/L，LiCl 20 mmol/L），Transwell 遷移、侵襲實驗步驟同“2.5” 項，Western blot 實驗步驟同“2.6” 項。

2.8 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞存活率的影響 與對照組比較，給藥劑量高于20 μmol/L 時，積雪草酸對HCT116、SW480 細胞的增殖均具有抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），且隨著給藥劑量的增加，增殖抑制效果增強。積雪草酸處理HCT116 與SW480 細胞24 h 后的IC50值分別為45.34、34.97 μmol/L，故選擇10、20、30 μmol/L 劑量進行后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞存活率的影響（±s，n＝3）

3.2 積雪草酸對SW480 和HCT116 細胞形態(tài)的影響 對照組SW480、HCT116 細胞呈梭形，細胞觸角明顯； 積雪草酸各劑量組SW480、HCT116 細胞隨著藥物劑量逐漸增加，部分細胞觸角變短，形狀逐漸規(guī)則，細胞失去間質(zhì)型細胞形態(tài)特征，呈現(xiàn)上皮型細胞形態(tài)特征，見圖2。提示積雪草酸對SW480 和HCT116 細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程產(chǎn)生抑制作用。

圖2 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞形態(tài)的影響（×100）

3.3 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞遷移能力的影響與對照組比較，積雪草酸各劑量組SW480、HCT116 細胞劃痕愈合率降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖3。與對照組比較，積雪草酸各劑量組SW480 與HCT116 細胞遷移率降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖4。提示積雪草酸能夠有效抑制SW480、HCT116 細胞的遷移。

圖3 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞劃痕愈合能力的影響（×40，±s，n＝3）

圖4 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞遷移能力的影響（×100，±s，n＝3）

3.4 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞侵襲能力的影響與對照組比較，積雪草酸各劑量組SW480、HCT116 細胞侵襲率降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖5。提示積雪草酸能降低SW480 和HCT116 細胞侵襲能力。

圖5 積雪草酸對HCT116 和SW480 細胞侵襲能力的影響（×100，±s，n＝3）

3.5 積雪草酸對 HCT116 細胞 MMP-9、MMP-2、Ncadherin、Vimentin、Snail 蛋白表達的影響 根據(jù)細胞劃痕與Transwell 遷移及侵襲實驗結(jié)果，積雪草酸對HCT116 細胞的體外轉(zhuǎn)移抑制效率較高，故選擇其進行蛋白表達驗證。與對照組比較，積雪草酸各劑量組HCT116 細胞MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Vimentin、Snail 蛋白表達降低 （P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin 蛋白表達升高（P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖6。

圖6 積雪草酸對HCT116 細胞MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Vimentin、Snail 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.6 積雪草酸對HCT116 細胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表達的影響 與對照組比較，積雪草酸各劑量組HCT116 細胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈劑量依賴性，見圖7。

圖7 積雪草酸對HCT116 細胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.7 Wnt/β-cantenin 通路在積雪草酸調(diào)控結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲中的作用 與積雪草酸組比較，LiCl+積雪草酸組HCT116 細胞遷移、侵襲率升高（P＜0.05，P＜0.01），Ncadherin、β-catenin 蛋白表達升高 （P＜0.01），E-cadherin蛋白表達降低（P＜0.01），見圖8。提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號通路激動劑LiCl 處理可逆轉(zhuǎn)積雪草酸對結(jié)腸癌細胞遷移與侵襲的抑制作用。

圖8 LiCl 逆轉(zhuǎn)積雪草酸對HCT116 細胞遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響（×100，±s，n＝3）

4 討論

結(jié)直腸癌是目前發(fā)病率較高的臨床惡性腫瘤，預(yù)計到2030 年全球負擔將增加60%［6］。伴有遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的5 年生存率較低，50%的轉(zhuǎn)移患者會在5 年內(nèi)復發(fā)并死亡［7-8］，并且?guī)缀跛械慕Y(jié)直腸癌患者都會產(chǎn)生化療藥物的耐藥性，限制其療效，最終導致治療失?。?-10］。因此，為改善結(jié)直腸癌患者的臨床治療效果及提升預(yù)后，開發(fā)安全有效的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床新藥物勢在必行，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化已被報道為上皮細胞來源的腫瘤細胞遷移和侵襲的重要生物學過程［11］。

研究證實，積雪草酸對多種腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移具有抑制作用。積雪草酸可以促進乳腺癌細胞凋亡與細胞周期阻滯，有效抑制人乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 的生長，還能夠通過PI3K/Akt 信號通路抑制WAVE3 的激活，從而抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231 的侵襲［12］。積雪草酸通過介導線粒體損傷促進肺癌細胞的凋亡，并抑制TGF-β1 誘導的肺癌A549 細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［13-14］。積雪草酸還可以誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活Grp78/IRE1α/JNK 和Calpain 通路抑制舌癌的生長［15］。同時，也有研究初步證實積雪草酸對結(jié)腸癌細胞遷移具有抑制作用［16］。本研究深入探討了積雪草酸抑制結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及其機制。

金屬基質(zhì)蛋白酶（MMPs） 家族能夠降解細胞外基質(zhì)中各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，與腫瘤的轉(zhuǎn)移與浸潤高度相關(guān)，在人類結(jié)腸癌中MMP-2 與MMP-9均過量表達［17-18］。MMP-9 和MMP-2 的高表達會減弱基底膜的屏障作用，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲［19］。本研究通過劃痕愈合與Transwell 遷移及侵襲實驗證實積雪草酸對HCT116 與SW480 細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，并通過Western blot 結(jié)果證實積雪草酸可抑制結(jié)腸癌HCT116 細胞的MMP-9、MMP-2 表達，并劑量依賴性地抑制間質(zhì)指標N-cadherin、Vimentin、Snail 表達，促進上皮指標E-cadherin 表達，從而抑制細胞EMT 進程。

Wnt/β-catenin 信號通路主要由細胞外因子（Wnt）、跨膜受體卷曲蛋白、β-catenin 和T 細胞因子等組成，已被證實在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中出現(xiàn)過度激活，這一異常激活增加Snail 的轉(zhuǎn)錄，并抑制E-cadherin，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導致腫瘤侵襲性增加［15］。且Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活可調(diào)控其下游靶基因cyclinD1、c-myc 和survivin，進一步促進結(jié)直腸癌的發(fā)生、增殖、遷移和侵襲［17，20］。本研究顯示，積雪草酸可有效抑制結(jié)腸癌HCT116 細胞Wnt/βcatenin 信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-myc、cyclin D1 和survivin 的表達，抑制效果呈劑量依賴性，且Wnt/β-catenin信號通路激動劑可逆轉(zhuǎn)積雪草酸對結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲及EMT 相關(guān)蛋白與β-catenin 蛋白表達的作用。

綜上所述，積雪草酸能夠抑制結(jié)腸癌細胞HCT116 與SW480 的遷移、侵襲及EMT 進程，且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，而這一作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號通路活化有關(guān)。