姚 晨，趙慶林，張生潭，賈睿琦，黃東杰，宋忠強(qiáng)，韓 旭，武紅娜*

（1.滄州市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 滄州 061000； 2.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000）

腰息痛膠囊為中西藥復(fù)方制劑，由白芷、獨(dú)活、三七、威靈仙等22 味中藥和對(duì)乙酰氨基酚組成，具有舒筋通絡(luò)、散寒除濕、補(bǔ)腎益肝等功效［1-2］，方中獨(dú)活指標(biāo)成分為蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯，三七指標(biāo)成分為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1，共為臣藥，具有活血散淤、舒筋活絡(luò)的作用； 威靈仙指標(biāo)成分齊墩果酸具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛功效，也與該制劑功能主治相吻合［3-8］。目前，腰息痛膠囊標(biāo)準(zhǔn)中只有理化鑒別、常規(guī)檢查項(xiàng)、對(duì)乙酰氨基酚含量測(cè)定，相關(guān)研究也大多是圍繞歐前胡素、對(duì)乙酰氨基酚，鮮有涉及其他成分［9-10］，亟待修訂和提高以更全面控制該制劑質(zhì)量，為其臨床應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

中成藥所含成分復(fù)雜多樣，為了全面控制其有效性和安全性，一測(cè)多評(píng)法正成為相關(guān)質(zhì)量控制的研究熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)［11］，它是以內(nèi)標(biāo)法對(duì)1 種指標(biāo)成分定量后實(shí)現(xiàn)對(duì)其他指標(biāo)成分定量的方法［12-14］，檢測(cè)成本低，可較全面地反映制劑內(nèi)在質(zhì)量。因此，本實(shí)驗(yàn)建立該方法同時(shí)測(cè)定腰息痛膠囊中三七皂苷R1、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、齊墩果酸的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 LC-2040C 3D 型高效液相色譜儀、LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）； CP225D 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）； LC350A 型超聲波處理器（山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司）； Advantage A10 型超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 三七皂苷R1（批號(hào)110745-201921，純度90.4%）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（批號(hào)111583-202006，純度98.9%）、人參皂苷Rb1（批號(hào)110704-202230，純度95.1%）、人參皂苷 Rg1（ 批號(hào) 110703-202235，純度98.5%）、蛇床子素（批號(hào)110822-202111，純度99.7%）、齊墩果酸（批號(hào)110709-202109，純度95.8%） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)默克公司）； 正丁醇、磷酸為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）； 水為超純水（自制）。腰息痛膠囊共10 批，具體見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Venusil MP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表2； 體積流量0.8 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取對(duì)照品適量，甲醇制成分別含三七皂苷R10.202 4 mg/mL、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯0.086 41 mg/mL、蛇床子素0.102 1 mg/mL、人參皂苷Rb10.207 4 mg/mL、人參皂苷Rg10.202 2 mg/mL、齊墩果酸0.063 51 mg/mL 的溶液，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物約2 g，精密稱(chēng)定，精密加入50 mL 甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方工藝，分別制成缺三七、缺獨(dú)活、缺威靈仙的陰性樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密量取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品溶液中各成分色譜峰的出峰時(shí)間、順序與對(duì)照品溶液中的一致，陰性無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，甲醇制成系列質(zhì)量濃度，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得三七皂苷R1、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、齊墩果酸峰面積 RSD 分別為0.6%、1.3%、1.1%、1.8%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份本品（批號(hào)211108） 適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得三七皂苷R1、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、齊墩果酸峰面積RSD分別為0.9%、0.8%、1.4%、1.1%、1.2%、1.5%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)211108） 6 份，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得三七皂苷R1、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、齊墩果酸峰含量RSD 分別為0.7%、1.2%、0.9%、1.4%、1.1%、1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品（批號(hào)211108） 6 份，每份約1 g，加入等量對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，三七皂苷R1、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、齊墩果酸平均加樣回收率分別為97.8% （RSD ＝0.8%）、98.7%（RSD ＝1.4%）、99.1% （RSD ＝0.7%）、99.8% （RSD ＝1.1%）、98.6% （RSD ＝0.9%）、99.3% （RSD ＝1.2%）。

2.3.7 相對(duì)校正因子計(jì)算 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以人參皂苷Rg1為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他5 種成分的相對(duì)校正因子fk/s，公式［16-17］為fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） / （CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分相對(duì)校正因子

2.4 耐用性考察

2.4.1 儀器、色譜柱 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察LC-2040C 3D、LC-30A 色譜儀及Venusil MP C18、Diamonsil C18、Thermo C18色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表5，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜2.0%）。

表5 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.4.2 色譜峰定位 本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)保留時(shí)間法測(cè)定各成分在“2.4.1” 項(xiàng)儀器、色譜柱下的相對(duì)保留值ri/s，公式為ri/s＝tRi/tRs，結(jié)果見(jiàn)表6，可知均無(wú)明顯影響 （RSD＜2.0%）。

表6 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響

2.5 樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取10 批樣品，每批3 份，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表7，可知2 種方法所得結(jié)果接近 ［相對(duì)誤差（RE） ＜1%］。

表7 各成分含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n＝3）

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)成分選擇 現(xiàn)代藥理研究表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等成分具有散瘀止血、消腫定痛、抗炎抗菌等作用［15-16］，與腰息痛膠囊功能主治相符。其中，三七皂苷R1出峰位置位于上述6 種成分的第3 位，結(jié)合該成分色譜峰峰面積、含量、價(jià)格、易得程度等因素，本實(shí)驗(yàn)以其為內(nèi)標(biāo)。

3.2 提取溶劑選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了50% 甲醇、甲醇（含2%磷酸）、甲醇、水飽和正丁醇、70% 乙醇對(duì)各成分提取能力的影響，發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1以水飽和正丁醇、甲醇提取時(shí)較完全，并且齊墩果酸以甲醇提取時(shí)溶解性較好，考慮到操作簡(jiǎn)便性，最終以甲醇為提取溶劑。

4 結(jié)論

目前，關(guān)于一測(cè)多評(píng)法的報(bào)道大多為單一藥味中單一種類(lèi)成分的含量測(cè)定［17-21］，而本實(shí)驗(yàn)所建立的方法可同時(shí)測(cè)定腰息痛膠囊中三七皂苷R1、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、齊墩果酸的含量，并且其重復(fù)性、精密度、耐用性良好，檢測(cè)結(jié)果與外標(biāo)法一致，同時(shí)在擁有部分成分對(duì)照品的情況下能排除其他成分的干擾，不僅降低了成本，還具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的優(yōu)點(diǎn)，為該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了技術(shù)支撐，也為其他中西藥復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了參考。