王嫩寒 趙琰楓 田麗麗 陳雙雙 陳昊 任怡宣 李傳友 代小偉

北京市疾病預防控制中心結核病實驗室（北京 100035）

異煙肼是重要的抗結核藥物［1］。目前，由于沒有耐受性良好的抗結核藥物出現(xiàn)，異煙肼仍作為重要的一線抗結核藥物在使用［2］。異煙肼被結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）的過氧化氫-過氧化物酶KatG過氧化活化為異煙堿?；杂苫梢耘c烯?；€原酶-NAD復合體（MTB細胞壁的主要成分——分枝菌酸的生化合成途徑中的關鍵成分）相結合，從而抑制其活性，最終通過影響MTB細胞壁的正常合成途徑，使MTB喪失增殖等功能而達到抑菌的目的［3-4］。2018年，WHO的一份研究報道，據(jù)估計，全世界約8%的結核病患者為異煙肼耐藥結核?。?］。2020年，全球結核病報告中指出，在活動性肺結核患者中，異煙肼耐藥肺結核占15%，需盡快發(fā)現(xiàn)這部分患者，并選擇合適的替代治療方案［6］。然而，異煙肼耐藥比單利福平耐藥更常見，并可能嚴重影響抗結核治療［7］。

傳統(tǒng)的藥敏試驗建立在患者標本培養(yǎng)陽性的基礎上，耗時長，易延誤治療。近年來，利用分子生物學方法檢測耐藥的技術迅速發(fā)展，但大多選擇菌株進行檢測，時效性較差。若能直接檢測患者標本，則能及時得到藥敏結果，為患者制定個體化治療方案贏取寶貴時間。本研究應用MeltPro技術對痰標本直接進行MTB異煙肼耐藥檢測，評價該方法直接對肺結核患者痰標本進行MTB異煙肼耐藥篩查的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病預防控制中心結核病門診就診的初治肺結核患者痰標本，納入標準：（1）GeneXpert MTB/RIF檢測結果MTB陽性；（2）痰標本量＞ 3 mL。對收集到的痰標本進行涂片鏡檢及分枝桿菌分離培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株進行異煙肼比例法藥敏檢測；用MeltPro技術及Hain試驗對痰標本直接進行MTB異煙肼耐藥檢測。

1.2 檢測方法

1.2.1 涂片鏡檢按照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》［8］，選取適量痰標本進行涂片，隨后進行萋-尼氏抗酸染色（染液由珠海貝索生物技術有限公司生產），100倍油鏡下進行檢測。對檢測結果進行分級，即“陰性”、“1 ～ 8條/300視野”、“1+”、“2+”、“3+”、“4+”。

1.2.2 分枝桿菌分離培養(yǎng)按照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》，吸取1 nL痰標本放入前處理管中，加入1 ～ 2倍體積4% NaOH，旋緊處理管螺旋蓋，震蕩混勻，使痰標本充分液化，室溫下靜置15 min后，均勻接種于酸性羅氏培養(yǎng)基（河南賽諾特生物技術有限公司生產）上，每支0.1 ～ 0.15 mL，旋緊螺旋蓋，在（36 ± 1）℃孵育，直至長出可視菌落，記錄生長情況。培養(yǎng)8周無菌落生長者報告“陰性”。

1.2.3 結核分枝桿菌比例法藥敏試驗參照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》的結核分枝桿菌固體藥敏試驗操作，使用細菌超聲分散計數(shù)儀BAC spreader 1100C（廣東希格生物科技有限公司）、中性羅氏培養(yǎng)基、含藥培養(yǎng)基（異煙肼，0.2 μg/nL），對培養(yǎng)陽性菌株進行異煙肼比例法藥敏試驗，同時用對硝基苯甲酸/噻吩-2羥酸肼（PNB/TCH）培養(yǎng)基鑒定是否為結核分枝桿菌。所用培養(yǎng)基均由河南賽諾特生物技術有限公司生產。TCH培養(yǎng)基上有菌落生長，PNB培養(yǎng)基上無菌落生長者為結核分枝桿菌；PNB培養(yǎng)基上有菌落生長，TCH培養(yǎng)基上無菌落生長者為非結核分枝桿菌。耐藥百分比（%）=含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)×100%。若耐藥百分比＞ 1%，則認為受試菌對該藥耐藥。

1.2.4 MeltPro技術耐藥檢測使用廈門致善生物科技股份有限公司生產的結核分枝桿菌耐藥試劑盒，以及SLAN-96S Real-Time PCR System（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）進行MTB異煙肼耐藥檢測及結果分析。吸取1 mL痰標本加入到50 mL圓底離心管內，再加入1 ～ 2 mL前處理液（NALC-NaOH），室溫下震蕩混勻15 min，加入40 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中和離心（3 000 ×g離心18 min），棄上清，加1 mL的PBS進行重懸沉淀，10 000 ×g離心1 min，棄上清。在沉淀中加入300 μL試劑盒中提供的TB-DNA提取液，90 ℃加熱10 min，10 000 ×g離心1 min，吸取上清液，得到結核分枝桿菌DNA。按說明書要求配置PCR反應液，在20 μL反應液中加入5 μL結核分枝桿菌DNA，使用SLAN-96S Real-Time PCR System進行MTB異煙肼的耐藥檢測及結果分析，反應程序參照說明書。通過比較所檢測樣本與陽性對照樣本之間熔解曲線熔點（Tm）值的差異判斷樣本是否發(fā)生突變：樣本的熔點與陽性對照的熔點一致，誤差不超過1 ℃時，判定為野生型，待檢樣本對所檢測藥物敏感；樣本的熔點低于陽性對照2 ℃及以上時（ΔTm≥ 2 ℃），判定為突變型，待檢樣本對所測藥物耐藥。若結果為結核分枝桿菌未檢出或耐藥不明確，則檢測不成功，需重復檢測。

1.2.5 Hain試驗用德國海因生命科學有限公司生產的結核分枝桿菌復合群及耐藥基因突變檢測試劑盒（PCR-線性雜交酶顯色法）試劑盒以及生物梅里埃公司的GT-Biot48結核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)進行Hain試驗。將方法4中提取的結核分枝桿菌DNA 5 μL加入45 μL擴增混合物中，按照說明書的擴增程序進行擴增。擴增完成后取20 μL擴增產物進行雜交，雜交過程包括化學變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結果進行耐藥情況的判讀。判讀標準：所有野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時為敏感；野生條帶缺失不顯色或突變條帶顯色為耐藥。

1.2.6 GeneXpert MTB/RIF檢測GeneXpert MTB/RIF檢測儀及試劑盒由美國賽沛公司生產。按照GeneXpert MTB/RIF檢測說明書要求操作，取1 nL痰標本置于螺旋蓋前處理管中，加入2倍體積的檢測樣品試劑，旋緊前處理管，室溫下振蕩混勻15 min，使痰標本充分液化，打開檢測匣，取2 mL處理后的樣品，由加樣孔緩慢加入檢測匣中，放置到檢測模塊，儀器開始自動化檢測。該技術針對rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設計引物和探針，檢測其是否發(fā)生突變，用于輔助診斷是否為結核分枝桿菌，以及是否對利福平耐藥?；跇颖局蠱TB的Ct值，MTB結果以高、中、低和極低顯示，Ct值 ＜ 16為MTB含量高，Ct值在16 ～22之間為MTB含量中等，Ct值在22 ～ 28之間為MTB含量低，Ct值 ＞ 28為MTB含量極低。

1.3 質量控制按照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》相關規(guī)定，完成涂片鏡檢及分枝桿菌分離培養(yǎng)的質量評估，項目質量合格。藥敏試驗所用培養(yǎng)基均用標準菌株H37Rv進行含藥培養(yǎng)基質量控制。實驗室每年參加中國疾病預防控制中心結核病參比實驗室組織的藥敏試驗熟練度測試，成績優(yōu)秀。MeltPro技術耐藥性檢測選用含有相應野生型靶擴增基因的質粒作為陽性對照，既完成了結果的判讀，又保證了檢測的質量。每次Hain試驗都用標準菌株H37Rv與其他標本一起完成檢測。每個測試條都包含5個質控條帶：（1）標記物質控帶：用于確認探針試紙條上的標記物結合情況及正確的顯色反應；（2）擴增質控帶：用于確認PCR擴增反應是否成功；（3）3個基因位點質控帶，用于確認每個基因位點反應的最佳敏感度。GeneXpert MTB/RIF檢測每個檢測匣包括樣本處理質控（SPC），確保樣品經過正確處理；以及探針檢查質控（PCC），保證探針檢查合格。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料呈偏態(tài)分布時以［M（Q1，Q3）］描述，計數(shù)資料以“例數(shù)”和“百分率/構成比（%）”描述，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法及Kruskal-Wallis H檢驗進行組間差異的比較，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。以比例法藥敏結果為參考標準，計算MeltPro技術檢測異煙肼的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和Kappa值。Kappa值用于一致性檢測，0 ～ 0.2為一致性極低，0.21 ～ 0.4為一致性一般，0.41 ～ 0.60為中等一致，0.61 ～ 0.80為基本一致，0.81 ～ 1.00為幾乎完全一致。

2 結果

2.1 一般情況本研究共收集157例MTB陽性痰標本，其中男115（73.2%）例，女42（26.8%）例。年齡范圍16 ～ 88歲，年齡中位數(shù)（四分位）為46（31，64）歲。157例MTB陽性的痰標本，經分枝桿菌分離培養(yǎng)，獲得陽性菌株130株，培養(yǎng)陽性率為82.8%（130/157）。培養(yǎng)陰性19例，污染8例。污染率為5.1%（8/157）。130株陽性菌株均進行了比例法異煙肼藥敏試驗。用MeltPro技術進行異煙肼耐藥篩查，檢測成功132例，失敗25例，檢測成功率為84.1%（132/157）。Hain試驗異煙肼耐藥檢測成功125例，失敗32例，檢測成功率為79.6%（125/157）。同時有MeltPro技術異煙肼耐藥檢測和比例法藥敏試驗結果的115例；同時有Hain試驗異煙肼耐藥檢測和比例法藥敏試驗結果的109例。在27例培養(yǎng)陰性的標本中，MeltPro技術檢測MTB異煙肼耐藥基因突變9例，敏感8例，檢測不成功10例。見圖1。

圖1 標本檢測情況Fig.1 Sample testing process

2.2 痰標本荷菌量對MeltPro技術耐藥檢測的影響157例MTB陽性的痰標本中，MeltPro技術異煙肼耐藥檢測成功的比例隨著痰涂片結果等級的升高而升高，各等級間差異有統(tǒng)計學意義（H=24.169，P= 0.000）。見表1。檢測成功率也隨著GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌等級的升高而升高，各等級間差異有統(tǒng)計學意義（H= 27.763，P= 0.000），見表2。

表1 痰涂片不同等級與MeltPro技術異煙肼耐藥檢測成功的關系Tab.1 The relationship between different grades of sputum smear and the success of Isoniazid resistance detection by MeltPro technique例（%）

表2 GeneXpert MTB/RIF檢測MTB不同等級與MeltPro技術異煙肼耐藥檢測的關系Tab.2 The relationship between the different grades of MTB detected by GeneXpert MTB/RIF and the detection of Isoniazid resistance by MeltPro technique例（%）

2.3 MeltPro技術異煙肼耐藥基因突變的檢測效能MeltPro技術的異煙肼耐藥檢出率為22.0%（29/132），Hain試驗的異煙肼耐藥檢出率為15.3%（19/124），比例法的異煙肼耐藥檢出率為14.6%（19/130），三者差異無統(tǒng)計學意義（χ2= 2.997，P= 0.223）。

以比例法藥敏試驗結果為金標，MeltPro技術檢測異煙肼耐藥的靈敏度為84.6%（11/13），特異度為91.2%（93/102），陽性預測值為55%（11/20），陰性預測值為97.9%（93/95），MeltPro技術檢測異煙肼耐藥與比例法藥敏試驗結果一致性Kappa值0.614，為基本一致。見表3。

表3 MeltPro技術和Hain 試驗檢測異煙肼耐藥性的效能Tab.3 Efficacy of MeltPro technique and Hain test in detecting Isoniazid resistance

2.4 異煙肼耐藥基因突變情況157例（份）標本中，MeltPro技術檢測異煙肼耐藥基因突變29例，Hain試驗檢測異煙肼耐藥基因突變19例，具體突變位點見表4。異煙肼耐藥基因突變而比例法藥敏結果敏感的12例，耐藥基因無突變而比例法藥敏結果耐藥的7例。

表4 異煙肼耐藥突變位點及藥敏試驗結果Tab.4 Isoniazid resistance mutation site and drug sensitivity test results

3 討論

表型藥敏試驗包括固體藥敏和液體藥敏（MGIT960藥敏試驗和優(yōu)化肉湯微孔板法藥敏試驗）。固體藥敏試驗需4周以上得到藥敏結果，液體藥敏試驗也需要7 ～ 21 d才能得到結果，耗時均較長［9］。MeltPro技術是一種快速檢測耐藥基因突變的方法，檢測利福平和異煙肼耐藥的試劑平均成本約200元/人份，耗時約3 h。大大縮短了檢測時間。2008年，WHO推薦使用第一代線性探針技術進行快速耐多藥診斷［10］。Hain試驗可同時檢測異煙肼和利福平耐藥情況，試劑平均成本約230元/人份，檢測時長約6 h。與之相比，MeltPro技術可同時檢測異煙肼、利福平、氟喹諾酮類藥物、鏈霉素及乙胺丁醇的耐藥情況，能更快篩查出MDR-TB及Pre-XDR-TB。為臨床醫(yī)生因人施治提供依據(jù)。

本研究選用157例MTB陽性的痰標本進行MeltPro耐藥檢測，涂片陰性痰標本檢測成功率64.8%，涂片1 ～ 8條/300視野痰標本檢測成功率89.5%，涂片“1+”痰標本檢測成功率89.7%，涂片“2+”痰標本檢測成功率96.9%，涂片“3+”及“4+”痰標本檢測成功率均100%，隨著涂片陽性等級升高，檢測成功的比例相應升高。涂片陽性痰標本檢測成功率較高，能獲得可靠的耐藥信息。與趙國連等［11］報告的結果基本一致。因此MeltPro技術可以直接用于痰標本的耐藥檢測。該比例也隨GeneXpert MTB/RIF檢測MTB等級的升高而升高。結核分枝桿菌陽性等級達到“中”和“高”時，檢測成功率分別為95.8%和96.4%。本實驗采用粗提法從痰標本中提取結核分枝桿菌DNA，操作簡便快捷，適用于基層實驗室。但粗提法提取效能有限，不能保證DNA純度及濃度，可能會干擾耐藥檢測結果［12］。另外，病原學檢測結果的敏感性與痰標本質量密切相關［13］，若能提高痰標本質量，勢必能提高MeltPro技術的檢測效能。

在本研究中，MeltPro技術檢測異煙肼靈敏度為84.6%，特異度91.2%，敏感度高于劉春平等［14］報道的數(shù)據(jù)，特異度稍低（72.9%，100%）；與Hain試驗相比較，敏感度較高，特異度稍低（55.6%，92.3%）；與比例法藥敏試驗結果一致性比較，kappa0.614，為基本一致。

本研究中，在27例MTB陽性但培養(yǎng)陰性、無法進行傳統(tǒng)藥敏試驗的標本中，MeltPro技術檢測MTB異煙肼耐藥基因突變9例，敏感8例，檢測不成功10例。提示MeltPro技術對痰標本直接進行檢測，可為培養(yǎng)陰性結核病患者提供耐藥篩查結果，彌補了因無陽性菌株造成藥敏結果缺失的不足。

本研究中，有些標本的分子耐藥檢測與比例法藥敏結果不一致，均已進行了重復實驗。MeltPro技術檢測異煙肼耐藥與表型藥敏試驗結果有19例不符，其中基因型檢測敏感而表型藥敏耐藥的7例，基因型耐藥突變而表型藥敏敏感12例。造成基因型和表型耐藥結果不符的原因可能有：（1）MeltPro技術檢測的基因突變的區(qū)域位點為ahpC啟動子區(qū)（-40 ～ -30及-15 ～ 3位點），inhA94密碼子，inhA啟動子區(qū)（-17 ～ -8）位點和KatG315密碼子區(qū)。除此之外，已知的異煙肼的耐藥突變位點還有fabGl、kasA、iniA/B/C、ndh、fadE、furA、Rvl592c和Rvl772及其啟動子區(qū)等［15］。在KHAN等［16］的研究中，最常見的異煙肼突變位點為katG S315T，其次為fabG1-15C＞T（inhA啟動子）和inhA-154G＞A。另外，CHEN等［17］對WHO提供的耐藥MTB菌株的數(shù)據(jù)進行了研究，發(fā)現(xiàn)雖然91%的異煙肼耐藥菌株存在已知的耐藥位點基因突變，仍有9%的耐藥菌株存在未知的突變位點。所以，造成本研究中出現(xiàn)7例樣本基因型敏感而表型藥敏結果耐藥的原因可能為存在該方法涵蓋的突變位點之外的耐藥基因突變。（2）根據(jù)說明書中的陳述，MeltPro技術檢測異煙肼耐藥野生型的檢測限為2 × 103菌/nL，突變型檢測限為104菌/nL。本研究采用粗提法提取MTB的DNA，提取效能有限，可能造成核酸濃度低于該方法的檢測限，未能檢測到突變位點的存在，導致表型藥敏試驗結果耐藥而基因型檢測結果為敏感。（3）抗菌藥物折點是用來判斷病原菌對藥物敏感、中介或耐藥的MIC值［18］，多年來，抗結核藥物的折點幾經修訂，目前，中國和WHO推薦的異煙肼表型耐藥的折點為0.2 μg/mL，CLSI的推薦標準為0.25/1.0 μg/mL。一些耐藥相關基因會產生低水平耐藥［19］，本研究采用比例法藥敏檢測為標準，異煙肼耐藥培養(yǎng)基只有一個藥物濃度，可能導致表型耐藥而基因型檢測敏感。（4）若患者存在敏感菌和耐藥菌的混合感染，通常在培養(yǎng)過程中，敏感菌生長優(yōu)于耐藥菌，導致培養(yǎng)物中耐藥菌的比例下降，出現(xiàn)表型結果假陰性［20］。后續(xù)可對菌株進行MeltPro技術耐藥篩查，探討異質性耐藥對分子耐藥檢測和表型藥敏結果的影響。（5）本研究中，基因型耐藥突變而表型藥敏敏感的比例為9.23%（12/130），龔蘭等［21］研究發(fā)現(xiàn)，9.79%的異煙肼敏感結核分枝桿菌株發(fā)生的katG、inhA基因突變，研究結果基本一致。本研究采用粗提法提取MTB的DNA，若能提高痰標本質量，并對粗提DNA進行純化或采用提取效能高的方法或儀器進行核酸的提取，可極大提高MeltPro技術的檢測成功率。再者，對表型藥敏試驗與分子耐藥結果不符合的標本，應進一步行全基因組測序等檢測，分析不一致的原因；本研究受經費和課題時間的限制，耐藥標本收集數(shù)量有限，在后續(xù)條件允許的情況下，將收集更多耐藥痰標本進行深入研究。

總體來說，對GeneXpert MTB/RIF檢測為MTB的肺結核患者，直接使用MeltPro技術對痰標本進行異煙肼耐藥篩查具有靈敏度高，特異性強，操作簡便等特點，可縮短檢測時間，為臨床提供快速準確的耐藥結果。同時，MeltPro技術對DNA的濃度及純度有較高要求，若能保證DNA濃度及純度，可以極大提高檢測的成功率。