曹春霞，姚經(jīng)武，黃大野，王蓓蓓，鄭嬌莉，楊 丹

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

核桃（Juglans regia）炭疽病是核桃生長(zhǎng)過(guò)程中的重要真菌病害，可危害其葉片、果實(shí)、芽、花苞和嫩梢，引起葉斑、落葉、花腐、果腐和枝梢枯死，嚴(yán)重制約著核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，影響農(nóng)民收益［1］。其病原菌主要有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）［2，3］、果生刺盤(pán)孢菌（Colletotrichum fructicola）［4］、核桃盤(pán)二孢菌（Marssonina juglandis）［5］、暹羅刺盤(pán)孢菌（Colletotrichum siamense）［6，7］和尖孢刺盤(pán)孢復(fù)合種（Colletotrichum acutatum）［8］。湖北省鄖西縣核桃炭疽病大發(fā)生，但病原種類(lèi)尚不明確。

本研究以2022 年鄖西縣棋盤(pán)山核桃基地中的病葉為材料，旨在以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，結(jié)合分子生物學(xué)（ITS和看家基因）對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，以期明確該地區(qū)核桃炭疽病的病原種類(lèi)，為該病害的后續(xù)研究和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核桃炭疽病的感病葉片以及健康葉片、果實(shí)于2022 年采自鄖西縣棋盤(pán)山核桃基地。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L。

E.Z.N.A.Fungal DNA Mini Kit、TaKaRa PCR Mix RR901A、武漢瑞華光照培養(yǎng)箱、哈東聯(lián)超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、BIO-RAD C1000 Touch Thermal Cycler PCR 儀、君意JY300C 電泳儀、OLYMPUS BX43 顯微鏡、ABI 3730XL 測(cè)序儀、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離純化 采用組織分離法［9］。新鮮病葉清洗干凈，將葉片病健交界處組織切成小塊，用75%乙醇消毒3 s，放入5%次氯酸鈉中浸泡3～5 min，無(wú)菌水漂洗3 次，待小塊組織表面晾干，用接種針將組織塊移入PDA 培養(yǎng)基表面，每平板放5 片，培養(yǎng)皿密封后放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待組織邊緣長(zhǎng)出菌絲后，將菌絲塊轉(zhuǎn)接到新的PDA 平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，待純化的菌落產(chǎn)孢后，通過(guò)單孢分離獲得純的病原菌。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將病原菌接種在PDA 平板上，置于25 ℃條件下培養(yǎng)10 d，觀察菌落形態(tài)和顏色；培養(yǎng)15 d 后，用無(wú)菌水將孢子洗脫下來(lái)，三層擦鏡紙過(guò)濾，顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)和大小，并拍照保存。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 收集病原菌菌絲，采用E.Z.N.A.Fungal DNA Mini Kit 提取病原菌DNA，所用引物為ITS和3 對(duì)看家基因［6］（表1）。25 μL PCR 體系為Premix Taq（TaKaRa Taq ?Version 2.0 plus dye）12.5 μL，DNA（40 ng/μL）1 μL，引物F/R（10 μmol/L）各1 μL，滅菌蒸餾水9.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；每個(gè)循環(huán)94 ℃變性30 s；56 ℃退火45 s；72 ℃延伸45 s，共32 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后，凝膠電泳回收擴(kuò)增片段，純化后的DNA 片段送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

表1 擴(kuò)增ITS、ACT、GAPDH 和HIS3 基因序列的引物

1.2.4 致病性鑒定 分別采用菌絲塊和分生孢子液刺傷接種離體核桃葉片和果實(shí)進(jìn)行致病力測(cè)定。在菌絲塊接種試驗(yàn)中，病原菌在PDA 平板上25 ℃培養(yǎng)2～3 d，然后用孔徑6 mm 的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊，接種于核桃葉片和果實(shí)上的刺傷點(diǎn)（菌絲面向下貼緊葉片和果實(shí)表面）。每片葉片接種2 個(gè)菌絲塊，每處理重復(fù)6 片葉片；每個(gè)果實(shí)接種1個(gè)菌絲塊，每處理重復(fù)6 個(gè)果實(shí)。

在分生孢子液接種試驗(yàn)中，首先用無(wú)菌水從培養(yǎng)了15 d 的菌落平板上洗下分生孢子，并用三層擦鏡紙過(guò)濾收集孢子液，離心后PDB 重新懸浮。通過(guò)血球計(jì)數(shù)板將孢子液濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL。在每片待接種的植株葉片刺傷點(diǎn)上放置6 片滅菌的濾紙片（直徑6 mm）。吸取分生孢子液20 μL 滴加在各濾紙片上。每片葉片接種6 個(gè)濾紙片，每處理重復(fù)6 片葉片；每個(gè)果實(shí)滴加20 μL 孢子液，每處理重復(fù)6 個(gè)果實(shí)。

接種完成后，將葉片和果實(shí)置于放有濕潤(rùn)吸水紙的淺盤(pán)中，保鮮膜密封后置于25 ℃和12 h 光照/12 h 黑暗條件下保濕培養(yǎng)，接種發(fā)病后，采用組織分離法分離發(fā)病部位病原菌，鑒定分離到的病原菌性狀是否與原始菌株相同。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將ITS、ACT、GAPDH和HIS3基因的序列合并后，利用ML 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展支持率分析采用1 000 次重復(fù)，并使用稻瘟菌菌株Magnaporthe oryzaPO-FA28 的對(duì)應(yīng)基因序列為外群［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃葉部病害田間癥狀

對(duì)鄖西縣棋盤(pán)山核桃基地的核桃葉部病害進(jìn)行了田間癥狀觀察，發(fā)現(xiàn)炭疽病是其重要病害，主要為害葉片。發(fā)病初期為圓形小斑點(diǎn)，隨后在葉尖及葉緣形成大小不同的褐色病斑，呈不規(guī)則形狀，發(fā)病后期葉部病斑極易碎裂、脫落，形成穿孔癥狀，葉片焦枯脫落。

2.2 病原菌的形態(tài)鑒定

采用組織分離法分離得到真菌菌株NYF2-2，菌株在25 ℃條件下生長(zhǎng)良好，產(chǎn)生白色菌絲，向四周輻射狀生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，慢慢形成圓形菌落，7 d 左右長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，初期菌絲為白色絮狀，菌落邊緣光滑規(guī)則。培養(yǎng)10 d 后，菌落背面可見(jiàn)黃綠色色素沉積（圖1A 和圖1B）；菌株分生孢子是單孢，長(zhǎng)橢圓形，兩端鈍圓，孢子大小為（14.79±1.78）μm×（4.49±0.41）μm（圖1C）。經(jīng)菌落特性和孢子形態(tài)初步確定NYF2-2 屬于刺盤(pán)孢屬（Colletotrichumspp.）真菌。

圖1 菌株NYF2-2 在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（25 ℃，10 d）和分生孢子

2.3 病原菌的分子鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用引物ITS4/ITS5及3 對(duì)看家基因引物對(duì)真菌DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳均可檢測(cè)到單一清晰的條帶，條帶回收后測(cè)序。測(cè)得所有序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 分析，結(jié)果表明，所有序列都與膠孢炭疽菌的同源性最高，均可達(dá)到100%；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，菌株NYF2-2 和4 個(gè)膠孢炭疽菌菌株（C.gloeosporioidesCBS 112999、C.gloeosporioideslq27、C.gloeosporioideslq30 和C.gloeosporioideslq35）聚為同一分支（圖2）。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將病原菌NYF2-2 鑒定為膠孢炭疽菌。

圖2 菌株NYF2-2 基于ITS、ACT、GAPDH 和HIS3 4 個(gè)基因合并序列用NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 病原菌的致病力測(cè)定

菌絲塊接種離體核桃葉片4 d 后病斑明顯，呈黑褐色（圖3B）。菌絲塊接種離體核桃果實(shí)7 d 后，病斑清晰可見(jiàn)（圖3F），隨著侵染時(shí)間增加，病斑面積逐漸擴(kuò)大；分生孢子液接種離體核桃葉片5 d 后出現(xiàn)明顯病斑（圖3D），分生孢子液接種離體核桃果實(shí)7 d 后出現(xiàn)明顯病斑（圖3H），后期病斑處易形成橘紅色孢子堆，所有病斑形態(tài)與田間葉片發(fā)病癥狀一致，發(fā)病的病斑經(jīng)過(guò)重新分離，重新獲得的菌株與原始菌株培養(yǎng)形態(tài)相同，表明菌株NYF2-2 是核桃炭疽病的病原菌。

圖3 菌株NYF2-2 接種離體核桃葉片和果實(shí)的發(fā)病癥狀

3 小結(jié)與討論

湖北省鄖西縣核桃基地炭疽病發(fā)生危害程度日益嚴(yán)重。為了有效控制核桃炭疽病的暴發(fā)流行，明確病原種類(lèi)十分必要。本研究于2022 年6 月從核桃發(fā)病葉片上分離到1 株強(qiáng)致病力菌株NYF2-2，將菌株進(jìn)行離體接種可使核桃葉片和果實(shí)發(fā)病，回接病葉和果實(shí)后再分離，得到的菌株與原分離菌株培養(yǎng)形態(tài)相同，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證該菌株為核桃炭疽病的病原菌。通過(guò)培養(yǎng)特性和多基因序列（ITS、ACT、GAPDH和HIS3）分析，將菌株NYF2-2 鑒定為膠孢炭疽菌，表明膠孢炭疽菌是引起鄖西縣核桃產(chǎn)區(qū)炭疽病暴發(fā)流行的主要致病菌。菌株NYF2-2 在PDA 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)為灰白色，7 d 后逐漸變?yōu)榛揖G色。分生孢子單孢、無(wú)色、長(zhǎng)橢圓形，大小為（14.79±1.78）μm×（4.49±0.41）μm，與已報(bào)道的膠孢炭疽菌的分生孢子形態(tài)、大小基本一致［10］。

有研究對(duì)其他省市的核桃炭疽病病原進(jìn)行了報(bào)道，如山東省濟(jì)南市［7］的核桃炭疽病病原菌為暹羅刺盤(pán)孢菌，陜西省核桃炭疽病的病原為咖啡刺盤(pán)孢（C.coffeanum）［11］等。本研究是關(guān)于湖北省鄖西縣核桃炭疽病病原的首次報(bào)道。1 種炭疽菌可以侵染幾種寄主植物，也可以幾種炭疽菌侵染1 種寄主植物。如引起葡萄炭疽病的有膠孢炭疽菌C.gloeosporioides［12］，引起辣椒炭疽病的有C.acutatum、C.truncatum、C.fructicola和C.siamense4 種炭疽菌［13-15］，而C.acutaum和C.gloeosporioides均可以引起草莓炭疽?。?6］。本研究?jī)H對(duì)從病葉上分離到的1 株強(qiáng)致病性菌株進(jìn)行了鑒定，至于核桃上是否存在其他炭疽菌還需進(jìn)行后續(xù)研究，同時(shí)，該病原菌的生物學(xué)特性、所致病害的發(fā)病規(guī)律等還需繼續(xù)研究，以便制定行之有效的防治方案。