徐陽 李紅云 史銘 何波

(解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學中心腫瘤科,北京 100039)

我國結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)發(fā)病率位于惡性腫瘤第三位,且死亡率占據(jù)惡性腫瘤第二位,近年來其發(fā)病率、死亡率仍然有上升的趨勢[1]。CRC早期癥狀不明顯,大多數(shù)患者在中晚期時才發(fā)現(xiàn)患癌,對患者生存及生活質(zhì)量造成了一定影響。目前,隨著分子生物學研究的不斷深入,腫瘤標志物已在腫瘤診斷、患者病情的監(jiān)測或預后判斷中廣泛地應用[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)在病理和生理過程中起重要作用,其中包括細胞的凋亡和代謝過程。miR-155-5p位于染色體21q21上,研究表明miR-155-5p的表達水平與膽囊癌[3]、胃腺癌[4]、宮頸癌[5]、胰腺癌[6]等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預后有關。另有研究指出,靶向下調(diào)miR-155-5p可能對CRC的治療具有有效的作用[7]。甲狀腺激素受體相互作用因子13(Thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13)屬于蛋白編碼基因,在細胞減數(shù)分裂、細胞增殖等過程中扮演著重要的角色[8]。目前,miR-155-5p、TRIP13在多種惡性腫瘤組織中異常表達,但二者是否可共同參與CRC發(fā)病及對患者預后的價值尚未清楚?；诖?本研究主要探討miR-155-5p、TRIP13在CRC發(fā)生發(fā)展過程中的表達情況及預后的關系,并分析與臨床指標、預后的關系,旨在為CRC預后評價、病理機制解析提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月—2017年5月本院確診的78例CRC患者為研究對象。患者年齡31～72歲,平均(51.33±6.58)歲;男性42例,女性36例;按照《惡性腫瘤TNM分期》進行臨床分期[9],其中19例TNM I期患者,38例Ⅱ期患者,21例Ⅲ期患者;腫瘤大小2.3～6.9 cm,平均(4.2±2.1)cm;腫瘤位置:結(jié)腸45例,直腸33例;浸潤深度:T1患者14例,T2患者15例,T3患者26例,T4患者23例;腫瘤分化程度低、中、高患者分別為19例、46例和13例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者49例,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者29例。納入標準:①所有患者經(jīng)手術后診斷為CRC。②接受術后切除或淋巴掃除治療。③術前未接受化療、生物治療等輔助治療。④患者神志清楚且積極配合研究。⑤患者及家屬知情且簽署知情同意書。排除標準:①合并其他腫瘤。②全身感染。③合并重要器官病變。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核批準(批號:20150326)。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol試劑(貨號:15596018)購自中國深圳子科生物;miScript SYBR?Green qPCR Kit(貨號:330509)購自德國QIAGEN公司;實時熒光定量PCR(Real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)儀購自美國Bio-Rad公司;超微量分光光度計購自中國上海昂拉儀器;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:P0101)購自吉賽生物;引物由上海生工生物工程有限公司合成;兔抗人TRIP13多克隆抗體(貨號:ab204331)購自中國abcam公司;Envision二步法檢測試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色劑(貨號:E-IR-R213)購自武漢伊萊瑞特生物。

1.3 方法

1.3.1 組織樣本采集 采集所有患者腫瘤組織和癌旁組織,離體后迅速置于液氮中,然后做好標記并保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 qRT-PCR檢測組織中miR-155-5p、TRIP13 mRNA相對表達水平 將患者組織加入Trizol試劑進行RNA提取,氯仿溶解。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)為cDNA,采用miScript SYBR?Green qPCR Kit試劑盒檢測miR-155-5p、TRIP13 mRNA的表達水平。PCR反應條件:95 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,70 ℃ 34 s,總計40個循環(huán),分別以U6和GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔct計算組織中miR-155-5p、TRIP13 mRNA相對表達水平,序列見表1。以CRC患者miR-155-5p、TRIP13 mRNA平均值為界線,高于平均值為高表達,低于平均值為低表達。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫組化法檢測組織中TRIP13蛋白表達水平 首先用10%中性甲醛固定CRC組織以及癌旁組織。石蠟包埋之后進行4 μm切片。包埋好的石蠟切片常規(guī)脫蠟,修復抗原,室溫封閉后,加入兔抗人TRIP13抗體(1∶500)4 ℃過夜,之后添加山羊抗兔lgG(1∶1000)37 ℃孵育1 h,DAB進行染色,蘇木素復染,然后用酸酒精進行短暫分化,之后脫水、透明、封片。

1.3.4 結(jié)果判定 顯微鏡下拍照,并對免疫組化結(jié)果進行分析評分;評分規(guī)則如下,由陽性細胞所占比例和染色強度共同決定,其中染色強度評分:0分(無染色),1分(淺黃色),2分(黃褐色),3分(棕褐色);陽性細胞所占比例評分:<5%(0分)、5%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分),染色強度積分與染色面積積分的乘積為總得分,其中0～4分為陰性表達,5～12分為陽性表達[10]。

1.3.5 隨訪 對所有治療出院后的患者進行復查或電話隨訪,隨訪時間為60個月,在2022年5月31日結(jié)束隨訪,記錄CRC患者隨訪期間生存情況。

2 結(jié)果

2.1 miR-155-5p、TRIP13 mRNA在CRC組織及癌旁組織中的表達 CRC組織中miR-155-5p、TRIP13 mRNA表達水平均明顯高于癌旁組織(P<0.05),見表2。

表2 CRC組織及癌旁組織miR-155-5p、TRIP13 mRNA表達水平比較

2.2 CRC組織及癌旁組織中TRIP13蛋白表達比較 TRIP13蛋白主要表達于細胞核(圖1);CRC組織中TRIP13蛋白的陽性表達率顯著高于癌旁組織(P<0.05),見表3。

圖1 CRC組織及癌旁組織中TRIP13蛋白表達(200×)

表3 CRC組織及癌旁組織中TRIP13蛋白表達比較[n(×10-2) ]

2.3 CRC組織中miR-155-5p與TRIP13 mRNA表達水平的相關性 相關性分析顯示,CRC組織中miR-155-5p與TRIP13 mRNA表達水平呈正相關(r=0.491,P<0.001),見圖2。

圖2 CRC組織中miR-155-5p與TRIP13 mRNA表達水平的相關性

2.4 CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白與臨床病理特征的相關性 以CRC組織中miR-155-5p表達平均數(shù)(5.12)分為高表達組40例,低表達組38例,TRIP13蛋白表達分為陽性表達組46例,陰性表達組32例。結(jié)果表明CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、浸潤深度無關(P>0.05),與患者TNM分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P<0.05),見表4。

表4 CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白與臨床病理特征的相關性[n]

2.5 CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白表達對患者預后的影響 對CRC患者進行出院后隨訪,miR-155-5p高表達組5年內(nèi)生存率(42.50%)低于低表達組(71.05%)(Log Rank2=6.314,P=0.012);TRIP13蛋白陽性組5年內(nèi)生存率(43.48%)低于陰性組(75.00%)(Log Rank2=7.330,P=0.007),見圖3。

圖3 CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白表達對患者預后的影響

2.6 CRC患者預后的多因素分析 以單因素分析中差異顯著的浸潤深度、腫瘤分化程度、miR-155-5p、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TRIP13為自變量,將預后作為因變量,Cox回歸分析顯示,腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-155-5p、TRIP13是CRC患者預后的影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 CRC預后的多因素分析

3 討論

隨著生活質(zhì)量及飲食水平的不斷提高,CRC的發(fā)生率、死亡率均趨于年輕化,人們的身體健康和生命安全不斷受到威脅。目前,手術切除是治療CRC的首選方法,早期CRC患者在進行手術切除之后,5年生存率高達90%,但是CRC發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率只有8.1%[11]。所以,探究與CRC預后相關的因子,對患者生存時間延長、改善患者預后具有十分重要的意義。

miRNA在人體中調(diào)控著基因的表達水平,并且參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展,miR-155-5p是miRNA家族中具有多功能的基因,在活化的巨噬細胞、單核細胞、T細胞中均表現(xiàn)出顯著高表達,目前已經(jīng)證實miR-155-5p在炎癥反應、免疫反應及癌癥等多種病理生理過程中起關鍵作用[12]。有研究表明[13-14],miR-155-5p在口腔鱗狀細胞癌、肝細胞癌中明顯上調(diào),可促進腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。La等[15]研究報道,抑制miR-155-5p的表達有利于增強CRC細胞對化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性。Shi等[16]研究顯示,胃癌組織中miR-155-5p的表達水平顯著升高,其異常表達與胃癌細胞的增殖和遷移過程有關。本研究結(jié)果顯示,CRC組織中miR-155-5p表達水平較癌旁組織高,與Shi等[16]研究類似,提示miR-155-5p可能參與CRC的發(fā)生。進一步研究顯示,CRC組織中miR-155-5p表達率在不同TNM分期、腫瘤分化、淋巴轉(zhuǎn)移患者中均有差異,提示miR-155-5p可能參與CRC的發(fā)展對CRC患者進行出院后隨訪,miR-155-5p高表達組5年內(nèi)生存率低于低表達組,且miR-155-5p是CRC預后的獨立危險因素。進一步說明miR-155-5p不僅參與CRC疾病的發(fā)生發(fā)展,同時與患者預后也密切相關,可作為評估患者預后的生物學標志物。

TRIP13位于人類染色體的5p15.33上,是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。同時作為AAA+三磷酸腺苷酶(ATPase)超家族的一員,具有促進DNA-蛋白、蛋白-蛋白復合物形成的功能,參與有絲分裂和減數(shù)分裂過程。2014年首次報道TRIP13為頭頸癌的致癌基因[17],隨后的幾項研究表明TRIP13在其他腫瘤中發(fā)揮致癌作用[18-19]。Agarwal等[20]研究指出,TRIP13能促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,并表明它是CRC的治療靶點。Kurita等[21]研究表明,TRIP13在CRC中表達上調(diào),并且通過下調(diào)TRIP13可以降低癌細胞的增殖和侵襲。通過上述研究可知,TRIP13參與CRC的病情進展,但TRIP13與患者預后的關系仍需進行驗證。因此,本研究通過qRT-PCR法及免疫組化法分別檢測了TRIP13 mRNA及蛋白表達水平,結(jié)果顯示,CRC組織中TRIP13 mRNA表達水平及蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織,與Kurita等[21]研究結(jié)果一致,提示TRIP13可能在CRC中可能作為促癌基因,參與CRC的發(fā)生。通過分析TRIP13與患者臨床病理特征的關系,結(jié)果顯示,CRC組織中TRIP13蛋白的表達與患者TNM分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關性,提示TRIP13可能與CRC的發(fā)生及腫瘤細胞的侵襲與遷移關系密切。生存分析結(jié)果顯示,TRIP13蛋白陽性組5年內(nèi)生存率低于陰性組,且TRIP13是CRC預后的影響因素,提示TRIP13水平與CRC預后密切相關,TRIP13水平越高患者預后越差。此外,本研究Pearson檢驗結(jié)果顯示,CRC組織中miR-155-5p與TRIP13 mRNA表達水平呈正相關,提示二者可能通過某種調(diào)控機制共同參與CRC的發(fā)生及發(fā)展,從而共同影響患者預后。本研究不足之處在于,關于MiR-155-5p、TRIR13與CRC患者病情及預后的機制未深入分析,且二者在CRC中的相互調(diào)節(jié)的具體分子機制未進行探討,今后需增加基礎實驗(如動物或細胞實驗)深入分析;同時由于研究時間及經(jīng)費有限,本研究僅為單中心小樣本回顧性分析,研究結(jié)論還需要從多個角度進一步證實。

4 結(jié)論

CRC組織中miR-155-5p、TRIP13表達上調(diào),二者均參與CRC的發(fā)生發(fā)展過程,miR-155-5p、TRIP13表達情況與預后密切相關。