王國(guó)勝 李嘉雯 李 娜 何西濤 董咨余 劉振新

(1 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱,150000; 2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院,哈爾濱,150000; 3 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院,哈爾濱,150000)

我國(guó)結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer,CRC)發(fā)病率在近幾十年來(lái)呈逐漸上升趨勢(shì)。現(xiàn)在CRC的死亡率為全部惡性腫瘤死亡率中的主要類型之一[1],CRC調(diào)整死亡率男性為5.29/10萬(wàn),女性為3.86/10萬(wàn)[2]。近年來(lái),腫瘤的治療越來(lái)越多地應(yīng)用中藥。有研究發(fā)現(xiàn),中藥對(duì)腫瘤的作用機(jī)制可能是“多靶點(diǎn)作用”,并且具有獨(dú)特的功效[3],即有選擇地反復(fù)作用于某種疾病的多個(gè)直接靶點(diǎn)和間接靶點(diǎn)從而達(dá)到治療疾病的目的[4]。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn),部分中藥對(duì)LoVo人結(jié)直腸癌細(xì)胞(Human Colon Cancer Cells)的相關(guān)表達(dá)因子有所影響[5]。在我們以往的研究中,根據(jù)LoVo的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,靈芪膠囊各組對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用;靈芪膠囊(換氣、靈芝、莪術(shù)、茯苓、人參、枸杞子、山藥、山慈菇、重樓等)對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果顯著[6]。另一方面,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子(Mesenchymal-epithelial Transition Factor,c-Met)信號(hào)通路被認(rèn)為是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移所必需的,結(jié)直腸癌早期的強(qiáng)有力的診斷指標(biāo)[7-8]。HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的關(guān)鍵信號(hào)通路[9]。因此,本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)建立腫瘤模型,使用自研中藥?kù)`芪合劑(黃芪、靈芝、莪術(shù)等合劑)[10],來(lái)驗(yàn)證本合劑配方是否可通過(guò)調(diào)控HGF/c-Met信號(hào)通路從而抑制CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 LoVo細(xì)胞(黑龍江省腫瘤研究所,貨號(hào):STCC00011G)。

1.1.2 動(dòng)物 24只裸鼠由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供,合格證編號(hào):SCXK(黑)2020-003。體質(zhì)量20～25 g,清潔級(jí),8周齡,給藥前適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d(普通飼料,常規(guī)飲水,室溫控制在22 ℃左右,相對(duì)濕度約60%)。本課題所有涉及動(dòng)物的試驗(yàn)均已通過(guò)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),動(dòng)物倫理審批號(hào):LL2017032802,符合清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 藥物 靈芪合劑由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室生產(chǎn),由黃芪、靈芝、莪術(shù)、茯苓、人參、貫眾、山藥、枸杞子、重樓、山慈菇等組成,每粒含生藥1.65 g[11]。

1.1.4 試劑與儀器 胸苷酸合成酶抑制藥5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)注射液(國(guó)泰醫(yī)藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H2020959)。細(xì)胞裂解液(增強(qiáng)型,上海碧云天生物技術(shù)研究,貨號(hào):P0013);0.45 μm聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜(Sigma公司,德國(guó),貨號(hào):P2938);HGF多克隆抗體[貨號(hào):Anti-HGF antibody(EPR12230)ab178395]、c-Met多克隆抗體[貨號(hào):Anti-Met(c-Met) antibody(EP1454Y)-N-terminal ab51067]以上購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;通用型電泳儀(上海天能科技有限公司,型號(hào):TanonESP300);轉(zhuǎn)膜儀(BayGene公司,美國(guó),型號(hào):BG-Power60);倒置熒光顯微鏡(Olympus公司,日本,型號(hào):CKX41);熒光顯微鏡(NIKON公司,日本,型號(hào):NIKON ECLIPSE C1);高速低溫離心機(jī)(Sigma公司,德國(guó),型號(hào):Centrifuge 5424R);微量分析天平(METTLER公司,瑞士,型號(hào):E260);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(通用電氣公司,美國(guó),型號(hào):Imager 600)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組:裸鼠按照完全隨機(jī)法分為6組,每組4只,陰性對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組,5-FU注射液組,靈芪合劑高劑量組、中劑量組和低劑量組,每組4只。2)除陰性照組裸鼠外,其他組裸鼠按0.2 mL/只接種LoVo于常規(guī)皮膚消毒后的裸鼠右前肢腋部皮下,接種24 h后進(jìn)行下步操作。

1.2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)時(shí)將靈芪合劑臨時(shí)配制成溶液。靈芪合劑高劑量組、中劑量組和低劑量組分別為5.0 g/kg、2.5 g/kg、1.25 g/kg,給藥方式均為灌胃給藥,連續(xù)給藥7 d;陰性對(duì)照組以0.2 mL生理鹽水灌胃;5-FU注射液組以5-FU注射液0.027 g/(kg·d)灌胃;陽(yáng)性對(duì)照組不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)裂解腫瘤組織細(xì)胞,提取蛋白,使用BSA計(jì)算蛋白含量和上樣量。灌膠、上樣,進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)模后進(jìn)行一抗和二抗的孵育,一抗?jié)舛?HGF(1∶1 000稀釋)和c-Met(1∶1 000稀釋),二抗?jié)舛?辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標(biāo)記二抗羊抗兔(1∶5 000)稀釋,時(shí)間分別為10 h和2 h。采用Imager 600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白化學(xué)發(fā)光的檢測(cè),獲取并保存結(jié)果。應(yīng)用圖像處理軟件(ImageJ)分析蛋白灰度值。

1.2.3.2 c-Met的免疫熒光檢測(cè)步驟 1)準(zhǔn)備處理好的腫瘤組織切片,并置于65 ℃恒溫箱烤片1 h。接下來(lái)使用1×磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗滌3次,5 min/次。2)0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)使用1×PBS配制,室溫通透細(xì)胞15 min,1×PBS浸洗玻片3次,3 min/次。3)使用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0),微波爐高火加熱8 min后拿出,冷卻至室溫。冷卻后PBS(pH值7.2～7.6)洗滌3次,3 min/次。4)加入3% H2O2,室溫10 min。PBS沖洗3次,3 min/次。5)血清封閉:切片滴加血清放入濕盒中,室溫20 min。6)孵育一抗:滴加適當(dāng)稀釋的一抗(c-Met),對(duì)照組滴加等量PBS,4 ℃冰箱過(guò)夜。7)加熒光二抗:PBS浸洗3次,3 min/次,吸干切片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中37 ℃孵育1 h,PBS浸洗3次,3 min/次。8)復(fù)染核:滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)避光孵育5 min,對(duì)切片進(jìn)行染核,PBS洗滌4次,去除多余DAPI。9)封片:使用防熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片,接下來(lái)使用熒光顯微鏡觀察。

1.2.3.3 凋亡檢測(cè) 用0.25%的胰酶消化腫瘤組織。在消化時(shí)加2%的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)可防止消化過(guò)度。用1×PBS洗滌。細(xì)胞收集:用胰酶消化收集后,于室溫2 000 r/min,離心半徑6 cm,離心5～10 min,離收集細(xì)胞;用預(yù)冷1×PBS(4 ℃)重懸細(xì)胞1次,2 000 r/min,離心半徑6 cm,離心5～10 min,洗滌細(xì)胞;加入300 μL的1×結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)懸浮細(xì)胞;膜聯(lián)蛋白V熒光素(Annexin V-FITC)標(biāo)記:加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后,避光,室溫孵育15 min;碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)標(biāo)記:上機(jī)前5 min再加入5 μL的PI染色。

2 結(jié)果

2.1 HGF和c-Met的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果 靈芪合劑能夠顯著抑制HGF蛋白表達(dá)量,其中靈芪膠囊高、中、低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。靈芪膠囊能夠影響c-Met蛋白相對(duì)表達(dá)量,高劑量組效果更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 HGF蛋白的表達(dá)與HGF/β-actin結(jié)果(n=4)注:A. HGF與內(nèi)參蛋白印跡圖; B. HGF與β-actin蛋白條帶強(qiáng)度之比;與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較,△P<0.05,△△P<0.01

圖2 檢測(cè)c-Met蛋白的表達(dá)與c-Met/β-actin結(jié)果(n=4)注:A. c-Met與內(nèi)參蛋白印跡圖; B. c-Met與β-actin蛋白條帶強(qiáng)度之比;與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.2 凋亡檢測(cè)結(jié)果 靈芪合劑高劑量組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用最為顯著,與陽(yáng)性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 靈芪合劑誘導(dǎo)組織凋亡與調(diào)亡指數(shù)(免疫熒光染色,×400)注:A.細(xì)胞凋亡結(jié)果;B.各組凋亡指數(shù);與陰性對(duì)照組比較,**P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較,△△P<0.01

2.3 c-Met的免疫熒光表達(dá)結(jié)果 在腫瘤組織中c-Met表達(dá)量很低,在靈芪合劑高劑量治療后c-Met表達(dá)量顯著增多,與蛋白質(zhì)印跡法的蛋白表達(dá)結(jié)果相一致。見(jiàn)圖4。

圖4 c-Met免疫熒光表達(dá)(免疫熒光染色,×400)注:DAPI染藍(lán)色為細(xì)胞核,紅色為c-Met蛋白陽(yáng)性表達(dá)

3 討論

CRC是全球癌癥被公認(rèn)的死亡第三大原因[12]。發(fā)病率和死亡率隨著時(shí)間的推移迅速增加,預(yù)計(jì)全球CRC負(fù)擔(dān)將激增60%[13],新發(fā)病例超過(guò)220萬(wàn),到2030年將有110萬(wàn)人死亡[14]。因此,找到一種除了手術(shù)療法外的有效治療方法刻不容緩。

在正常生理?xiàng)l件下,HGF/c-Met的相互作用強(qiáng)烈介導(dǎo)細(xì)胞組織和細(xì)胞分裂[15],如上皮細(xì)胞增殖和遷移、血管生成和傷口愈合[16]。而HGF/c-Met通路也參與不同類型的惡性腫瘤,在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[17]。本課題組多年來(lái)從事著消化道腫瘤及相關(guān)研究[18-20],近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)靈芪膠囊對(duì)于各種消化道腫瘤具有一定的抑制作用,其中該藥物對(duì)LoVo細(xì)胞的抑制作用非常明顯[6,21],具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。

從HGF和c-Met蛋白的表達(dá)結(jié)果可以看出,在沒(méi)有應(yīng)用靈芪合劑治療的組別HGF表達(dá)量較高,c-Met的蛋白表達(dá)量較低;在應(yīng)用靈芪合劑治療后,2個(gè)蛋白的表達(dá)量反轉(zhuǎn),分別降低和升高,且差異顯著。在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中,其結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果基本一致,這也表明了靈芪合劑對(duì)HGF/c-Met信號(hào)通路的影響,從而影響癌癥發(fā)展。

本研究結(jié)果表明,c-Met在CRC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。HGF/c-Met信號(hào)通路的干預(yù)可能為探索CRC轉(zhuǎn)移的新藥物療法提供寶貴的靶點(diǎn),潛在的c-Met抑制劑可能在結(jié)腸癌的治療中具有治療價(jià)值,同時(shí)也為中藥治療癌癥提供先例,為中藥制劑提供新方向。

綜合本研究結(jié)果,經(jīng)靈芪合劑治療的結(jié)直腸癌裸鼠模型,其腫瘤細(xì)胞的HGF蛋白表達(dá)明顯下降,而c-Met蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),其高劑量靈芪合劑調(diào)控HGF和c-Met表達(dá)效果與5-FU相當(dāng),免疫熒光檢測(cè)結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果一致,表明靈芪合劑可能通過(guò)下調(diào)HGF的表達(dá),上調(diào)c-Met的表達(dá),達(dá)到抑制腫瘤的效果。制備CRC內(nèi)體裸鼠荷瘤模型,并選取中醫(yī)藥經(jīng)典方劑,經(jīng)現(xiàn)代化工藝制成靈芪合劑,深入分析闡明靈芪合劑對(duì)CRC的抑制作用及其機(jī)制。并通過(guò)體內(nèi)驗(yàn)證靈芪合劑的生物學(xué)功能及藥效學(xué)研究,靈芪合劑能夠抑制CRC裸鼠荷瘤模型的腫瘤生長(zhǎng),其作用機(jī)制與靈芪膠囊機(jī)制腫瘤過(guò)程中激活的HGF/c-met細(xì)胞通路有關(guān),進(jìn)一步明確靈芪合劑對(duì)CRC的抑制作用及其作用途徑,為靈芪合劑在CRC腫瘤治療過(guò)程中積累了寶貴的臨床經(jīng)驗(yàn),為CRC的治療提供理論基礎(chǔ)和新的思路。

利益沖突聲明:本研究作者均無(wú)利益沖突。