林淑芳 王嘉駒 陳 白 曹麗萍 姚娟娟 江一靜

(1 福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院,福州,350003; 2 福建省康復技術重點實驗室,福州,350003; 3 蘭州大學,蘭州,730000)

偏頭痛是一種反復發(fā)作的可致殘的神經(jīng)血管性疾病,全球超過10億人受偏頭痛困擾[1],發(fā)作時劇烈的搏動性疼痛,伴隨畏光、惡心及嘔吐等癥狀嚴重影響患者的日常生活[2]。目前臨床所用藥物雖然能減少偏頭痛的發(fā)作頻率,但伴隨著睡眠障礙、代謝紊亂或肝臟損害等不良反應[3],與藥物比較,針刺能有效、安全地預防和治療偏頭痛[4],緩解疼痛[5],改善大腦功能[6]。降鈣素基因相關肽(Calcitonin Gene-related Peptide,CGRP)、5-羥色胺(5-hydroxy Tryptamine,5-HT)及腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)等神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)參與了偏頭痛的病理生理過程;CGRP是偏頭痛的發(fā)生和發(fā)展過程中重要的血管活性肽之一,參與痛覺信息傳遞、外周和中樞敏化,有強烈的舒血管作用,可產(chǎn)生搏動性疼痛[7];5-HT是單胺類小分子神經(jīng)遞質(zhì),參與偏頭痛的痛覺調(diào)制,當5-HT神經(jīng)元活動增強時,痛閾升高,產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[8];TNF-α是一種炎癥介質(zhì),并且有神經(jīng)遞質(zhì)效應,參與偏頭痛神經(jīng)源性炎癥反應[9]。肝陽上亢證在偏頭痛的證候分型中最常見[10],本課題組前期觀察證實針刺雙側太沖穴可明顯改善肝陽上亢偏頭痛患者疼痛情況和生命質(zhì)量[11],但其機制尚不明確。因此,本研究以肝陽上亢偏頭痛大鼠為研究對象,觀察針刺雙側太沖穴對偏頭痛大鼠血清CGRP、5-HT及TNF-α含量的影響,為臨床針刺太沖穴治療肝陽上亢型偏頭痛提供機制研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠50只,體質(zhì)量(200±20)g,購自浙江省醫(yī)學科學院[許可證號:SCXK(浙)2018-0004],在福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物房喂養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境溫度恒定于22 ℃,濕度恒定于50%,光暗周期為12 h,自由攝食、飲水。整個實驗過程中參考《關于善待實驗動物的指導性意見》[12]為處理動物的參考,符合實驗動物倫理學原則,經(jīng)福建中醫(yī)藥大學倫理委員會批準同意(倫理審批號:FJTCM IACUC 2022054)。

1.1.2 儀器與試劑 華佗牌一次性無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,0.25 mm×13 mm,批號:200135),高速冷凍離心機(Eppendorf公司,德國,型號:5810R),自動平衡離心機(Eppendorf公司,德國,型號:5430R),全自動酶標儀(Bio-Tek公司,美國,型號:Elx800),恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司,型號:HWS24);硝酸甘油注射液(廣州白云山明興制藥有限公司,批號:1210901),CGRP試劑盒(上海西唐生物科技有限公司,貨號:F15261),5-HT試劑盒(上海西唐生物科技有限公司,貨號:F16771),TNF-α試劑盒(上海西唐生物科技有限公司,貨號:F15710)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 適應性喂養(yǎng)1周后,將50只SD大鼠隨機分為空白對照組(n=10)、模型組(n=40),模型組大鼠以附子湯灌胃結合頸肩部皮下注射硝酸甘油建立肝陽上亢偏頭痛模型,其中30只大鼠成模,將成模的大鼠隨機分為模型組、太沖組、非穴組,每組10只。本研究以附子湯灌胃結合注射硝酸甘油方法復制肝陽上亢偏頭痛模型[13-14]。將20 g制附子浸泡30 min,煎煮2次后將藥液混合,濃縮為含生藥0.1 g/mL的附子濃縮液,以20 mL/(kg·d)的劑量連續(xù)灌胃21 d,當大鼠出現(xiàn)眼結膜顏色變紅,抓尾時尖叫、驚跳甚至咬人等易激惹表現(xiàn)時提示肝陽上亢模型復制成功;再用0.9% NaCl硝酸甘油注射液稀釋成濃度為2 mg/mL溶液,以10 mg/kg算出每只SD大鼠所需注射的劑量,用5 mL注射器抽取相對應劑量溶液,在大鼠右肩頸部皮下緩緩注射,1次/d,共5 d;注射硝酸甘油后,SD大鼠出現(xiàn)耳紅,爬籠以及前肢撓頭連續(xù)超過5次以上等煩躁不安次數(shù)增加的癥狀,為偏頭痛模型制作成功。

1.2.2 干預方法 空白對照組:普通籠中飼養(yǎng),每次抓取后無任何治療。模型組:建模成功后普通籠中飼養(yǎng),每次抓取后無任何治療。太沖組:行為學觀察1 h后,針刺雙側太沖穴(定位參考實驗大鼠腧穴圖譜[15]),用0.25 mm×13 mm的一次性無菌針灸針直刺2～3 mm,捻轉瀉法1 min,每10 min行針1次,留針30 min。非穴組:行為學觀察1 h后,針刺雙側肋下固定非穴點(雙側髂嵴直上10 mm處),約30°斜刺2～3 mm,行針手法同太沖組。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 行為學 觀察偏頭痛大鼠耳紅持續(xù)時間及針刺前后撓頭和爬籠次數(shù):觀察造模后大鼠耳紅出現(xiàn)直至消失的持續(xù)時間;在針刺前、針刺后1 h、針刺后2 h共3個時間段分別記錄撓頭、爬籠次數(shù),針刺治療期間不記次。

1.2.3.2 血清CGRP、5-HT、TNF-α的含量 酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測偏頭痛大鼠血清中CGRP、5-HT、TNF-α的含量:行為學觀察完畢后,檢測血清中CGRP、5-HT、TNF-α含量。經(jīng)腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)麻醉大鼠,腹主動脈采血約1 mL放入預冷的試管,加入10%乙二胺四乙酸鈉15 μL混勻,在高速冷凍離心機中以12 000×g,離心15 min,分離血漿后取上層血清分裝于凍存管,置于-80 ℃冰箱保存待測。按ELISA試劑盒說明書稀釋標準品,每孔加樣品50 μL(空白孔不添加標準品和待測樣品),在設定37 ℃恒溫箱中溫育30 min;配液后每孔反復加入洗滌液并拍干,反復5次;每孔加入50 μL酶標試劑(空白孔不添加),再次在設定37 ℃恒溫箱中溫育30 min;洗滌后顯色,分別加入顯色劑A 50 μL、顯色劑B 50 μL,在避光37 ℃環(huán)境中反應15 min,每孔加入終止液50 μL終止后測定,選取波長為450 nm,將待測品放入酶標儀檢測,根據(jù)標準品的濃度及測得的吸光度(A)值計算出對應的樣品濃度。

2 結果

2.1 各組大鼠造模后行為學觀察 空白對照組無耳紅,模型組、太沖組及非穴組均在注射硝酸甘油后4 min左右出現(xiàn)耳紅,3 h左右后消失;與模型組、非穴組比較,太沖組大鼠耳紅持續(xù)時間明顯較短(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠造模后耳紅出現(xiàn)時間和消失時間比較

空白對照組在各時間段內(nèi)偶爾出現(xiàn)幾次撓頭、爬籠。針刺前,與空白對照組比較,模型組、太沖組及非穴組大鼠撓頭、爬籠次數(shù)明顯增多(P<0.05);模型組、太沖組、非穴組之間撓頭及爬籠次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。針刺干預后1 h、2 h,與模型組、非穴組比較,太沖組大鼠撓頭、爬籠次數(shù)均明顯減少(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組大鼠血清中CGRP、5-HT、TNF-α含量比較 與空白對照組比較,模型組大鼠血清中CGRP、TNF-α含量明顯增高(P<0.05),5-HT含量明顯降低(P<0.05);與模型組、非穴組比較,太沖組大鼠血清中CGRP、TNF-α含量明顯減少(均P<0.05),5-HT含量明顯增多(均P<0.05)。見表2,圖2。

圖2 各組大鼠治療后血清CGRP、5-HT、TNF-α含量比較注:與空白對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與非穴組比較,▲P<0.05

表2 各組大鼠治療后血清CGRP、5-HT、TNF-α含量比較

3 討論

偏頭痛屬中醫(yī)學“偏頭風”“頭風”等病癥范疇。偏頭痛與肝關系密切,多從肝論治[16];文獻分析證實,在偏頭痛的辨證分型中,肝陽上亢證最為常見[10],肝氣主升,體陰而用陽,肝陽偏亢生發(fā)太過,陰不制陽,導致偏頭痛,宜平肝通絡止痛?！皻庥杏嘤谏险?導而下之”,太沖穴可平肝潛陽,疏調(diào)氣血運行,且為肝經(jīng)輸穴主疼痛,緩解偏頭痛臨床癥狀[11,17]。太沖穴分布有腓淺神經(jīng)、皮神經(jīng)、趾背動靜脈及足背靜脈網(wǎng),且在大腦皮質(zhì)功能投影范圍較廣,可調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)功能[18]。研究發(fā)現(xiàn),針刺太沖穴可迅速顯著地調(diào)節(jié)偏頭痛患者的腦血流量,這是太沖穴作為肝陽上亢偏頭痛最常用的遠端取穴的原因之一[19]。三叉神經(jīng)血管學說是偏頭痛發(fā)病機制研究的主要學說之一,該學說認為偏頭痛發(fā)作產(chǎn)生的神經(jīng)源性炎癥反應與CGRP、5-HT、TNF-α等血管活性物質(zhì)密切相關[20-21]。課題組前期研究已證實針刺雙側太沖穴對肝陽上亢偏頭痛的臨床療效,因此,本研究從血管活性物質(zhì)角度探討針刺太沖穴治療肝陽上亢偏頭痛的作用機制。

CGRP是重要的血管活性神經(jīng)肽,是三叉神經(jīng)血管反射學說中引起神經(jīng)源性炎癥反應的重要舒血管物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),偏頭痛患者發(fā)作期血清CGRP水平明顯高于正常人[22];臨床和實驗研究證實靜脈或腹腔注射CGRP會誘發(fā)偏頭痛發(fā)作[23-24],而降低外周血CGRP活性可抑制三叉神經(jīng)敏化,有效緩解偏頭痛發(fā)作[25];臨床研究發(fā)現(xiàn)針刺可降低偏頭痛患者血清中CGRP水平[26],本研究再次證實這一結論。本研究中,針刺前大鼠血清中CGRP含量升高,針刺太沖穴后與針刺非穴比較,針刺太沖穴的大鼠血清CGRP含量明顯降低,說明針刺太沖穴可通過減少血清CGRP含量緩解偏頭痛。有學者在太沖穴區(qū)的顯微結構中發(fā)現(xiàn)穴區(qū)內(nèi)細小血管與CGRP陽性神經(jīng)纖維相伴行,這或許是針刺太沖穴起效的物質(zhì)基礎之一[27]。

5-HT通過與不同受體結合介導腦膜血管舒縮、神經(jīng)源性炎癥反應、痛覺信息傳遞等途徑調(diào)制痛覺,對偏頭痛有雙向的影響[28]。臨床研究發(fā)現(xiàn),針刺通過提高偏頭痛患者血清中5-HT含量參與鎮(zhèn)痛過程[29];針刺使5-HT受體高表達,激活5-HT,從而抑制CGRP的釋放,治療偏頭痛[30]。本研究顯示,偏頭痛模型大鼠血清5-HT較正常大鼠明顯偏低,針刺太沖后血清5-HT明顯上升,這與上述研究結果一致,可見,提高偏頭痛血清5-HT含量是針刺太沖穴起鎮(zhèn)痛作用的途徑之一。

炎癥介質(zhì)TNF-α參與偏頭痛神經(jīng)源性炎癥反應過程,三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元釋放的CGRP可促進衛(wèi)星細胞釋放TNF-α,而TNF-α可反作用于大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元進一步促進CGRP分泌和表達[31]。有研究報道,TNF-α在偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)顯著表達[32],而TNF-α抑制劑能明顯減輕神經(jīng)病理性疼痛[33],認為TNF-α可能是偏頭痛治療的潛在靶點。本研究顯示,偏頭痛模型大鼠血清TNF-α含量明顯升高,這與另一研究結果相符[34];與針刺非穴比較,針刺太沖穴可顯著降低血清TNF-α含量,針刺太沖穴治療偏頭痛具有穴位特異性。

綜上所述,針刺雙側太沖穴可通過降低血清CGRP、TNF-α含量,提高血清5-HT含量治療肝陽上亢偏頭痛。針刺太沖穴可能通過調(diào)節(jié)外周血相關血管活性物質(zhì)參與偏頭痛,以此為基礎,本課題組將進一步深入研究針刺太沖穴對偏頭痛三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的中樞調(diào)控機制。

利益沖突聲明:無。