周瑩潔 李思耐 尚菊菊

(1 北京中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院,北京,100029; 2 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京,100010; 3 北京市中醫(yī)藥研究所,北京,100010)

糖尿病是由胰島素分泌的絕對或相對不足,和(或)胰島素敏感性下降導致的糖代謝異常為主要表現(xiàn)的疾病。我國DM以2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)為主,目前T2DM的患病率已達10.4%,治療以控制危險因素、控制血糖、防治并發(fā)癥為主[1]。T2DM在中醫(yī)屬于“消渴病”范疇,中醫(yī)理論認為氣陰兩虛是T2DM的基本病機之一[2-4]。包含西洋參-黃芪藥對的益氣養(yǎng)陰中藥組方治療T2DM效果明顯[5-6]。藥理研究提示,西洋參具有改善胰島素抵抗的作用[7],黃芪具有改善胰島素抵抗,增加胰島素敏感性的作用[8]。但西洋參-黃芪藥對作為中醫(yī)治療T2DM的常見益氣養(yǎng)陰藥對,治療T2DM的作用機制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學通過構(gòu)建藥物成分-靶點-疾病的相互作用網(wǎng)絡(luò),反映了中藥的多成分-多靶點-多通路作用關(guān)系,從整體出發(fā)闡述作用機制,符合中醫(yī)整體觀的思想。分子對接技術(shù)主要通過計算機模擬配體與受體的結(jié)合,利用結(jié)合能判斷配體與受體的結(jié)合效果。本文通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法,對西洋參-黃芪的主要化學成分、作用靶點進行探究,分析核心靶點及通路,并將西洋參-黃芪部分化學成分和靶點進行分子對接,為今后的相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 西洋參-黃芪有效化學成分的獲取與靶點預測 使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)結(jié)合文獻[7,9],收集藥物化學成分。選擇口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18并且有明確作用靶點的化學成分為有效化學成分[10-11]。利用TCMSP預測靶點,去重后,通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)獲取經(jīng)驗證的(Reviewed)、人源(Human)靶蛋白。

1.2 T2DM靶點蛋白的獲取 使用CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),以“diabetes mellitus,type 2”“type 2 diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞,分別去除重復基因與假陽性基因后,選取交集基因,獲取T2DM相關(guān)的靶基因。

1.3 有效化學成分、疾病相互作用靶點的映射及相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將最終納入的有效化學成分預測靶點、T2DM靶點進行映射取交集,得到西洋參-黃芪作用于T2DM的作用靶點。用Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化處理。構(gòu)建中藥化學成分-作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過選擇自由度≥平均自由度的節(jié)點[12],獲得西洋參-黃芪治療T2DM的關(guān)鍵化學成分與核心靶點。結(jié)合KEEG通路富集分析結(jié)果最終構(gòu)建關(guān)鍵化學成分-核心靶點-生物通路相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶點功能富集分析 使用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)對獲得的核心靶點蛋白進行基因本體(Gene Ontology,GO)分析,用統(tǒng)計學超幾何分布定量P<0.01評估存在于各GO注釋中的蛋白質(zhì)群,以P值反映蛋白質(zhì)生物學功能的顯著性。選擇生物過程(Biological Process,BP),細胞組分(Cellular Component,CC),分子功能(Molecular Function,MF)3個模塊,應(yīng)用DAVID工具對核心蛋白靶基因進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,得到西洋參-黃芪治療T2DM的主要作用通路。

1.5 分子對接 分別選取西洋參、黃芪度值最高的活性成分為配體,選取度值前5位的靶點作為受體進行分子對接。1)配體的準備:ZINC數(shù)據(jù)庫中下載配體分子結(jié)構(gòu),保存為Mol2格式。2)受體的準備:利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載受體分子結(jié)構(gòu),選擇物種為人,可信度高的分子,保存為pdb格式。3)分子對接:利用Auto Dock對受體、配體進行去水、加氫、加電荷等操作,保存為pdbqt格式,進行分子對接,利用Pymol進行可視化。分子對接結(jié)果參照結(jié)合能,結(jié)合能小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)證明配體與受體可以穩(wěn)定結(jié)合,結(jié)合能越小結(jié)合越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 西洋參-黃芪有效化學成分及作用靶點 收集到西洋參化學成分153個,黃芪化學成分87個。通過篩選并且去除無明確對應(yīng)靶點的化學成分,得到有效化學成分26個,其中西洋參9個,黃芪17個。見表1。

2.2 西洋參-黃芪作用于T2DM的相關(guān)靶點及中藥化學成分-作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 收集到西洋參-黃芪作用靶點231個。經(jīng)UniProt查詢后,得到西洋參-黃芪靶基因共184個。T2DM的靶基因方面,除外重復基因,CTD篩選到基因29 049個,GeneCards篩選基因6 127個,最終數(shù)據(jù)庫共有的與T2DM相關(guān)的基因5 607個。有效化學成分的靶蛋白與T2DM相關(guān)的靶蛋白取交集后,共得到162個靶蛋白。對應(yīng)25種化學成分,其中西洋參9種,黃芪16種(HQ2除外)。利用Cytoscape軟件繪制中藥化學成分-作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò),共有187個節(jié)點(162個靶蛋白,西洋參化學成分9種,黃芪化學成分16種),378條連線。見圖1。各個節(jié)點“Degree”分布在“1-114”之間,平均度值為4.04,度值≥平均度值的節(jié)點為西洋參-黃芪作用于T2DM的關(guān)鍵成分、核心靶蛋白。關(guān)鍵成分共有13種,其中西洋參3種,編號為XYS6、XYS8、XYS9;黃芪10種,編號為HQ4、HQ5、HQ6、HQ8、HQ10、HQ11、HQ12、HQ13、HQ14、HQ16。核心靶點共21個。見表2。西洋參、黃芪度值最大的化學成分分別是XYS9(Beta-Sitosterol,β-谷甾醇)、HQ16(Quercetin,槲皮素)。核心靶點度值前5位的分別是:前列腺素G/H合酶2(Prostaglandin G/H Synthase 2)、核受體共激活劑2(Nuclear Receptor Coactivator 2)、前列腺素G/H合酶1(Prostaglandin G/H Synthase 1)、胰蛋白酶-1(Trypsin-1)、視黃醇X受體-alpha(Retinoic Acid Receptor RXR-alpha)。

圖1 中藥化學成分-作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)注:紅色節(jié)點代表黃芪化學成分,藍色節(jié)點代表作用靶點,綠色節(jié)點代表西洋參化學成分,節(jié)點大小與度值成正比

表2 中藥化學成分-疾病映射核心靶點信息

2.3 核心靶點的GO分析與KEEG通路富集分析 GO分析涉及18種生物過程、3種細胞組分、17種分子功能。見圖2。通過KEEG生物通路分析,西洋參-黃芪核心靶蛋白涉及的12條生物通路分別是:甲狀腺癌(Thyroid Cancer)、脂肪細胞內(nèi)脂肪分解的調(diào)節(jié)(Regulation of Lipolysis in Adipocytes)、催乳激素信號通路(Prolactin Signaling Pathway)、小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)、唾液分泌(Salivary Secretion)、甲狀腺激素信號通路(Thyroid Hormone Signaling Pathway)、鈣信號通路(Calcium Signaling Pathway)、膽堿能突觸(Cholinergic Synapse)、心肌細胞的腎上腺素能信號(Adrenergic Signaling in Cardiomyocytes)、神經(jīng)活動配體-受體相互作用(Neuroactive Ligand-receptor Interaction)、cGMP-PKG信號通路(cGMP-PKG Signaling Pathway)、癌癥通路(Pathways in Cancer)。見圖3。

圖2 核心靶點GO分析注:紅色表示生物過程,綠色表示細胞組分,藍色表示分子功能

2.4 關(guān)鍵化學成分-核心靶點蛋白-生物通路相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò),共有節(jié)點46個(13種關(guān)鍵化學成分、21種核心靶點蛋白、12種通路),197條連線。核心靶點蛋白中CHEK1、PGR沒有對應(yīng)KEEG通路分析結(jié)果。見圖4。

圖4 關(guān)鍵化學成分-核心靶點蛋白-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)注:綠色節(jié)點代表西洋參關(guān)鍵化學成分,紅色節(jié)點代表黃芪關(guān)鍵化學成分,紫色節(jié)點代表核心蛋白,黃色節(jié)點代表通路

2.5 分子對接 關(guān)鍵化學成分中西洋參度值最高的是Beta-sitosterol,黃芪度值最高的是Quercetin。核心靶點蛋白中,度值前5位的是PTGS2、NCOA2、PTGS1、PRSS1、RXRA。Beta-sitosterol不作用于PRSS1靶點。見表3,圖5。

圖5 β-谷甾醇、槲皮素與靶蛋白分子對接三維模擬

表3 分子對接結(jié)合能

3 討論

益氣生津散是已故名老中醫(yī)王為蘭擬定,經(jīng)夏軍,劉紅旭等結(jié)合臨床實踐[13],遵循中醫(yī)辨證治療原則研制出的茶散劑(由西洋參、黃芪、玉竹、麥冬、石斛、枸杞子、玄參、佛手、砂仁組成),具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴的功效,能降低血糖,改善口干口渴、倦怠乏力等,用于治療氣陰兩虛型消渴病[13-14]。益氣生津散可以降低KKAy小鼠隨機血糖、胰島素抵抗指數(shù)[15]。西洋參-黃芪藥對作為益氣生津散的主要成分,二者相配伍,增強益氣養(yǎng)陰功效。

西洋參-黃芪作用于T2DM的關(guān)鍵化學成分共13種。這提示了西洋參-黃芪在治療T2DM上多成分的特點。其中西洋參關(guān)鍵化學成分共3種,黃芪化學成分10種。西洋參度值最大的成分為β-谷甾醇,黃芪化學成分中度值最高的是槲皮素。β-谷甾醇是一種植物甾醇,具有抗氧化、降低膽固醇、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用[16]。槲皮素是一種黃酮類的化合物,具有降糖[17]、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗菌和保護心血管的作用[18]。

核心靶點分析結(jié)果表明,西洋參-黃芪協(xié)同干預T2DM的前5位核心靶點是:前列腺素G/H合酶2、核受體共激活劑2、前列腺素G/H合酶1、胰蛋白酶-1、視黃醇X受體-alpha,提示西洋參-黃芪藥對可能通過多靶點協(xié)同治療T2DM。分子對接結(jié)果顯示,β-谷甾醇與PTGS2、NCOA2、PTGS1、RXRA,槲皮素與PTGS2、NCOA2、PTGS1、PRSS1、RXRA靶點能穩(wěn)定結(jié)合,并且β-谷甾醇與槲皮素比較,與各受體之間的結(jié)合更穩(wěn)定性。前列腺素G/H合酶又稱環(huán)氧化酶,PTGS2、PTGS1是環(huán)氧化酶的2種同工酶,共同參與前列腺素的合成[19]。PTGS1、PTGS2與T2DM的病因相關(guān)[20-21]。目前PTGS2為靶點的藥物已被應(yīng)用于治療糖尿病[22]。核受體共激活劑2是類固醇類受體共激活因子p160家族之一。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ,PPARγ)的轉(zhuǎn)錄活性受P160家族調(diào)控[23]。PPARγ與脂肪分化相關(guān)。在肥胖小鼠的脂肪組織中核受體輔激活物(Nuclear Receptor Coactivator 2,NCOA2)可以促進3T3-L1細胞的分化;在人脂肪細胞中,NCOA2可促進皮下脂肪前體細胞的分化[24]。胰蛋白酶-1基因可編碼陽離子胰蛋白酶原,胰蛋白酶原由胰腺腺泡細胞合成,以無活性的酶原形式存在于胰液中,隨胰液分泌到小腸,在腸激酶作用下胰蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌竅25]。類視黃醇X受體(Retinoid X Receptor Protein,RXRA)屬于核受體超家族之一,是配體誘導的轉(zhuǎn)錄因子,與不同配體結(jié)合后,可以在體內(nèi)代謝紊亂、心血管疾病、糖尿病、炎癥等疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用[26]。RXRA在腎、表皮、腸、肝臟表達占優(yōu)勢。RXRA拮抗劑可以增加瘦素的敏感性,進而增加胰島素敏感性,從而調(diào)控糖代謝治療糖尿病[27]。

通過對核心靶蛋白進行GO和KEEG通路富集分析,發(fā)現(xiàn)西洋參-黃芪藥對治療T2DM的靶點可能涉及以下3類機制:1)脂肪細胞內(nèi)脂肪分解調(diào)節(jié);2)cGMP-PKG信號通路;3)甲狀腺激素信號通路。脂肪分解是增加T2DM患者游離脂肪酸的重要因素,長期高濃度的游離脂肪酸會增加胰島素抵抗[28]。高濃度葡萄糖也可以刺激脂肪分解,增加游離脂肪酸的水平,并且不能被胰島素抑制[29]。cGMP-PKG信號通路能夠影響胰島素敏感性及糖尿病患者的心肌細胞。cGMP-PKG信號通路使小鼠骨骼肌在收縮數(shù)小時后,胰島素敏感性不受抑制[30]。對糖尿病患者及非糖尿病者的心臟活檢研究顯示,受損的cGMP-PKG信號通路是糖尿病心肌細胞硬化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[31]。并且,cGMP-PKG信號通路也具有保護心血管的作用[32]。甲狀腺激素具有雙向調(diào)節(jié)胰島功能、加速胰島素降解、調(diào)節(jié)胰島素敏感性的作用,并且具有保護腎臟、肝臟的作用[33-35]。甲狀腺功能亢進時,腸道吸收葡萄糖增多,機體內(nèi)糖原異生及其他升糖反應(yīng)的過程都得到過度表達,進一步加重了過高的血糖水平[36],可通過調(diào)節(jié)肝糖原輸出、糖異生量、葡萄糖利用率等機制控制血糖水平[37]。

通過對研究結(jié)果進行分析,發(fā)現(xiàn)西洋參-黃芪在治療T2DM具有多成分、多靶點、多通路的特點,其中核心藥物成分為β-谷甾醇與槲皮素,關(guān)鍵靶點為PTGS2、NCOA2、PTGS1、PRSS1、RXRA,作用機制可能與脂肪細胞內(nèi)脂肪分解調(diào)節(jié)、cGMP-PKG信號通路、甲狀腺激素信號通路關(guān)系密切。然而,考慮到中藥成分的復雜性,網(wǎng)絡(luò)藥理學方法和分子對接技術(shù)的局限性,本文的研究結(jié)果仍需要進一步的試驗驗證。

利益沖突聲明:無。