白仲虎，任和，聶簡琪，孫楊

（1 江南大學(xué)糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122； 2 河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004）

工業(yè)生物技術(shù)、合成生物學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究成果實(shí)現(xiàn)工業(yè)轉(zhuǎn)化的過程工程開發(fā)起始于高性能工業(yè)菌種或細(xì)胞株的建立，其過程一般分為三階段：①海量候選菌種庫的高通量培養(yǎng)篩選；②大量候選菌種的性能評(píng)價(jià)篩選與高性能生產(chǎn)菌種的確定；③高性能工業(yè)菌種的規(guī)?；a(chǎn)工藝的建立。三個(gè)階段所解決問題的側(cè)重點(diǎn)不盡相同，但采用高通量培養(yǎng)技術(shù)是提高每個(gè)階段研發(fā)效率的共同點(diǎn)。

高通量微生物菌種篩選的目的是發(fā)現(xiàn)可以在工業(yè)化生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高產(chǎn)且能耗低的新菌株。但是傳統(tǒng)意義上的高通量克隆篩選一般使用多孔板和搖瓶培養(yǎng)，其培養(yǎng)過程與工業(yè)規(guī)模反應(yīng)器培養(yǎng)過程很不相同，而菌株的表型在不同培養(yǎng)過程中的性能表現(xiàn)也不同，即工業(yè)潛能與培養(yǎng)條件往往密切相關(guān)。傳統(tǒng)的高通量培養(yǎng)技術(shù)為提高通量多采用微小體積培養(yǎng)，包括多孔板或藥瓶培養(yǎng)，受條件限制，這些培養(yǎng)大多要犧牲對(duì)培養(yǎng)過程參數(shù)的全面控制（例如pH的穩(wěn)定控制、DO供應(yīng)穩(wěn)定等），但實(shí)際工業(yè)培養(yǎng)條件與此不同，導(dǎo)致篩選出的菌種在規(guī)?；囵B(yǎng)時(shí)未必能給出篩選培養(yǎng)階段的優(yōu)異表現(xiàn)。因此，需要在高通量篩選培養(yǎng)時(shí)開展培養(yǎng)過程工程驅(qū)動(dòng)的篩選，即盡量模擬規(guī)?；囵B(yǎng)的條件（稱之為“工業(yè)相似”的培養(yǎng)）開展對(duì)候選菌種庫的高效率性能評(píng)價(jià)。所以，實(shí)現(xiàn)微小體積培養(yǎng)條件下對(duì)過程參數(shù)的有效控制是推動(dòng)平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)（in-parallel fermentation）在代謝工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵點(diǎn)之一。

1 平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)與平行反應(yīng)器

平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的定義為：在具有在線多參數(shù)與離線多參數(shù)采集的多個(gè)微型（1～50 mL培養(yǎng)體積）或小型（100～1000 mL培養(yǎng)體積）生物反應(yīng)器上，平行地開展多個(gè)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)；或針對(duì)一個(gè)克?。ň辏╅_展多個(gè)發(fā)酵條件下平行培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)。很明顯，平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用目的包括兩個(gè)方面：一是對(duì)多個(gè)候選克隆開展同一發(fā)酵條件下的平行培養(yǎng)，對(duì)比候選克隆在所謂“工業(yè)相似”條件下的性能，對(duì)候選菌種庫依據(jù)工業(yè)性能排序［1］；另一個(gè)是通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（design of experiment， DoE），平行開展DoE方案所設(shè)計(jì)的不同培養(yǎng)條件下克隆或菌株在具備工業(yè)環(huán)境的反應(yīng)器內(nèi)的發(fā)酵性能研究，從而發(fā)現(xiàn)影響菌種克隆工業(yè)性能的關(guān)鍵過程參數(shù)和參數(shù)之間的交互作用，并確定菌種的培養(yǎng)工藝條件［2-3］。需要強(qiáng)調(diào)的是平行發(fā)酵技術(shù)在實(shí)現(xiàn)真正的“平行培養(yǎng)”時(shí)，需要滿足3個(gè)基本要素：出發(fā)細(xì)胞株和種子培養(yǎng)液的一致性、平行培養(yǎng)的多個(gè)反應(yīng)器性能的一致性、培養(yǎng)過程參數(shù)檢測(cè)和分析的一致性。

進(jìn)入21世紀(jì)，在生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究領(lǐng)域，顯著縮短“從DNA到上市的蛋白質(zhì)藥物”的生物新藥創(chuàng)制時(shí)間歷程已成為醫(yī)藥行業(yè)在商業(yè)上的共識(shí)。同時(shí)根據(jù)ICH Q8［4］的建議：生物醫(yī)藥的過程研發(fā)要基于牢固的科學(xué)知識(shí)，即建立對(duì)產(chǎn)品和過程的科學(xué)理解——QbD導(dǎo)向的生物醫(yī)藥過程開發(fā)新理念，所以在候選分子的評(píng)價(jià)、生產(chǎn)用細(xì)胞株高效篩選和建立培養(yǎng)關(guān)鍵過程參數(shù)的設(shè)計(jì)空間（design space）工作中，采用平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)開展DoE實(shí)驗(yàn)，提高過程研究的效率和成功率已成為了生物制藥領(lǐng)域的通行方法，同時(shí)也推動(dòng)了平行發(fā)酵與平行細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在多個(gè)方面的進(jìn)步。近10年來，微生物代謝工程所設(shè)計(jì)和合成生物學(xué)研究所構(gòu)建的細(xì)胞克隆，都需要開展“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”（DBTL）數(shù)據(jù)科學(xué)驅(qū)動(dòng)的研究循環(huán)［5-8］，所以已經(jīng)發(fā)展成熟的平行發(fā)酵培養(yǎng)系統(tǒng)，就自然介入高效篩選與評(píng)價(jià)海量基因型菌株庫和開發(fā)適配工業(yè)表型菌株的規(guī)?；a(chǎn)工藝。同時(shí)也針對(duì)以微生物菌種為主的合成生物學(xué)過程工程研究的需要，對(duì)平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了相應(yīng)技術(shù)改進(jìn)［9-10］?？偠灾?，在菌種篩選評(píng)價(jià)和早期過程工藝的開發(fā)中，平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)可以有力支持回答下列科學(xué)技術(shù)問題：

（1）如何高效、快速、高通量地評(píng)價(jià)大量候選細(xì)胞克隆的生物學(xué)功能和目標(biāo)產(chǎn)品的合成效能？

（2）如何高通量地驗(yàn)證承載人工設(shè)計(jì)代謝路線的大量細(xì)胞克隆在工業(yè)化環(huán)境反應(yīng)器內(nèi)的表現(xiàn)？

（3）如何高通量地揭示細(xì)胞工廠的運(yùn)行機(jī)理和構(gòu)造原理，實(shí)現(xiàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，提高元件、底盤細(xì)胞的合成能力和過程調(diào)控能力？

（4）如何在高性能新菌種克隆確定后，高效率地建立最優(yōu)化的生產(chǎn)過程工藝？

平行發(fā)酵（細(xì)胞培養(yǎng)）系統(tǒng)或裝置是由一組多個(gè)并行的微小型生物反應(yīng)器、過程參數(shù)控制單元、在線傳感器組、過程數(shù)據(jù)處理與分析軟硬件系統(tǒng)、DoE工具、樣品自動(dòng)采集等多個(gè)單元功能有機(jī)組成的實(shí)驗(yàn)臺(tái)規(guī)模的多聯(lián)罐體集成培養(yǎng)系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)的核心原則就是要在高通量平行培養(yǎng)的狀態(tài)下，最大化模擬工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)條件，即實(shí)現(xiàn)高通量培養(yǎng)的“工業(yè)相似性”。根據(jù)反應(yīng)器的培養(yǎng)體積，平行發(fā)酵技術(shù)系統(tǒng)可以分兩類。

第一類為微型反應(yīng)器（miniature bioreactor）的平行發(fā)酵系統(tǒng)，單個(gè)反應(yīng)器體積一般小于100 mL，甚至到微升規(guī)模。這種平行發(fā)酵系統(tǒng)由于培養(yǎng)體積小，平行操作的反應(yīng)器數(shù)量高（≥24個(gè)/單元設(shè)備）。雖然微型生物反應(yīng)器平行培養(yǎng)通量高，但也由于體積小，在線或離線過程數(shù)據(jù)采集能力有限，實(shí)施過程精準(zhǔn)控制也更為困難，可獲取的過程數(shù)據(jù)少。然而，培養(yǎng)成本低是微型平行培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。目前這類平行培養(yǎng)反應(yīng)器的典型代表是BioLectorTM（德國M2P）［11］和amber 15TM（德國Sartorius）［12］。

另一類是基于小型生物反應(yīng)器（MicroBioreactor，MBR）的平行多聯(lián)罐發(fā)酵系統(tǒng)，反應(yīng)器體積一般在100～1000 mL之間，反應(yīng)器平行操作數(shù)量一般≥8個(gè)/單元［13］。增大小型生物反應(yīng)器的培養(yǎng)體積，雖然培養(yǎng)通量有所降低，但是可承載的在線傳感器數(shù)量增加，反應(yīng)器結(jié)構(gòu)和過程參數(shù)的控制也近乎完全模擬規(guī)?；囵B(yǎng)，所以在線、離線過程數(shù)據(jù)的采集能力也得到提高，過程數(shù)據(jù)較豐富，可以支撐建立過程數(shù)據(jù)庫和培養(yǎng)過程批次數(shù)據(jù)模型。目前這一類平行發(fā)酵反應(yīng)器的典型代表是DasgipTM（德國Eppendorf）、MinBioTM（荷蘭Applikon）和amber 250TM（德國Sartorius）。

近幾年國內(nèi)也有多個(gè)發(fā)酵罐制造廠家在研發(fā)推廣多個(gè)型別的平行發(fā)酵系統(tǒng)（培養(yǎng)體積一般在100 mL以上），尤其是在微生物平行培養(yǎng)系統(tǒng)中取得了顯著的成績。但是，目前國產(chǎn)平行生物反應(yīng)器在反應(yīng)器微型化（毫升級(jí)培養(yǎng)體積）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用的平行反應(yīng)器以及一次性平行生物反應(yīng)器方面還存在許多的不足。

如果按照平行培養(yǎng)的細(xì)胞種類來分，平行培養(yǎng)系統(tǒng)可以簡單分為微生物培養(yǎng)用的微小型平行發(fā)酵罐和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用的平行細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器兩大類。微生物生長快，單位時(shí)間內(nèi)代謝強(qiáng)度大，導(dǎo)致單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)熱多、耗氧多、底物消耗快，所以傳質(zhì)與混合的操作壓力大，過程參數(shù)的控制要求高；而哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長緩慢、易染菌、需要CO2、接種量大，有可能需要采用灌流培養(yǎng)策略等。所以，在微小型反應(yīng)器罐體設(shè)計(jì)和控制方面多有不同，典型的差別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是干細(xì)胞和類器官等原代細(xì)胞培養(yǎng)多用一次性的反應(yīng)器罐體，培養(yǎng)過程一般不需要加堿調(diào)控pH值，培養(yǎng)中攪拌速率低［14］。但無論是微生物細(xì)胞還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，目前平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)都更多關(guān)注于多罐體的平行多元過程數(shù)據(jù)的在線采集能力、大數(shù)據(jù)處理能力甚至云端的大數(shù)據(jù)存儲(chǔ)與共享能力等方面，其驅(qū)動(dòng)力來自智能綠色生物制造技術(shù)發(fā)展的需要［15-17］。

2 平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的菌種篩選評(píng)價(jià)“三段論”

起始于多基因型候選菌種庫的建立，中間經(jīng)過表型菌種的重重篩選，結(jié)束于最優(yōu)的高性能菌種的確定并建立適配的規(guī)模化生產(chǎn)工藝，這個(gè)完整的高性能菌種篩選過程可以分為三個(gè)階段（可以稱之為菌種篩選的“三段論”），具體步驟為：第一階段，海量高通量菌種評(píng)價(jià)與篩選，主要聚焦在最關(guān)注的菌種特征，比如產(chǎn)量和產(chǎn)率等——特征篩選；第二階段，多候選菌種的性能評(píng)價(jià)篩選，使用平行發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)候選菌種，在“工業(yè)相似”條件下評(píng)價(jià)菌種的性能——評(píng)價(jià)篩選；第三階段，高性能工業(yè)菌種的確定與適配優(yōu)化工藝的建立——過程篩選。特征不同的平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)分別用于菌種篩選的三段論。

第一階段是面對(duì)數(shù)以萬計(jì)（菌種數(shù)N=1000～10 000）的多基因型菌種克隆，完成表型對(duì)比與性能定量評(píng)價(jià)，通過特征篩選，將候選菌種數(shù)量降低到可以開展模擬工業(yè)培養(yǎng)條件下的可控制培養(yǎng)的水平，即千百級(jí)菌種數(shù)量（N=100～1000）。這個(gè)階段的工作對(duì)應(yīng)于DBTL循環(huán)中的“設(shè)計(jì)”（D）和“構(gòu)建”（B）。為實(shí)現(xiàn)高通量培養(yǎng)篩選，可以設(shè)計(jì)皮升、納升、微升等不同體積大小的液滴作為微型反應(yīng)器，將單細(xì)胞包裹其中實(shí)現(xiàn)超高通量的并行培養(yǎng)和測(cè)試，其培養(yǎng)效率高并可自動(dòng)化操作［18-20］。但該過程還要面對(duì)諸多關(guān)鍵科學(xué)技術(shù)難題，包括：如何針對(duì)不同類型微生物，構(gòu)建穩(wěn)定的培養(yǎng)空間、底物、溶氧等液滴環(huán)境；微液滴體系采用油包水結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)微生物高通量平行培養(yǎng)，單克隆菌株、底物、代謝物均包裹于液滴之中，如何利用非侵入式光學(xué)檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株生長和生產(chǎn)特征參數(shù)的檢測(cè)；如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長、底物耐受、代謝物合成等工業(yè)表型的高效、穩(wěn)定傳感檢測(cè)等［21-23］。

第二階段是評(píng)價(jià)篩選，要解決候選菌種在可控制的培養(yǎng)條件下，即模擬工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)條件下，對(duì)有潛力表型菌種的表現(xiàn)評(píng)價(jià)。這一階段所處理的菌種數(shù)量分布范圍從100到1000個(gè)初步選定的高性能工業(yè)菌種，對(duì)應(yīng)于DBTL循環(huán)中的“測(cè)試”（T）和“學(xué)習(xí)”（L）環(huán)節(jié)。基于微型生物反應(yīng)器（毫升級(jí)）的平行發(fā)酵培養(yǎng)裝置主要用于這個(gè)階段的研發(fā)實(shí)驗(yàn)需求。通過使用微型的平行發(fā)酵生物反應(yīng)器，針對(duì)候選高性能菌種庫，在相對(duì)模擬工業(yè)化培養(yǎng)的條件下，開展以克隆的穩(wěn)定性和產(chǎn)品的產(chǎn)量、產(chǎn)率、質(zhì)量、能耗和成本等為篩選目標(biāo)的過程工程驅(qū)動(dòng)的高通量評(píng)價(jià)，篩選出工業(yè)性能最好的一組生產(chǎn)菌種（N=10）［24-25］。同時(shí)通過對(duì)多元過程參數(shù)的在線采集，建立與表型克隆相關(guān)聯(lián)的早期過程數(shù)據(jù)庫。

第三階段是在完全模擬規(guī)模化培養(yǎng)的條件下，使用小型平行生物反應(yīng)器的平行培養(yǎng)裝置（培養(yǎng)體積100～1000 mL），通過DoE開展以過程表現(xiàn)和目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量為篩選目標(biāo)的過程驅(qū)動(dòng)的高通量評(píng)價(jià)，在第二階段所篩選出的最好的一組表型克隆（N=10）中，確定工業(yè)性能最好的生產(chǎn)菌種（N=1）［26-27］。同時(shí)通過對(duì)DoE實(shí)驗(yàn)批次的多元過程參數(shù)的在線采集，建立平行培養(yǎng)的過程大數(shù)據(jù)庫，并建立平行培養(yǎng)的過程批次過程數(shù)據(jù)模型，包括過程縮小模型、關(guān)鍵過程參數(shù)的設(shè)計(jì)空間、批次多變?cè)^程模型。這個(gè)階段的工作主要對(duì)應(yīng)于DBTL循環(huán)中的“學(xué)習(xí)”（L）環(huán)節(jié)，也是DBTL循環(huán)的最終出口，實(shí)現(xiàn)了快速“從單克隆到規(guī)?；^程工藝”的生物過程工程開發(fā)的目標(biāo)。

基于平行培養(yǎng)技術(shù)的高通量菌種篩選的三段論策略所包括的平行培養(yǎng)技術(shù)特征、培養(yǎng)目的、培養(yǎng)通量和在DBTL循環(huán)中的節(jié)點(diǎn)，概括如圖1所示。

圖1 平行培養(yǎng)技術(shù)的高通量高效率菌種篩選的三段論策略［13］Fig. 1 Three-stage strategy for high-throughput and high-efficiency strain screening by in-parallel cultivation technology[13]

3 平行發(fā)酵培養(yǎng)的工業(yè)相似性原則的實(shí)施

平行發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量菌種篩選的挑戰(zhàn)之一是如何確保高通量培養(yǎng)的菌種基于克隆表型特征（如目標(biāo)產(chǎn)品生產(chǎn)能力、目標(biāo)產(chǎn)品得率和收率等）的排序（ranking）與其未來在規(guī)?；囵B(yǎng)條件下的排序一致。挑戰(zhàn)之二是如何在較短的時(shí)間內(nèi)，高效率地挖掘出最優(yōu)的候選菌株，并同步建立可以指導(dǎo)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的過程工藝［28-29］。導(dǎo)致這兩個(gè)挑戰(zhàn)的主因均是來自高通量平行培養(yǎng)是否能夠?qū)崿F(xiàn)“工業(yè)相似”下的培養(yǎng)過程。工業(yè)菌種潛能的實(shí)現(xiàn)與反應(yīng)器過程參數(shù)的控制密切相關(guān)，如果可以模擬工業(yè)培養(yǎng)條件，則在菌種克隆的高通量培養(yǎng)時(shí)，就能精準(zhǔn)挖掘出可工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)的菌種，獲得關(guān)鍵過程參數(shù)對(duì)目標(biāo)參數(shù)的影響規(guī)律。因此微小型生物反應(yīng)器的高通量平行發(fā)酵能否實(shí)現(xiàn)“工業(yè)相似”的培養(yǎng)條件顯得尤其關(guān)鍵。

工業(yè)相似性的高通量篩選策略是可以貫穿到從菌種篩選到過程工藝開發(fā)的整個(gè)流程，但是考慮到現(xiàn)有技術(shù)可行性的問題，工業(yè)相似性的“相似度”會(huì)隨著平行培養(yǎng)通量的提高而顯著降低［1，13］。在基于微流控液滴高通量培養(yǎng)的特征篩選階段，以目前的技術(shù)水平，也只能做到少量幾個(gè)過程參數(shù)的控制，比如溫度、pH等。在基于微型生物反應(yīng)器的“評(píng)價(jià)篩選”階段，在微小體積（≤50 mL）的培養(yǎng)過程中，目前只能較低水平地模擬規(guī)?；囵B(yǎng)條件，對(duì)數(shù)以百計(jì)的菌種克隆開展平行評(píng)價(jià)。隨著小型生物反應(yīng)器技術(shù)的進(jìn)步，目前小型反應(yīng)器的平行發(fā)酵裝置在升（L）級(jí)別的培養(yǎng)體積下，可以認(rèn)為已完全解決“工業(yè)相似”的平行培養(yǎng)。但是，培養(yǎng)通量與工業(yè)相似度的反比問題，可以通過篩選過程的技術(shù)策略優(yōu)化來解決，至少是部分解決［30-31］。這個(gè)技術(shù)策略具體如下：

“特征篩選”聚焦克隆的基因型和表型，在微流控液滴高通量培養(yǎng)和高通量在線檢測(cè)的技術(shù)手段基礎(chǔ)上，將菌種克隆數(shù)從海量N=1000～100 000級(jí)降低到N=100～1000級(jí)。在這個(gè)階段平行發(fā)酵的邏輯是發(fā)現(xiàn)一組有成為優(yōu)秀工業(yè)菌種潛質(zhì)的“較”優(yōu)秀候選克隆。這里有可能會(huì)錯(cuò)過在規(guī)?；磻?yīng)器內(nèi)表現(xiàn)絕對(duì)第一的克隆，但是獲得了極高的篩選效率。

“評(píng)價(jià)篩選”聚焦克隆表型和表型的穩(wěn)定性，使用毫升級(jí)微孔培養(yǎng)板或微型生物反應(yīng)器的高通量平行發(fā)酵，并實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)和（或）控制微型生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)介質(zhì)的pH、DO和底物濃度，開展以目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量和生物量為目標(biāo)的高通量菌種性能評(píng)價(jià)篩選，獲得基本過程數(shù)據(jù)。從N=100～1000的候選菌種克隆中，降維篩選出一組N=10～100級(jí)的候選高性能菌種。在這個(gè)階段平行發(fā)酵的邏輯是在一組“較”優(yōu)秀的候選菌種中，實(shí)施（部分）“工業(yè)相似”條件下的高通量平行發(fā)酵，進(jìn)一步篩選出有可能在規(guī)?；磻?yīng)器內(nèi)表現(xiàn)較好的潛在克隆，并獲得了極高的篩選效率。

由于微生物菌種篩選有“生產(chǎn)潛力”與“生長能力”兩個(gè)目的指標(biāo)，其中工業(yè)菌種生產(chǎn)潛能要通過內(nèi)因（基因型）和外因（培養(yǎng)過程條件）的協(xié)同作用，通過優(yōu)秀的可生長性來實(shí)現(xiàn)，因此前述“特征篩選”和“評(píng)價(jià)篩選”仍無法正確回答這個(gè)問題?！斑^程工程篩選”聚焦在克隆表型在反應(yīng)器內(nèi)表現(xiàn)特征：使用小型平行發(fā)酵生物反應(yīng)器，針對(duì)候選高性能菌種（N=10～100），在完全模擬規(guī)?；囵B(yǎng)的條件下，通過DoE開展以過程表現(xiàn)為篩選目標(biāo)的過程驅(qū)動(dòng)的高通量評(píng)價(jià)，達(dá)到在較短的時(shí)間內(nèi)，篩選出工業(yè)性能最好的生產(chǎn)菌種（N=1），作為工業(yè)菌種。

4 平行發(fā)酵培養(yǎng)與使用DoE的高效過程工程開發(fā)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）是研究過程輸入?yún)?shù)與過程輸出目標(biāo)參數(shù)之間關(guān)系的一種科學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，通過建立兩者之間的定量數(shù)學(xué)關(guān)系來實(shí)現(xiàn)對(duì)過程的深刻理解。DoE可以顯著提高發(fā)酵過程工藝的開發(fā)。傳統(tǒng)的發(fā)酵過程開發(fā)包括初期菌種篩選和培養(yǎng)基的選擇、搖瓶培養(yǎng)中進(jìn)行二次篩選或培養(yǎng)條件優(yōu)化，最終將最佳條件放大到中試與生產(chǎn)規(guī)模（圖2）［13］。為實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)過程的充分理解，需要多個(gè)過程因素的測(cè)試分析。傳統(tǒng)的單因素實(shí)驗(yàn)（onefactor-at-a-time，OFAT）雖簡單易行，但會(huì)增加實(shí)驗(yàn)次數(shù)，耗時(shí)長且無法評(píng)估因素之間的交叉作用。今日的生物過程工程開發(fā)理念，需要在菌種篩選階段就對(duì)菌種與發(fā)酵過程參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)（即菌種、過程與產(chǎn)品）進(jìn)行科學(xué)深入的理解。在評(píng)價(jià)篩選與過程篩選階段使用DoE策略，確定關(guān)鍵過程參數(shù)。DoE的核心是可以系統(tǒng)地研究關(guān)鍵過程參數(shù)（CPPs）與關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）之間的關(guān)系。與OFAT方法相比，DoE可以提供更準(zhǔn)確的結(jié)論。此外，DoE的實(shí)施減少了培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的罐批數(shù)量，并可以通過建立多參數(shù)的線性模型，提供更多的統(tǒng)計(jì)分析信息，分析出多個(gè)關(guān)鍵參數(shù)之間的相互作用，建立對(duì)多個(gè)目標(biāo)參數(shù)（產(chǎn)率與質(zhì)量）工藝條件優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)模型，指導(dǎo)建立過程設(shè)計(jì)空間［32-34］。

圖2 傳統(tǒng)的生物過程工程研發(fā)途徑與使用平行發(fā)酵技術(shù)實(shí)施DoE的過程工程研發(fā)路徑［13］Fig. 2 Comparison between traditional roadmap of bioprocess R&D and the new approach using DoE implemented by in parallel fermentation system[13]

可實(shí)施工業(yè)相似培養(yǎng)的平行發(fā)酵裝置是開展DoE實(shí)驗(yàn)的必需品，比如一個(gè)3參數(shù)包括中間值的全因子DoE至少需要24個(gè)平行培養(yǎng)。目前成熟的平行發(fā)酵系統(tǒng)都內(nèi)置有DoE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)功能。例如德國Sartorius公司的ambr250TM系統(tǒng)已將MODDE軟件內(nèi)置到其控制軟件中［35-36］，通過平行系統(tǒng)的操作界面可快速開展DoE實(shí)驗(yàn)條件的設(shè)置，并自動(dòng)將設(shè)置的工藝參數(shù)下發(fā)到平行培養(yǎng)的控制系統(tǒng)，驅(qū)動(dòng)操作軟件實(shí)施對(duì)過程參數(shù)的設(shè)定與執(zhí)行。在培養(yǎng)結(jié)束后，可通過軟件對(duì)培養(yǎng)過程數(shù)據(jù)和目標(biāo)參數(shù)結(jié)果進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)分析。如果已商業(yè)化的平行發(fā)酵系統(tǒng)還沒有內(nèi)嵌DoE功能模塊，需借助第三方DoE軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)，并將所需實(shí)驗(yàn)條件手動(dòng)設(shè)置到平行培養(yǎng)操作控制系統(tǒng)。在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集，通過Excel導(dǎo)入DoE軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

5 平行發(fā)酵培養(yǎng)與多變?cè)文Ｐ?/h2>

多變?cè)獢?shù)據(jù)分析（multivariate data analysis，MVDA）在QbD驅(qū)動(dòng)的生物醫(yī)藥過程工程研發(fā)策略，在合成生物學(xué)研究中過程工程導(dǎo)向的菌種篩選評(píng)價(jià)上發(fā)揮著越來越關(guān)鍵的作用。因?yàn)镸VDA能夠?qū)⑦^程分析技術(shù)（process analytical technology，PAT）生成的大量隨發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的在線和離線參數(shù)檢測(cè)結(jié)果，轉(zhuǎn)換處理成分類的關(guān)鍵過程信息［37-39］。由于早期采用了工業(yè)相似的平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，在過程開發(fā)的初始階段可能采集到1～1000 mL培養(yǎng)水平上的多元過程參數(shù)變化數(shù)據(jù)。但是在菌種克隆評(píng)價(jià)階段，表型菌種克隆眾多，過程數(shù)據(jù)是海量的，而這些數(shù)據(jù)所描述的培養(yǎng)過程特征，往往又是所篩選的高性能表型菌種在未來工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)能力的一個(gè)外部條件，致使現(xiàn)實(shí)情況是高通量平行發(fā)酵的培養(yǎng)條件與中試和生產(chǎn)規(guī)模培養(yǎng)條件總會(huì)存在差異。如何判斷這些條件和參數(shù)的差異是否會(huì)影響到所篩選到的高性能表型菌種的表現(xiàn)，成為在高通量平行發(fā)酵培養(yǎng)階段需要給出答案的關(guān)鍵問題。而多變?cè)獢?shù)據(jù)分析（MVDA）與多變?cè)^程批次模型（PLS-MVD batch model）是解決這個(gè)問題的一個(gè)有效方法。

在高通量平行發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，一般會(huì)有大量的DoE培養(yǎng)批次，多個(gè)過程參數(shù)會(huì)在一定范圍內(nèi)人為設(shè)計(jì)變化，所以在基于平行發(fā)酵的DoE實(shí)驗(yàn)批次上，采集盡量完善的多元過程參數(shù)數(shù)據(jù)并實(shí)施MVDA分析，建立PLS-MVD批次模型，就可以在建立過程設(shè)計(jì)空間的同時(shí)，揭示多元過程輸入?yún)?shù)和輸出變量（產(chǎn)率與質(zhì)量）之間可能的相互作用信息。對(duì)比“好”培養(yǎng)批次（輸出參數(shù)符合要求）和“壞”培養(yǎng)批次（輸出參數(shù)不符合要求）的PLS-MVD模型，就可以發(fā)現(xiàn)過程參數(shù)在培養(yǎng)過程中某個(gè)節(jié)點(diǎn)的變化或者持續(xù)的變化，對(duì)培養(yǎng)目標(biāo)參數(shù)的影響。換言之，基于平行發(fā)酵培養(yǎng)的數(shù)據(jù)所建立的PLS-MVD批次模型，能夠識(shí)別過程參數(shù)變化的極限范圍和未來發(fā)生細(xì)胞培養(yǎng)過程事故的原因，這是進(jìn)一步開發(fā)準(zhǔn)確控制的規(guī)?；囵B(yǎng)過程的關(guān)鍵過程信息。這里所描述的用于多變?cè)治龊团文Ｐ徒⒌倪^程數(shù)據(jù)采集，過程和內(nèi)容如圖3所示。目前有多個(gè)商業(yè)化的軟件，例如SIMCA+，可以用于多變?cè)臄?shù)據(jù)分析和模型建立。

圖3 培養(yǎng)過程數(shù)據(jù)采集的示意圖［37］Fig. 3 Schematic diagram of data collection from bioprocesses[37]

使用平行發(fā)酵技術(shù)，建立PLS-MVD過程批次模型的操作流程一般是：

（1）批次輸入變量的收集（inputs） 盡可能地采用PAT技術(shù)，收集完善的每一批次的在線過程參數(shù)隨時(shí)間的變化數(shù)據(jù)；收集起始批次數(shù)據(jù)，包括培養(yǎng)基、接種量、種子的質(zhì)量指標(biāo)等。

（2）批次輸出變量（outputs）的采集 建立完善的培養(yǎng)終點(diǎn)數(shù)據(jù)，包括產(chǎn)物濃度和質(zhì)量指標(biāo)參數(shù)、生物量、活細(xì)胞比例等。

（3）數(shù)據(jù)預(yù)處理和變量選擇 所有輸入與輸出數(shù)據(jù)在excel表格中進(jìn)行處理，要完成規(guī)范化（normalization），根據(jù)情況可以選擇要輸入SIMICA+軟件的數(shù)據(jù)，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件。

（4）多變?cè)治龊投嘧冊(cè)芜^程模型的建立 在SIMICA+軟件中完成多變?cè)治龊团蜯VD模型的建立。多變?cè)治隹梢园l(fā)現(xiàn)不同過程參數(shù)對(duì)與過程輸出參數(shù)的響應(yīng)關(guān)系分類和程度排序。PLS-MVA模型可以用于建立Scale down模型，指導(dǎo)建立過程設(shè)計(jì)空間。批次PLS-MVA 模型最主要的用途是可以實(shí)施對(duì)過程質(zhì)量的實(shí)時(shí)監(jiān)控，依據(jù)批次輸出參數(shù)，分類“好”批次與“壞”批次，發(fā)現(xiàn) “好、壞”批次的MVA特征，并確定導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果不同的根本原因。圖4描述了這種“好”批次和“壞”批次的對(duì)比分析方式。

圖4 “好”的培養(yǎng)批次與“壞”批次培養(yǎng)的過程批次數(shù)據(jù)的展開，并進(jìn)行模型對(duì)比示意圖［37］Fig. 4 Schematic diagram of unfolding and comparing the batch models of the processes of “good” and “bad” batches[37]

6 平行發(fā)酵培養(yǎng)與過程縮小模型的建立

基于微小型生物反應(yīng)器的平行發(fā)酵裝備和過程縮小模型（scale down model）是偶聯(lián)在一起的兩項(xiàng)技術(shù)［40-43］，前者是指儀器裝備，后者是技術(shù)方法，都是執(zhí)行工業(yè)相似條件下高通量過程工程開發(fā)策略的關(guān)鍵要素。菌種篩選與過程工程研究通過平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模高效進(jìn)行，但是如何確保微小生物反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)的過程工藝可以直接快速地放大到規(guī)?；囵B(yǎng)，是通過建立過程縮小模型來實(shí)現(xiàn)的。因此在工業(yè)相似的高通量培養(yǎng)理念下，建立一個(gè)具有代表性的縮小（scale down）模型對(duì)高通量培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；^程成功表征至關(guān)重要。

生物過程工程的過程縮小模型對(duì)過程的表征包括三個(gè)方面：①高通量微型平行生物反應(yīng)器所建立的培養(yǎng)過程工藝與規(guī)?；囵B(yǎng)下的工藝，在決定性影響過程目標(biāo)參數(shù)的關(guān)鍵過程參數(shù)上能夠保持統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相似性［44-45］；②如果在高通量培養(yǎng)下建立了過程多變?cè)^程批次模型（PLS-MVA），那么它與規(guī)?；囵B(yǎng)條件下的多變?cè)芜^程模型，在主元分析（principle component analysis， PCA）上要表現(xiàn)出一致性；③高通量平行培養(yǎng)與規(guī)模化培養(yǎng)的關(guān)鍵過程參數(shù)設(shè)計(jì)空間要一致。

縮小模型的建立，首先要基于對(duì)同一種細(xì)胞的培養(yǎng)，通過高通量培養(yǎng)的DoE實(shí)驗(yàn)，采集過程參數(shù)，建立過程DoE優(yōu)化模型，進(jìn)一步建立過程設(shè)計(jì)空間，并建立多變?cè)^程模型［46-48］。然后要在規(guī)?；囵B(yǎng)上完成同樣的多變?cè)^程批次模型的建立工作，再對(duì)微型培養(yǎng)和規(guī)模培養(yǎng)的過程模型與設(shè)計(jì)空間進(jìn)行數(shù)據(jù)的對(duì)比。如果對(duì)比結(jié)果一致，就針對(duì)該細(xì)胞種類，在所使用的微型平行發(fā)酵裝置上，建立一個(gè)成功的過程縮小模型。如果改變細(xì)胞種類，過程縮小模型需要開展上述同樣的研究，然后建立新的縮小模型。所以過程縮小模型包括三個(gè)基本要素：細(xì)胞種類、平行發(fā)酵培養(yǎng)過程與規(guī)模化培養(yǎng)過程。

規(guī)?；囵B(yǎng)裝置與工藝要根據(jù)平行發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行選擇與設(shè)計(jì)，這種情況下的過程縮小模型的建立，技術(shù)策略與傳統(tǒng)的過程放大類似。首先是線性放大與規(guī)模相關(guān)的操作參數(shù)，同時(shí)將與規(guī)模無關(guān)的參數(shù)保持在與高通量平行發(fā)酵工藝相同的控制設(shè)定點(diǎn)。對(duì)于微生物發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)過程，與規(guī)模無關(guān)的參數(shù)包括工藝溫度、pH值、DO、接種量（體積分?jǐn)?shù)）以及流加培養(yǎng)基的時(shí)間與營養(yǎng)物流加策略等。如果不同培養(yǎng)規(guī)模的氧氣傳輸速率相等，則溶解氧控制設(shè)定值和罐壓也應(yīng)保持恒定［49-51］。然后開展過程表征的研究：對(duì)比過程多變?cè)^程批次模型，規(guī)?；囵B(yǎng)與平行發(fā)酵的模型要匹配；對(duì)比“設(shè)計(jì)空間”，在該空間內(nèi)，過程可以在產(chǎn)品目標(biāo)和過程一致性方面以可接受的方式運(yùn)行。完成了這些工作，就在規(guī)?；囵B(yǎng)和微小型平行培養(yǎng)之間建立起了一個(gè)過程縮小模型。

使用平行發(fā)酵技術(shù)建立生物過程縮小（scale down）模型在生物醫(yī)藥的過程開發(fā)中已積累了許多成功的案例。例如在一個(gè)CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程特征的研究中［52］，使用5 L生物反應(yīng)器對(duì)數(shù)個(gè)工藝參數(shù)展開多工藝條件的培養(yǎng)，通常需要幾個(gè)月的時(shí)間來完成，但是在使用微型生物反應(yīng)器（ambr15TM）后，在一個(gè)月內(nèi)就可結(jié)束過程特征的表征，并且能同步建立針對(duì)關(guān)鍵過程參數(shù)的過程控制策略。該研究策略就是使用ambr15平行培養(yǎng)系統(tǒng)，先應(yīng)用過程多變?cè)治黾夹g(shù)建立細(xì)胞培養(yǎng)過程的縮小模型，模型要證明amber15的15 mL規(guī)模培養(yǎng)與5 L實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和1500 L生產(chǎn)規(guī)模有高度的相似性。具體地，通過應(yīng)用amber15，在15 mL規(guī)模上開展過程特性的DoE研究，建立多變?cè)^程批次模型，確定關(guān)鍵過程參數(shù)和設(shè)計(jì)空間。再通過與5 L規(guī)模實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的DoE數(shù)據(jù)和多變?cè)^程模型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)培養(yǎng)規(guī)模系統(tǒng)之間的過程參數(shù)對(duì)過程的產(chǎn)量和質(zhì)量的影響相似，說明ambr15高通量系統(tǒng)能夠取代5 L規(guī)模反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室過程特性表征。

7 結(jié)語與展望

在工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，生物信息、基因編輯、全基因組測(cè)序以及合成生物學(xué)等技術(shù)的穩(wěn)步進(jìn)展，使計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、全基因組人工合成變?yōu)榭赡?。工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)進(jìn)入工程化與設(shè)計(jì)化的全新模式，人們可以設(shè)計(jì)細(xì)胞工廠，可以在前所未有的短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建表達(dá)多層級(jí)異源生物合成途徑的大型菌株庫。所以工業(yè)生物技術(shù)的“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”（DBTL）周期中D和B的階段顯著加速，使得T和L階段在合成細(xì)胞工廠開發(fā)中的速度越來越成為限制性因素。要提高T與L環(huán)節(jié)的效率和成功率，過程工藝開發(fā)的初始階段就必須要開展充分的菌種篩選，并實(shí)施關(guān)鍵過程工藝參數(shù)的早期挖掘。微型生物反應(yīng)器的平行發(fā)酵培養(yǎng)系統(tǒng)正越來越多地應(yīng)用于各類菌種庫的早期篩選與評(píng)價(jià)，這種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)過程工程導(dǎo)向的高通量菌種篩選評(píng)價(jià)。通過將平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)與DoE方法相結(jié)合，可以進(jìn)一步最大化地研究多菌種的過程表象，進(jìn)一步提高T與L的效率。平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)支撐的DoE有助于系統(tǒng)地評(píng)估交互作用中的因素，并有助于更深入地探索關(guān)鍵過程參數(shù)設(shè)計(jì)空間。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器培養(yǎng)是合成生物學(xué)研究中菌株評(píng)價(jià)的最后一步，提供了工業(yè)相似條件下菌種性能的真實(shí)數(shù)據(jù)。如今一個(gè)代謝工程研究機(jī)構(gòu)每年通常篩選數(shù)百萬株或更多的菌株，如果使用傳統(tǒng)的臺(tái)式發(fā)酵罐培養(yǎng)篩選，即便投入龐大數(shù)量的發(fā)酵罐和大量的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)也難以完成?，F(xiàn)在，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器和微孔培養(yǎng)板的高通量培養(yǎng)之間，已建立了全自動(dòng)的微、小型化的平行培養(yǎng)技術(shù)和裝置，成為顯著提高合成生物學(xué)和代謝工程中對(duì)候選菌種開展過程工程導(dǎo)向的評(píng)價(jià)篩選效率的強(qiáng)大工具。雖然這些系統(tǒng)可以提供比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模培養(yǎng)更高的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)通量，但它們尚不能完全滿足遺傳多樣性篩選評(píng)價(jià)所需的候選菌種數(shù)量級(jí)的快速增長。

因此，目前平行發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)尚需解決的問題包括：①解決平行培養(yǎng)通量越高，工業(yè)相似度越低的矛盾；②平行發(fā)酵培養(yǎng)所產(chǎn)生的過程大數(shù)據(jù)處理能力與所建立的過程模型如何滿足智能生物制造的需要；③建立基于微型生物反應(yīng)器的平行連續(xù)化灌流細(xì)胞培養(yǎng)過程，提高連續(xù)化生物制造過程的開發(fā)效率并降低成本；④進(jìn)一步提高平行發(fā)酵培養(yǎng)的集成度和平行培養(yǎng)通量，并降低采用一次性反應(yīng)器的平行培養(yǎng)的運(yùn)行成本，等等。上述問題的解決，將進(jìn)一步拓展平行發(fā)酵技術(shù)在生物過程工程中的應(yīng)用，縮短“從DNA到成熟制造工藝”的過程研發(fā)時(shí)間。