秦偉彤，楊廣宇

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

高通量篩選（high-throughput screening，HTS）是藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，也是闡明基因和蛋白質(zhì)功能的重要工具，它已被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和制藥領(lǐng)域［1-5］。通常認(rèn)為HTS樣本篩選通量大于103個(gè)/天及小于105個(gè)/天［6］。但是就以蛋白質(zhì)進(jìn)化為例，通過(guò)易錯(cuò)PCR的手段很容易就構(gòu)建出庫(kù)容量為1010的突變體文庫(kù)［7］，盡管自動(dòng)移液工作站的出現(xiàn)減少了部分人工操作，但是所需的成本仍然較高，且樣本的篩選通量小于106個(gè)/天，因此對(duì)大量生物樣本庫(kù)進(jìn)行特定代謝物、酶、核酸、表型或突變的篩選逐漸成為一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)［8-9］。如何實(shí)現(xiàn)低成本、高速度、高特異性以及高靈敏度的篩選是HTS所面臨的主要問(wèn)題。

微流體系統(tǒng)最早出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，是一種精確操作微尺度流體（10-6～10-18L）的技術(shù)，可以將多個(gè)操作單元，比如液滴的生成、信號(hào)檢測(cè)和分選等集成到一個(gè)芯片上，并自動(dòng)完成整個(gè)分析過(guò)程，因此也被稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”［10-11］。它的優(yōu)點(diǎn)是樣品消耗低、反應(yīng)快速且具有并行處理的能力，這也使得樣本的篩選通量提高到了108個(gè)/天，試劑的消耗量也降低為傳統(tǒng)的微孔板篩選的百萬(wàn)分之一，為HTS領(lǐng)域帶來(lái)了革命性的改變［12-14］。

傳統(tǒng)的微液滴篩選系統(tǒng)（以酶進(jìn)化為例）主要是通過(guò)將表達(dá)有不同酶突變體的菌株以及反應(yīng)底物進(jìn)行單細(xì)胞包裹，將液滴在芯片上或芯片外孵育特定時(shí)間，最后根據(jù)設(shè)定的篩選電壓閾值，陽(yáng)性液滴在介電泳（dielectrophoresis，DEP）作用力下進(jìn)入收集通道，從而實(shí)現(xiàn)分選［15-16］（圖1）。液滴的生成方式已經(jīng)有很多種，包括油包水（water in oil，W/O）、水包油包水（water/oil in water， W/O/W）、水凝膠珠的形式，液滴的體積也從納升到皮升不等［14，17-19］。每個(gè)液滴均為一個(gè)獨(dú)立的微反應(yīng)器，從而能夠分析從細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或由細(xì)胞分泌的酶功能，克服了傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)和熒光激活細(xì)胞分選只能用于檢測(cè)與細(xì)胞直接關(guān)聯(lián)的熒光信號(hào)的限制。液滴信號(hào)檢測(cè)與分選的方式也根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的需求，發(fā)展出了更多種類的液滴分選器［20］。

圖1 傳統(tǒng)的微流控分選流程示意圖Fig. 1 The scheme of traditional microdroplets sorting devices

傳統(tǒng)的基于微流體的液滴分選主要依賴于激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，以及熒光激活的微液滴分選系統(tǒng)，但是特別針對(duì)一些小分子藥物及大部分酶分子，缺乏適用的熒光探針，而極大地限制了該系統(tǒng)的應(yīng)用［21］。自Link等［22］于2006年開(kāi)發(fā)了首套利用靜電力實(shí)現(xiàn)液滴分選的設(shè)備以來(lái)，相繼有不同原理的微液滴超高通量篩選系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。按信號(hào)識(shí)別方式區(qū)分，包括結(jié)合熒光光譜［12］、吸收光譜［21］、分析質(zhì)譜［23］、拉曼光譜［24］、電化學(xué)技術(shù)［25］、核磁共振［26］、圖像識(shí)別［27］等技術(shù)；按控制液滴的偏轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)力不同，又可以分為電［28］、聲［29］、磁［30］、氣動(dòng)［31］或者熱學(xué)［32］等系統(tǒng)。本文主要針對(duì)目前已開(kāi)發(fā)出的不同的微流控篩選設(shè)備，根據(jù)檢測(cè)信號(hào)的不同將其分為標(biāo)記與無(wú)標(biāo)記液滴分選技術(shù)，對(duì)其發(fā)展情況和使用情況進(jìn)行了總結(jié)，并討論了目前微液滴分選設(shè)備所存在的局限性及未來(lái)的發(fā)展方向。

1 標(biāo)記液滴分選技術(shù)

標(biāo)記液滴分選技術(shù)通常不是基于所測(cè)定的細(xì)胞或者酶分子本身的特征進(jìn)行分選，而是需要引入化學(xué)分子或者熒光探針來(lái)間接實(shí)現(xiàn)分選。主要包括依賴于熒光信號(hào)的熒光激活液滴分選（fluorescence-activated droplets sorting， FADS）和基于紫外/可見(jiàn)光吸收變化的吸光度激活液滴分選（absorbanceactivated droplets sorting， AADS）技術(shù)（圖2）。

圖2 標(biāo)記液滴分選技術(shù)分選原理Fig. 2 The principle of labeled droplet sorting technology

1.1 熒光激活的液滴分選技術(shù)

熒光激活的液滴分選是目前主流的微流控篩選技術(shù)，其主要是通過(guò)設(shè)計(jì)不同的熒光探針或者酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)直接或間接實(shí)現(xiàn)目標(biāo)酶基因型與熒光的耦聯(lián)，因此具有更高的靈敏度［19，33-35］。與熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）原理相似，但是FADS與FACS相比最大的優(yōu)勢(shì)是其可對(duì)細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞上、分泌到細(xì)胞外的信號(hào)以及無(wú)細(xì)胞體系進(jìn)行分選，同時(shí)由于其配置了高速相機(jī)，能夠?qū)崿F(xiàn)分選的可視化［36］。FADS與其他液滴分選技術(shù)相比，另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)是處理微液滴的分選通量高達(dá)5000個(gè)/s。目前已被成功應(yīng)用于脂肪酶［33］、酯酶、纖維素酶［13］、淀粉酶［37］、聚合酶［38］等酶分子的改造。

經(jīng)過(guò)十余年的發(fā)展，研究者們也對(duì)傳統(tǒng)的FADS系統(tǒng)進(jìn)行了升級(jí)改造。比如Ma等［17］開(kāi)發(fā)了一套雙色熒光分選體系，可以同時(shí)處理來(lái)自相同液滴的兩個(gè)熒光信號(hào)，篩選出了具有高酶活性和高對(duì)映選擇性的黃古珠酯酶突變體。Hasan等［39］開(kāi)發(fā)了一種熒光壽命激活的液滴分選系統(tǒng)（fluorescence lifetime-activated droplet sorting，F(xiàn)LADS），但該系統(tǒng)的分選通量只有50個(gè)/s。Blaha和Hasan等［40］進(jìn)一步通過(guò)對(duì)活細(xì)胞與死細(xì)胞進(jìn)行精確的液滴分選證明了FLADS的可行性。此外，Hung等［41］優(yōu)化了信號(hào)處理的硬件，并將分選通量提高到了2500個(gè)/s。

目前FADS技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，比如需要根據(jù)不同的酶分子及催化反應(yīng)開(kāi)發(fā)合適的熒光探針，而對(duì)于某些酶分子、不常見(jiàn)的細(xì)胞以及靶向分析物為小分子藥物的實(shí)驗(yàn)，則缺乏適用的生物標(biāo)記物和熒光探針，導(dǎo)致無(wú)法構(gòu)建熒光耦聯(lián)策略。同時(shí)選用的熒光探針還需保留在液滴中，不能發(fā)生擴(kuò)散等問(wèn)題。這些也極大地限制了FADS的廣泛應(yīng)用。為了克服FADS的局限性，其他種類的液滴分選技術(shù)比如吸光度、質(zhì)量和拉曼等激活的液滴分選技術(shù)也相繼被開(kāi)發(fā)出來(lái)（表1）。

表1 不同微流控分選設(shè)備比較Table 1 Comparison of different microfluidic sorting equipment

1.2 吸光度激活的液滴分選技術(shù)

吸收光譜法被廣泛應(yīng)用于比色測(cè)定、蛋白質(zhì)定量和酶動(dòng)力學(xué)等方面［51-52］，近年來(lái)科研人員也將其與微流控技術(shù)進(jìn)行耦聯(lián)，開(kāi)發(fā)出了吸光度激活液滴分選技術(shù)AADS，實(shí)現(xiàn)了與FADS技術(shù)的互補(bǔ)［21］。與FADS相比， AADS檢測(cè)的挑戰(zhàn)是吸光率與路徑長(zhǎng)度成正比，這意味著液滴的小體積（pL）以及由此產(chǎn)生的短光路長(zhǎng)度（μm）會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度［21，53］。Gielen等［21］首次介紹了一種使用介電泳和光纖的AADS系統(tǒng)，在液滴的吸光度被讀出后再對(duì)液滴進(jìn)行分選，分選通量約為300 個(gè)/s。但是他們聲稱在液滴中染料的濃度低于100 μmol/L時(shí)則無(wú)法完成分選，因?yàn)橛拖嗪退嗟牟煌凵渎蕰?huì)產(chǎn)生信號(hào)偽影，只能通過(guò)添加偏移染料來(lái)降低信號(hào)偽影。隨后，Duncombe等［53］開(kāi)發(fā)了一種基于全紫外可見(jiàn)光譜激活的液滴分選系統(tǒng)（UV-vis spectra-activated droplet Sorter，UVADS），將光路路徑長(zhǎng)度從50 μm增加到300 μm，但由于是全光譜，液滴的分選通量低于100 個(gè)/s。最近，Medcalf等［44］報(bào)道了一種集成雙凹透鏡聚焦、聲表面波（surface acoustic wave，SAW）分選和吸光度激活的液滴分選系統(tǒng)，使其分選通量提高到了103個(gè)/s水平，同時(shí)使用折射率匹配油，通過(guò)去除側(cè)面散射來(lái)提高信號(hào)質(zhì)量，可對(duì)濃度差為50 μmol/L的液滴進(jìn)行分類。理論上來(lái)講，AADS可能會(huì)有更高的應(yīng)用價(jià)值，相較于FADS更加具有普適性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)小分子在電磁光譜的紫外線和可見(jiàn)光區(qū)域均可表現(xiàn)出吸收。

2 無(wú)標(biāo)記的液滴分選技術(shù)

無(wú)標(biāo)記的液滴分選技術(shù)不需要添加額外的化學(xué)分子，而是利用檢測(cè)的反應(yīng)、化合物或細(xì)胞本身的物理或化學(xué)變化，來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)與分選。目前已開(kāi)發(fā)出了與質(zhì)譜技術(shù)、拉曼光譜、核磁共振、電化學(xué)及圖像分析等技術(shù)相結(jié)合的無(wú)標(biāo)記分選技術(shù)（圖3）。但是該類方法通常需要耦聯(lián)不同的技術(shù)與特殊的設(shè)備。

圖3 無(wú)標(biāo)記液滴分選技術(shù)分選原理Fig. 3 The principle of unlabeled droplet sorting technology

2.1 質(zhì)量激活的液滴分選技術(shù)

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）是一種無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)，并已成為通用的分析技術(shù)［55］。然而，傳統(tǒng)的液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatographymass spectrometry，LC/MS）由于色譜分離而耗時(shí)，并且需要相對(duì)較大的樣品體積，這對(duì)于HTS來(lái)說(shuō)成本過(guò)高［56］。而質(zhì)量激活液滴分選技術(shù)（mass activated droplet sorting， MADS）則是將微流控技術(shù)與MS的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，兼具高靈敏性、高選擇性、低成本、可同時(shí)分析多種產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)［23］。Sun等［57-58］引入了第一種高通量液滴質(zhì)譜法，證明了該系統(tǒng)樣本篩選通量為1.7個(gè)/s，分析速度比傳統(tǒng)的LC-MS快300倍左右。隨后，Steyer等［59］開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)納米-電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）分析液滴的平臺(tái)，它可抵抗基質(zhì)效應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)樣本的快速分析。盡管基于MS的液滴分選方法已經(jīng)被證明了具有可行性，且相繼有更多的改進(jìn)方法逐漸被開(kāi)發(fā)出來(lái)，但是在處理過(guò)程中液滴的損失限制了其在液滴分選中的應(yīng)用。

為了克服這些限制，Holland-Moritz等［54］開(kāi)發(fā)了一套真正意義上的基于ESI-MS激活的液滴分選系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了液滴分隔模塊，由連接到質(zhì)譜儀的微流控芯片和進(jìn)行液滴計(jì)數(shù)的相機(jī)監(jiān)控的分選區(qū)域兩部分組成，注入到芯片中的液滴被分割成兩個(gè)大小不等的液滴，較大的液滴進(jìn)入質(zhì)譜儀通道用于信號(hào)檢測(cè)，較小的液滴則進(jìn)入分選通道，兩個(gè)通道之間具有一條延遲線，以保證液滴在經(jīng)過(guò)質(zhì)譜儀的檢測(cè)后，另外一個(gè)同級(jí)液滴才進(jìn)入分選通道［圖3（a）］。該系統(tǒng)的樣品分選通量可達(dá)0.7個(gè)/s，分選準(zhǔn)確率約98%。盡管該系統(tǒng)處理樣本的速度約為FADS的1/1000，但得益于質(zhì)譜所固有的無(wú)標(biāo)記特性，MADS幾乎可以測(cè)定任何產(chǎn)物，且可以同時(shí)分析多種物質(zhì)，證明了基于任何類型的測(cè)定信號(hào)進(jìn)行微液滴篩選的可能性。

2.2 拉曼激活的液滴分選技術(shù)

拉曼光譜的原理是通過(guò)激光與樣品相互作用時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)鍵的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)來(lái)獲取分子的信息，已廣泛應(yīng)用于物理、生物、化學(xué)、工業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域［60］。而拉曼激活的液滴分選技術(shù)（Ramanactivated droplet sorting，RADS）是一種無(wú)標(biāo)記、無(wú)損傷的單細(xì)胞識(shí)別與分析技術(shù)，其整合了單細(xì)胞拉曼光譜（single-cell Raman spectra，SCRS）與液滴微流控技術(shù)，通過(guò)利用介電的單細(xì)胞捕獲釋放和電磁閥吸吮技術(shù)，在高速流動(dòng)的狀態(tài)下捕獲單細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)拉曼采集、釋放和分選［24］。該技術(shù)最大的缺陷是容易受油相和液滴中光學(xué)畸變的影響，在不使用表面增強(qiáng)技術(shù)的情況下靈敏度較低，使得這項(xiàng)技術(shù)很難應(yīng)用于一些復(fù)雜的基質(zhì)中。為了克服這些缺陷，Wang等［48］采用了液滴“先選再養(yǎng)”的方式，即先捕獲單細(xì)胞的拉曼信號(hào)，再進(jìn)行液滴包裹，并采用基于介電力驅(qū)動(dòng)的方式，克服了制約通量提高的電磁閥作為分選驅(qū)動(dòng)力的瓶頸問(wèn)題，同時(shí)將芯片的材料PDMS替換成石英，使得該系統(tǒng)的細(xì)胞分選速率和靈敏度得到了較大的提升，分別達(dá)到了260個(gè)/min及98.3%［圖3（b）］。Safir等［61］開(kāi)發(fā)了一套基于人工智能輔助拉曼光譜與生物打印相結(jié)合的系統(tǒng)，用于血液中細(xì)菌的高通量檢測(cè)。理論上來(lái)講，RADS適用于所有類型的細(xì)胞，具有更廣闊的應(yīng)用前景。但目前，基于拉曼光譜的應(yīng)用仍需要高拉曼強(qiáng)度和大的細(xì)胞散射截面。當(dāng)將基于拉曼光譜的微液滴分選系統(tǒng)（droplet microfluidic screening systems，DMFS）應(yīng)用于小型細(xì)胞如大腸桿菌時(shí)，則需要額外的優(yōu)化。

2.3 核磁共振激活的液滴分選技術(shù)

核磁共振激活的液滴分選技術(shù)（nuclear magnetic resonance activated droplets sorting， NMRADS）相較于MADS，既是無(wú)標(biāo)記分選技術(shù)，也是一種無(wú)損傷分選技術(shù)。NMR能夠同時(shí)識(shí)別和量化數(shù)百種不同的復(fù)雜混合物中的化合物，提供了無(wú)與倫比的化學(xué)特異性。因此將其與微流控技術(shù)相結(jié)合，具有巨大的吸引力，但同時(shí)也是較大的挑戰(zhàn)［62-63］。從NMR的角度來(lái)看，一類特別具有挑戰(zhàn)性的集成功能元件是導(dǎo)電結(jié)構(gòu)［26］。金屬電極可用于電化學(xué)樣品相互作用，然而它們可能導(dǎo)致嚴(yán)重的NMR光譜和SNR（signal to noise ratio，信噪比）退化。在微觀尺度上這些問(wèn)題更為復(fù)雜，因?yàn)榛凅w積占據(jù)了樣品體積中的更高比例［26］。此外，NMR與其他檢測(cè)方法相比，檢測(cè)的質(zhì)量靈敏度較低（小于1 mmol/L）。核磁微線圈則是針對(duì)這些限制所開(kāi)發(fā)的，但是將微線圈與小樣本進(jìn)行對(duì)接挑戰(zhàn)較大［64］。

Swyer等［65］介紹了第一個(gè)NMR數(shù)字微流控系統(tǒng)，能夠在高場(chǎng)NMR中實(shí)現(xiàn)微線圈中分析物與液滴的對(duì)接，可以觀察木糖-硼酸鹽絡(luò)合和葡萄糖氧化酶催化等過(guò)程，但并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)分選。Davoudi等［26］通過(guò)將金屬軌道放置在微流體通道的側(cè)壁中，開(kāi)發(fā)了一種NMR兼容的微流體平臺(tái)［圖3（c）］，發(fā)現(xiàn)NMR射頻激發(fā)性能得到了增強(qiáng)，而不影響靜磁場(chǎng)的均勻性，從而能夠在進(jìn)行沉積的電極表面或處理室中的電極下方進(jìn)行直接光學(xué)觀察。這也為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)NMR激活的液滴分選提供了技術(shù)基礎(chǔ)與研究思路。

2.4 電化學(xué)激活的液滴分選技術(shù)

電化學(xué)檢測(cè)同樣也是一種無(wú)標(biāo)記、無(wú)損傷的檢測(cè)方法，可應(yīng)用于復(fù)雜樣品的檢測(cè)。但是由于檢測(cè)電極表面尺寸的限制（尺寸必須小于液滴），液滴的尺寸通常只能控制在納升級(jí)別。Goto等［25］開(kāi)發(fā)了一套可針對(duì)NADP依賴性氧化還原酶定向進(jìn)化的電化學(xué)激活液滴分選系統(tǒng)（electrochemical-based droplet sorting，ECDS），通過(guò)將NAD（P）H測(cè)定裝置與DEP分選設(shè)備相耦聯(lián)［圖3（d）］，將酶促反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為交流信號(hào)，對(duì)約30 nL的液滴進(jìn)行了分選，成功將酶的活性提高3倍左右。該方法檢測(cè)的靈敏度約為1 μmol/L，但是液滴篩選通量也較低，約為10個(gè)/s。

Abbyad組［66］提出了一種基于界面張力（sorting based on interfacial tension，SIFT）的分選方法，通過(guò)利用不同pH值會(huì)產(chǎn)生不同界面張力的液滴的原理，低pH導(dǎo)致液滴的高界面張力，并且具有較低pH的液滴會(huì)傾向于沿著芯片上的軌跡流動(dòng)，因此不需要額外的電極來(lái)進(jìn)行區(qū)分。該方法可區(qū)分pH差異為0.2的液滴，最大分選速率約為30 Hz。Dobson等［67］利用特定的表面活性劑會(huì)導(dǎo)致界面張力對(duì)液滴pH非常敏感的原理，成功將此分選方法用于凋亡細(xì)胞的分離研究中。Zielke等［68］也基于SIFT原理，成功對(duì)具有不同水平糖酵解的細(xì)胞（癌癥細(xì)胞亞群）進(jìn)行了分離。

2.5 基于圖像分析的液滴分選技術(shù)

基于圖像分析的液滴分選技術(shù)（image-based droplets sorting， IBDS）是一種基于液滴內(nèi)細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)圖像識(shí)別、處理與分析來(lái)實(shí)現(xiàn)分選的無(wú)標(biāo)記分選技術(shù)［圖3（e）］［27，69］。該方法在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域越來(lái)越受歡迎，部分原因是近年來(lái)通過(guò)多項(xiàng)研究提高了圖像處理算法、接口速度和處理硬件性能。Doan等［70］利用小波分析實(shí)現(xiàn)了液滴中細(xì)胞形態(tài)區(qū)分，該方法分選精度可達(dá)90%，液滴分選通量約為10個(gè)/s。Watterson等［69］也開(kāi)發(fā)了一種基于小波的圖像分析方法來(lái)測(cè)量液滴的光密度，指示液滴中細(xì)菌的數(shù)量，該方法被成功應(yīng)用于分析患者樣本中的抗生素耐藥性，并揭示了21個(gè)細(xì)菌種群。Anagnostidis等［50］開(kāi)發(fā)了在深度學(xué)習(xí)引導(dǎo)下的IBDS系統(tǒng)，證明了深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以準(zhǔn)確地對(duì)單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和多細(xì)胞球體的存在和數(shù)量進(jìn)行實(shí)時(shí)液滴成像分析。這種方法還能夠從含有不同類型和大小對(duì)象的混合物中識(shí)別出特定對(duì)象，可用于快速揭示細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性。

3 應(yīng)用領(lǐng)域

3.1 酶的定向進(jìn)化與新酶挖掘

酶是自然界存在的最重要的生物催化劑，經(jīng)過(guò)自然界數(shù)千年的自然進(jìn)化已被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域［71-72］。但是天然酶往往無(wú)法滿足工業(yè)需求，所以人工選擇和篩選變得越來(lái)越重要［24，73］。定向進(jìn)化是在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬“達(dá)爾文進(jìn)化”的原理，快速進(jìn)化出具有目標(biāo)性能的突變酶，為酶進(jìn)化提供了強(qiáng)大的工具［74-77］。但是定向進(jìn)化面臨的最大問(wèn)題是傳統(tǒng)的微孔板篩選方法無(wú)法滿足龐大的庫(kù)容量篩選的需求［78］，同時(shí)工業(yè)和制藥領(lǐng)域?qū)σ恍┬滦偷?、性能更?yōu)的微生物催化劑的需求也持續(xù)快速增長(zhǎng)［79］。所以酶的定向進(jìn)化和新酶的挖掘直接受益于液滴微流控的發(fā)展，為酶反應(yīng)提供了單獨(dú)的反應(yīng)環(huán)境和更大的篩選容量。

我們對(duì)近五年利用液滴分選系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)定向進(jìn)化以及新酶挖掘的案例進(jìn)行了簡(jiǎn)單的總結(jié)（表2）。

表2 近五年微流控分選裝置成功應(yīng)用的案例Table 2 Cases of successful application of microfluidic sorting devices in the past five years

Ma等［17］利用雙色熒光的FADS系統(tǒng)將酯酶對(duì)S-布洛芬的對(duì)映選擇性提高700倍左右。Tan等［88］在紅海環(huán)境樣本中成功挖掘到了3種新的脂肪酶。Zurek等［83］開(kāi)發(fā)的AADS液滴分選器已成功用于胺脫氫酶的定向進(jìn)化，使其轉(zhuǎn)化率提高了3.28倍。隨后，Zachos等［87］開(kāi)發(fā)的AADS液滴分選設(shè)備使葡萄糖脫氫酶的催化速度和效率提高至少10倍。但是統(tǒng)計(jì)的10個(gè)案例中有8個(gè)應(yīng)用了FADS系統(tǒng)，說(shuō)明盡管研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了多種微流控分選設(shè)備，目前針對(duì)酶進(jìn)化和新酶挖掘的方法仍然以FADS分選系統(tǒng)為主。

除了酶工程領(lǐng)域外，微流控分選技術(shù)在微生物挖掘和定向進(jìn)化方向也具有巨大的應(yīng)用空間［89］，比如Qiao等［85］從環(huán)境樣本中利用FADS系統(tǒng)分選出了可降解塑料的Kineococcus endophyticusUn-5和Staphylococcus epidermidisUn-C2-8菌株。Xu等［86］開(kāi)發(fā)出了一套新的轉(zhuǎn)錄相關(guān)的FADS系統(tǒng)，并從原油中篩選出了10種產(chǎn)生更多鼠李糖脂的微生物，它們產(chǎn)生的鼠李糖脂比銅綠假單胞菌PAO1模型多54%~208%。Bowman等［90］利用FADS分選系統(tǒng)從溶脂雅羅菌轉(zhuǎn)座子突變體庫(kù)中，在菌株培養(yǎng)的早期鑒定出了衣康酸生產(chǎn)力提高的菌株。

3.2 細(xì)胞的分選與分離

病原微生物的快速靈敏檢測(cè)在食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域至關(guān)重要。例如在藥物實(shí)驗(yàn)室中，醫(yī)療產(chǎn)品的污染可能會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)，如敗血癥［91-93］。微流控篩選設(shè)備可以極大地幫助研究人員從復(fù)雜環(huán)境中分離病原體，Li等［94］利用聲電泳分選方法，通過(guò)在微通道上施加強(qiáng)烈的聲波，流動(dòng)的顆粒會(huì)根據(jù)它們的大小進(jìn)行分類，成功地分選了大腸桿菌和人類血細(xì)胞的混合物，得到的含有細(xì)菌的溶液顯示出超過(guò)96%的細(xì)菌純度（低于4%的血細(xì)胞）。Ohlsson等［95］又優(yōu)化了聲電泳分選方法，使得細(xì)菌回收率高達(dá)99.7%，或血細(xì)胞去除率高可達(dá)99.99%。此外，Hyman等［96］基于環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜分析和分選的系統(tǒng)（single-cell nucleic acid profiling in droplet，SNAPD），可用于量化不同的細(xì)胞異質(zhì)種群中的類型，檢測(cè)到頻率低至0.1%的罕見(jiàn)細(xì)胞，并使用微流體分選富集特異性的細(xì)胞類型（圖4）。

圖4 SNAPD工作流程圖［96］Fig. 4 Schematic of the SNAPD workflow[96]

3.3 單細(xì)胞分析及藥物篩選

單細(xì)胞技術(shù)對(duì)免疫學(xué)領(lǐng)域有著重要的影響。它能夠闡明免疫信號(hào)傳導(dǎo)和免疫細(xì)胞遷移的動(dòng)力學(xué)和邏輯，促進(jìn)抗體篩選，并允許對(duì)B細(xì)胞和T細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模并行分析?；谖⒘黧w的技術(shù)實(shí)現(xiàn)的高時(shí)空控制使得對(duì)免疫信號(hào)、細(xì)胞遷移和細(xì)胞間相互作用的理解增加了一個(gè)強(qiáng)大的手段［97］。Mazutis等［98］開(kāi)發(fā)了首套可應(yīng)用于單細(xì)胞分析及抗體篩選的液滴微流控分選系統(tǒng)。他們將單個(gè)小鼠雜交瘤細(xì)胞、熒光探針和包被抗小鼠IgG抗體的單個(gè)微珠共包裹在50 pL液滴中，僅在15min后檢測(cè)分泌的抗體，分選速率約為200 Hz（圖5）。Shembekar等［97］研發(fā)了一套基于雙色熒光策略的微流控分選平臺(tái)，并引入了液滴捕捉與成像技術(shù)，不僅可以定性地對(duì)表達(dá)的抗體進(jìn)行分類，還可以定量地對(duì)特異性抗體結(jié)合以及與天然細(xì)胞表面受體的結(jié)合進(jìn)行分類。除了抗體篩選之外，Baranova等［99］還基于單細(xì)胞共培養(yǎng)微生物組以及乳液中的報(bào)告熒光病原體，使用熒光激活的細(xì)胞分選來(lái)選擇無(wú)報(bào)告液滴，開(kāi)發(fā)了一組革蘭氏陰性菌大腸桿菌的報(bào)告菌株，以提供用于精確監(jiān)測(cè)抗菌活性的活體生物傳感器，可以有效地用于抗生素/益生菌的發(fā)現(xiàn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和生物學(xué)合成。

圖5 應(yīng)用微流控分選設(shè)備進(jìn)行抗體篩選的流程圖［98］Fig. 5 The scheme of antibody screening using microfluidic sorting device[98]

4 總結(jié)與展望

微流控技術(shù)的快速發(fā)展為細(xì)胞及液滴的分選提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。該技術(shù)在提高分析率的同時(shí)顯著減少了樣本分析量，從而能夠在大容量突變庫(kù)或者微生物群體中快速識(shí)別出罕見(jiàn)的或者活性提升的靶標(biāo)。而微流控分選裝置主要包括液滴的生成、孵育、操作與分選，經(jīng)過(guò)近些年的發(fā)展，前三個(gè)步驟已相對(duì)成熟且已有商業(yè)化的裝置，因此最主要的限速步驟是液滴的分選。

FADS具有更高的篩選速度（kHz水平）和最高的靈敏度（nmol/L級(jí)別），是目前發(fā)展最成熟以及應(yīng)用最廣泛的微流控分選系統(tǒng)。如果能夠找到合適的熒光探針或熒光耦聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)基因型與表型的耦聯(lián)，F(xiàn)ADS依舊是所有分選方法的首要選擇。AADS的檢測(cè)靈敏度雖然低于FADS，但AADS系統(tǒng)不需要激光器和光電倍增管，因此其裝置比FADS更簡(jiǎn)單、更便宜，在檢測(cè)靈敏度符合要求的情況下，AADS會(huì)是較不錯(cuò)的選擇。當(dāng)然也有將FADS與AADS進(jìn)行結(jié)合，開(kāi)發(fā)出的FAADS（fluorescence and AADS）系統(tǒng)，既可以獲得熒光值，也可以獲得光密度值，可以為研究提供更多的信息［100］。

無(wú)標(biāo)記的分選設(shè)備因其不需要特定的熒光探針、能夠保證細(xì)胞及反應(yīng)的完整度等優(yōu)勢(shì)而受到越來(lái)越多的關(guān)注，也為研究者提供了更多的選擇空間。但是該類分選設(shè)備所面臨的共性問(wèn)題是分選效率與檢測(cè)靈敏度較低。MADS是探測(cè)化學(xué)物質(zhì)的一種很有價(jià)值的工具，檢測(cè)的范圍擴(kuò)大到只要能夠利用ESI電離的分子，而利用FADS與AADS均是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于篩選化學(xué)反應(yīng)，檢測(cè)質(zhì)量變化的能力比光譜變化更適用。RADS是無(wú)損傷的分析方法，有助于與細(xì)胞中DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的下游提取進(jìn)行無(wú)縫整合，以進(jìn)行進(jìn)一步分析。NMR-ADS可以提供更全面的信息，但是目前還未實(shí)現(xiàn)分選。然而，RADS與NMR-ADS均需要特殊的技術(shù)來(lái)建立分選系統(tǒng)。對(duì)于基于電化學(xué)的分選方法，也沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的分選裝置，甚至可能需要根據(jù)各種電化學(xué)特性進(jìn)行定制。

盡管目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了多種微流控分選裝置，但是真正商業(yè)化的設(shè)備卻很少。首先，不同的生物學(xué)應(yīng)用需要不同的檢測(cè)方法，很難開(kāi)發(fā)出一個(gè)通用的微流控分選設(shè)備，同時(shí)市場(chǎng)有限，集成化的設(shè)備商業(yè)化也很難。其次，微流控分選設(shè)備需要高精細(xì)的元件，搭建平臺(tái)也需要實(shí)驗(yàn)室有一定的基礎(chǔ)。此外，微流控分選設(shè)備的整個(gè)流程十分依賴人為操作且流程較復(fù)雜，也進(jìn)一步限制了該類系統(tǒng)的通用性。未來(lái)還需要在這一方向進(jìn)一步改進(jìn)與努力，從而提高商業(yè)性的微流控分選設(shè)備的通用性。

總之，本文從信號(hào)的檢測(cè)方法方向綜述了微流控分選設(shè)備的發(fā)展情況與應(yīng)用情況。盡管FADS仍然是細(xì)胞分選的首要選擇，但是許多研究開(kāi)發(fā)出了多種微流控分選設(shè)備，也進(jìn)一步擴(kuò)大了微流控分選設(shè)備的應(yīng)用范圍。其超高的篩選通量與獨(dú)立的反應(yīng)環(huán)境為不同領(lǐng)域（包括蛋白質(zhì)工程、抗體篩選、不同種類細(xì)胞的分選及臨床方向）的研究提供了新的技術(shù)平臺(tái)。隨著更多新技術(shù)的發(fā)展，比如人工智能、生物打印技術(shù)等的發(fā)展，也會(huì)為微流控分選設(shè)備賦予更多應(yīng)用。