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        單細(xì)胞拉曼光譜測試分選裝備研制及應(yīng)用進(jìn)展

        2023-11-21 03:22:58刁志鈿王喜先孫晴徐健馬波
        合成生物學(xué) 2023年5期
        關(guān)鍵詞:檢測

        刁志鈿,王喜先,孫晴,徐健,馬波

        (中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所,單細(xì)胞中心,山東 青島 266101)

        合成生物學(xué)在過去二十年中表現(xiàn)出巨大發(fā)展?jié)摿?,合成生物學(xué)研究在全世界范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注,被多個國家和國際組織機(jī)構(gòu)評為能夠引起人類生活以及全球經(jīng)濟(jì)發(fā)生革命性進(jìn)展的顛覆性科技[1-3]。我國《“十三五”國家科技創(chuàng)新規(guī)劃》《“十三五”生物技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)規(guī)劃》都將合成生物技術(shù)列為“構(gòu)建具有國際競爭力的現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系”所需的“發(fā)展引領(lǐng)產(chǎn)業(yè)變革的顛覆性技術(shù)”之一。合成生物學(xué)的跨越式發(fā)展,取決于“設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”(design-build-test-learn)這四大環(huán)節(jié)的突破。近年來,合成生物學(xué)發(fā)展又進(jìn)入了新的快速發(fā)展階段,基因編輯與合成技術(shù)以及人工智能的迅速發(fā)展極大地增強(qiáng)了“設(shè)計”和“合成”兩大環(huán)節(jié)[4-9],而細(xì)胞表型測試速度與通量的發(fā)展卻緩慢得多,難以滿足“細(xì)胞表型測試”環(huán)節(jié)對高通量的需求,因此細(xì)胞表型測試成為限制合成生物技術(shù)快速發(fā)展的主要因素之一。

        單個細(xì)胞是地球上生命的基本單元和進(jìn)化的基本單位,因此單細(xì)胞表型測試技術(shù)原理和儀器設(shè)備體系的突破,將帶來合成生物學(xué)技術(shù)的重大突破。目前單細(xì)胞表型測試常用技術(shù)中,熒光流式具有超靈敏、高特異性、高可靠性和高通量等優(yōu)勢,是目前應(yīng)用最為廣泛的單細(xì)胞表型檢測技術(shù)之一[10-12],但其需外加熒光標(biāo)記的前提限制了應(yīng)用的普適性。質(zhì)譜流式是一種強(qiáng)大的功能表型識別技術(shù)[13-15],但其在單細(xì)胞水平的檢測分辨率還很低,且對細(xì)胞具有破壞性。拉曼光譜是一種散射光譜,是化合物中分子鍵被激發(fā)到虛能態(tài)卻尚未恢復(fù)到原始態(tài)所引起的入射光被散射后頻率發(fā)生變化的現(xiàn)象[16]。光譜信號對應(yīng)于化學(xué)鍵的振動,其依靠激發(fā)光的非彈性散射和分子共振可以對單個細(xì)胞產(chǎn)生獨(dú)特的“指紋圖譜”[17]。單細(xì)胞拉曼光譜(single-cell Raman spectrum, SCRS)技術(shù)能夠提供豐富的代謝表型信息,可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞精度測量,且可以進(jìn)行非標(biāo)記的原位檢測進(jìn)而形成普適性應(yīng)用,因此是實(shí)現(xiàn)高精度單細(xì)胞代謝功能探測的重要手段[18-20]。

        基于SCRS技術(shù)強(qiáng)大的表型識別能力,國內(nèi)外已搭建了針對不同應(yīng)用場景的拉曼激活細(xì)胞分選平臺(RACS)。根據(jù)拉曼采集時細(xì)胞的運(yùn)動狀態(tài),大體上分為靜止模式和流動模式兩大類,前者主要包括拉曼彈射分選(Raman-activated cell ejection,RACE)[21]、靜態(tài)拉曼光鑷(static-Raman tweezer, Static-RT)[22-23]、重力驅(qū)動拉曼光鉗液滴分選(Raman-activated gravity-driven encapsulation, RAGE)[24],后者主要包括流式拉曼光鑷(flow-Raman tweezer, Flow-RT)[25]、拉曼微流分選(Raman-activated microfluidic sorting,RAMS)[26]、拉曼微液滴分選(Raman-activated droplet sorting, RADS)[27]、介電單細(xì)胞捕獲/釋放拉曼激活液滴分選(positive dielectrophoresisbased RADS, pDEP-RADS)[28]以及相干拉曼微流分選(Coherent-RAMS)[29-30]。這些平臺有效耦合了單細(xì)胞拉曼表型識別、分選、基因型分析或培養(yǎng),展示了其助力合成生物學(xué)細(xì)胞表型測試與分選的巨大潛力。本文選取自主研制的單細(xì)胞拉曼光鑷分選儀(RACS-Seq)、單細(xì)胞微液滴分選系統(tǒng)(EasySort)和高通量流式拉曼分選儀(FlowRACS)為典型儀器裝備,分別概述其技術(shù)原理、技術(shù)迭代以及特色應(yīng)用案例,為國產(chǎn)化儀器裝備提供特色研制方案。

        1 單細(xì)胞拉曼光鑷分選儀(RACS-Seq)

        RACS-Seq以RAGE技術(shù)為核心,可以在水環(huán)境中對單個細(xì)胞進(jìn)行低損傷的拉曼成像,并依據(jù)特征SCRS將目標(biāo)單細(xì)胞用重力驅(qū)動液滴包裹的形式精準(zhǔn)包裹,進(jìn)而將液滴從微流控芯片轉(zhuǎn)移至離心管中,以單個細(xì)胞-單個液滴-存放于單個試管的形式完成細(xì)胞分選和單細(xì)胞樣本制備,以支撐下游單細(xì)胞擴(kuò)增或測序。RACS-Seq可對各類細(xì)胞樣品進(jìn)行一站式單細(xì)胞代謝表型測量、單細(xì)胞拉曼分選、單細(xì)胞基因組解析和單細(xì)胞培養(yǎng)?;诜€(wěn)定同位素標(biāo)記底物飼喂SCRS技術(shù),RACS-Seq無須分離培養(yǎng),在單細(xì)胞精度直接鑒定微生物種類,并測量各種代謝相關(guān)表型(及其細(xì)胞間異質(zhì)性)。通過單細(xì)胞微液滴光鑷?yán)诌x與低偏好性核酸擴(kuò)增技術(shù),以獲取高覆蓋度、與代謝表型相關(guān)聯(lián)的單細(xì)胞基因組。RACS-Seq為復(fù)雜細(xì)胞樣品的代謝活性快檢、種質(zhì)資源挖掘和功能機(jī)制研究提供了新一代、原創(chuàng)的裝備解決方案[圖1(a)]。

        圖1 基于RACS-Seq的單細(xì)胞拉曼表型檢測分選裝備及分選流程Fig. 1 Equipment and process for Raman-activated single-cell phenotype detection and sorting based on RACS-Seq

        1.1 儀器原理

        Xu等[24]開發(fā)了一種重力驅(qū)動拉曼光鉗液滴分選技術(shù),通過耦合液滴微流控技術(shù),完成了目標(biāo)單細(xì)胞的精準(zhǔn)分選和快速導(dǎo)出,實(shí)現(xiàn)所測即所得。RAGE技術(shù)的發(fā)展為RACS-Seq的研制與發(fā)展提供了技術(shù)支撐。RAGE分選所采用的水相拉曼單細(xì)胞信號檢測可以降低激光照射帶來的損傷,加之液滴生成過程有油相的引入可以提高M(jìn)DA擴(kuò)增效率[29],所以RAGE分選后,目標(biāo)大腸桿菌單細(xì)胞的全基因組測序覆蓋度達(dá)到了約95%[24]。

        RACS-Seq主要由拉曼光鑷與RAGE微流控分選芯片兩部分組成,拉曼光鑷用于單細(xì)胞拉曼成像和單細(xì)胞操控,微流控分選芯片用于構(gòu)建單細(xì)胞拉曼成像環(huán)境,以及支撐后續(xù)的單細(xì)胞液滴包裹和分離。在芯片內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行捕獲操控需要高精度的流路控制,而傳統(tǒng)基于注射泵、蠕動泵的進(jìn)樣方式由于導(dǎo)管、注射器始終處于壓縮受力的狀態(tài),難以實(shí)現(xiàn)pL/min級別的流路調(diào)控。RAGE技術(shù)創(chuàng)新性地采用了重力進(jìn)樣的方式,以類似打吊瓶的方法將裝有樣本細(xì)胞的注射器懸掛于高度可控的進(jìn)樣架上,通過注射器與芯片內(nèi)的液面差,讓樣本自動可控地進(jìn)入芯片,并通過調(diào)節(jié)進(jìn)樣架上注射器的高度控制其進(jìn)樣流速。此外,在微流控芯片的儲油池一端加入油相時,油相在微通道內(nèi)浸潤產(chǎn)生與進(jìn)樣重力方向相反的毛細(xì)作用力,通過調(diào)節(jié)液面差高度可在芯片內(nèi)形成流速為0的靜止?fàn)顟B(tài)。

        和傳統(tǒng)流式分選不同,RAGE采用半靜態(tài)分選。細(xì)胞分選前,調(diào)節(jié)進(jìn)樣架高度,使芯片內(nèi)水相與儲油池內(nèi)油相的兩相界面停留于微通道出口處,此時通道流速為0,細(xì)胞在通道內(nèi)保持準(zhǔn)靜止?fàn)顟B(tài)(具有鞭毛結(jié)構(gòu)的細(xì)胞會自發(fā)游動),收集檢測窗口處細(xì)胞的拉曼光譜(532 nm激光照射)。由于拉曼信號的強(qiáng)度與激發(fā)光波長的四次方成反比,這里用532 nm激光進(jìn)行拉曼成像。檢測時,532 nm激光具有一定的光鑷捕獲力,可輕易在準(zhǔn)靜態(tài)環(huán)境下捕獲細(xì)小細(xì)胞,由于準(zhǔn)靜態(tài)環(huán)境下沒有拉曼曝光時間的限制,因此可采集到微弱的細(xì)胞原位拉曼信號。篩選出具有特征拉曼光譜的目標(biāo)細(xì)胞后,將532 nm激光切換為1064 nm激光,并利用1064 nm激光所產(chǎn)生的光鑷力將目標(biāo)細(xì)胞拖拽到通道末端的油水界面處。此時,升高進(jìn)樣架的高度即能將油水界面處的水相擠入油池進(jìn)而形成單個液滴,目標(biāo)細(xì)胞隨即被包裹進(jìn)入形成的單個液滴。由于所選油相與水相的密度差異,生成液滴會停留于儲油池最底部靠近通道出口處,之后可方便地通過毛細(xì)管或移液槍完成轉(zhuǎn)移,最終以單個細(xì)胞-單個液滴-存放于單個試管的形式完成篩選[圖1(b)]。該分選模式還可方便與熒光成像耦合進(jìn)行單細(xì)胞熒光分選。

        1.2 應(yīng)用

        微生物組是地球上能量與元素循環(huán)的主要載體,與人體、動植物以及環(huán)境的健康也息息相關(guān)。因此,微生物組的探測、理解和利用,將跨越“尚難培養(yǎng)微生物屏障”,帶來生命科學(xué)及其應(yīng)用的共性突破。SCRS能夠無需培養(yǎng)而快速識別菌群中細(xì)胞的各種代謝功能,但是一直以來,針對菌群的單細(xì)胞拉曼分選和測序都面臨著兩個瓶頸:首先,如何無損快速地獲取特定拉曼表型的單個細(xì)胞;其次,如何高覆蓋度地獲得精確到一個細(xì)胞的基因組。

        針對上述問題,單細(xì)胞拉曼光鑷分選儀RACE-Seq給出了有效的解決方案,通過耦合光鑷及微流控液滴技術(shù),將特定拉曼表型的細(xì)菌單細(xì)胞從群體中精準(zhǔn)分離,并包裹到皮升級液滴中,然后采用宏觀移液的方式便可將包裹有目標(biāo)細(xì)胞的液滴導(dǎo)出并轉(zhuǎn)移到試管中,從而快速、精確、簡便地實(shí)現(xiàn)“單個細(xì)胞-單個液滴-單個試管”的拉曼分選流程,可直接耦合下游細(xì)胞培養(yǎng)或基因組分析。在這里選取了部分案例展示RACE-Seq的廣闊應(yīng)用潛力(圖2)。

        圖2 基于RACS-Seq的單細(xì)胞拉曼分選應(yīng)用Fig. 2 Applications of Raman-activated single-cell sorting based on RACS-Seq

        1.2.1 尿液中抗生素抗性大腸桿菌單細(xì)胞拉曼分選及測序

        Xu等[24]使用RACS-Seq從臨床尿液樣本中直接識別和分選出耐受特定抗生素的臨床大腸桿菌,并精確到一個細(xì)胞的全基因組測序,覆蓋度可達(dá)99.5%。拉曼彈射分選(RACE)[21]在干片條件進(jìn)行拉曼檢測,且激光彈射分選會對細(xì)胞造成一定的損傷,因此RACE的單細(xì)胞測序覆蓋度一般不高,RACS-Seq分選細(xì)胞時由于目標(biāo)細(xì)胞在分選過程中始終處于水相環(huán)境中,有效降低了拉曼分選中激光引入造成的細(xì)胞損傷,其導(dǎo)出的單細(xì)胞液滴體系經(jīng)過簡單振蕩后可轉(zhuǎn)變成乳化擴(kuò)增體系,大幅度降低了傳統(tǒng)單細(xì)胞基因擴(kuò)增(如單細(xì)胞MDA)中存在的偏好性,從而可從一個細(xì)胞得到近乎完整的全基因組信息。這一高覆蓋度保證了基因組上所有耐藥基因突變均得以全面、精確地揭示。此外,其獨(dú)特的單液滴分選轉(zhuǎn)移形式有效解決了單細(xì)胞分析中常見的污染問題。從菌群中直接、精準(zhǔn)地獲取一個細(xì)菌細(xì)胞的藥敏性表型及其完整基因組,以往還未有先例。因此,RACSSeq的這一獨(dú)特能力,預(yù)計將帶來臨床感染診斷和用藥、耐藥性傳播監(jiān)控與機(jī)制、海洋生態(tài)監(jiān)控與資源挖掘等領(lǐng)域的一系列突破[圖2(a)]。

        1.2.2 土壤微生物功能單細(xì)胞拉曼分選及測序

        土壤菌群是地球上最多樣與最復(fù)雜的微生物組之一,其中大部分微生物尚難以培養(yǎng),而單個細(xì)胞精度的拉曼分析-分選-測序策略是剖析土壤等環(huán)境菌群之代謝機(jī)制的重要手段。Jing等[31]依托RACS-Seq,從穩(wěn)定同位素底物飼喂的土壤菌群出發(fā),將特定拉曼表型的細(xì)菌單細(xì)胞精準(zhǔn)分離并包裹到皮升級液滴中,進(jìn)而耦合下游基因組測序。結(jié)果表明:①土壤菌群中細(xì)胞代謝活躍的低豐度物種(如Corynebacteriumspp.、Clostridiumspp.、Moraxellaspp.、Pantoeaspp.和Pseudomonasspp.等)經(jīng)重水飼喂與標(biāo)記后,可利用RACS-Seq精準(zhǔn)地識別和分選,其單細(xì)胞基因組覆蓋率可高達(dá)近93%;②基于RACS-Seq,含類胡蘿卜素的土壤微生物細(xì)胞(如Pantoeaspp.、Legionellaspp.、Massiliaspp.、Pseudomonasspp.、和Pedobacterspp.等)能實(shí)現(xiàn)單個細(xì)胞分辨率、高基因組覆蓋度的代謝重建,從而完整、深入地挖掘其類胡蘿卜素合成途徑;③這些“原位”合成類胡蘿卜素的土壤微生物細(xì)胞中,既有代謝活躍的,也有相當(dāng)部分是惰性的,表明基于純培養(yǎng)的策略勢必錯失這些代謝惰性的功能微生物,因此“原位”、單細(xì)胞精度的功能細(xì)胞識別和分離,對于全面、客觀的菌群功能剖析和資源挖掘具有重要意義[圖2(b)]。RACE-Seq可以從土壤中精確地以單細(xì)胞分辨率建立代謝-基因組鏈接,可以幫助精確查明復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中“誰在做什么”。

        1.2.3 海洋固碳微生物單細(xì)胞拉曼分選及測序

        為了挖掘海洋微生物組中具有原位固定CO2功能的細(xì)胞,Jing等[32]依托RACS-Seq,利用穩(wěn)定同位素13C標(biāo)記的無機(jī)碳底物飼喂新鮮海水樣品,通過SCRS中類胡蘿卜素等色素特征峰的“紅移”現(xiàn)象,建立了在免培養(yǎng)前提下原位固定CO2之單細(xì)胞的識別和測量流程。研究人員在中國山東省青島嶗山灣真光層海水中,識別和分選到一系列進(jìn)行海洋原位固碳代謝的Pelagibacter屬單細(xì)胞,來自于SAR11等類群?;谶@些SAR11單細(xì)胞全基因組序列(覆蓋度最高達(dá)到100%)的進(jìn)化分析、基因功能預(yù)測與代謝途徑重建,表明:①它們具有完整的類胡蘿卜素合成途徑,這印證了上述SCRS基于色素峰紅移來識別和表征CO2固定活性的原理;②發(fā)現(xiàn)了一個基于視紫紅質(zhì)的光激活質(zhì)子泵系統(tǒng),其中包括雙加氧酶(dioxygenase)、視紫質(zhì)光敏感蛋白(proteorhodopsin)、F-型ATP合成酶(F-type ATPase)等關(guān)鍵蛋白;③它們擁有大部分進(jìn)行CO2固定的Calvin-Benson循環(huán)途徑的基因。這些發(fā)現(xiàn)提示這些SAR11細(xì)胞可能通過基于視紫紅質(zhì)的光激活質(zhì)子泵系統(tǒng)來驅(qū)動基于Calvin-Benson循環(huán)的海水原位固碳。經(jīng)過假設(shè)驗(yàn)證得知它們能夠合成視紫質(zhì),且其中的兩個基因與GenBank中的基因均無顯著同源性,屬于一類全新的視紫質(zhì)光敏感蛋白。因此,這些視紫紅質(zhì)介導(dǎo)的光激活質(zhì)子泵系統(tǒng),很可能是SAR11在海水中原位進(jìn)行光合固碳的能量引擎[圖(2)]?;赗ACS-Seq系統(tǒng),Jing等[32]建立了針對CO2固定活性等代謝表型的功能靶向性單細(xì)胞拉曼分選與測序方法。

        1.2.4 污水解磷菌功能單細(xì)胞拉曼分選及培養(yǎng)

        磷既是維持作物種植、養(yǎng)活全球人口的關(guān)鍵營養(yǎng)元素,也是造成水體污染的重要原因。水體及土壤中的磷源包括可溶磷和不可溶磷(包括無機(jī)不可溶磷源和有機(jī)不可溶磷源),其中只有可溶態(tài)磷能夠被生物利用。而解磷菌能夠把不可溶磷轉(zhuǎn)化為可溶解態(tài)磷源,因此,挖掘在水體、土壤等環(huán)境中“原位”行使解磷功能的微生物,具有重要的研究意義和產(chǎn)業(yè)價值。基于元拉曼組原理和RACS-Seq,Jing等[33]發(fā)明了菌群中功能單細(xì)胞“先篩后養(yǎng)”的scRACS-Culture新策略。為了識別污水微生物組中的原位解磷菌,研究人員利用以Ca3(PO4)2為唯一無機(jī)磷源或以卵磷脂為唯一有機(jī)磷源的污水樣本(預(yù)先去除可溶性磷源),結(jié)合D2O孵育,從而通過SCRS中C—D特征峰的強(qiáng)弱,在單細(xì)胞精度定量表征污水中微生物的解磷活性,進(jìn)而建立了原位解磷菌的單細(xì)胞識別-分選-培養(yǎng)流程[圖2(d)]。

        運(yùn)用這一scRACS-Culture體系,研究人員在青島張村河水務(wù)有限公司的污水處理池中,原位識別、分選和培養(yǎng)出了Comamonasspp.、Acinetobacterspp.、Enterobacterspp.和Citrobacterspp.等高效原位有機(jī)解磷菌。重要的是,其原位解磷活性均比實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下高出1~2,凸顯了“先篩后養(yǎng)”策略對菌株“原位”功能認(rèn)知與評價的重要意義。同時,研究人員運(yùn)用scRACS-Seq,還發(fā)現(xiàn)了一類在污水中原位高效溶解不可溶有機(jī)磷源、在實(shí)驗(yàn)室條件下尚難以純培養(yǎng)的解磷菌新類群Cutibacteriumspp.。精確到一個細(xì)菌細(xì)胞的高覆蓋度基因組重建表明,它們通過分泌金屬磷酸酯酶(MPP)、細(xì)胞壁錨定5′-核苷酸酶(ushA編碼)和質(zhì)膜定位的PstSCAB-PhoU轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),來高效溶解和清除污水中的胞外磷酸鹽。由于scRACS-Culture的功能篩選不依賴于細(xì)胞純培養(yǎng),因此能基于“原位”功能、針對菌群中所有的生物多樣性進(jìn)行挖掘,并精準(zhǔn)聚焦于目標(biāo)功能細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化。這些特色克服了功能篩選片面性、功能評價失真性、菌株培養(yǎng)盲目性這三個傳統(tǒng)“先養(yǎng)后篩”策略的潛在缺陷。

        1.3 小結(jié)

        微生物組,也稱菌群,是微生物在自然界的主要存在形式,也是地球上能量與元素循環(huán)的重要載體。這一由成百上千個物種組成的共生體,有著復(fù)雜且獨(dú)特的內(nèi)部代謝網(wǎng)絡(luò),成為精妙的功能實(shí)體,維護(hù)著人體內(nèi)外乃至室內(nèi)環(huán)境、土壤、海洋、大氣等生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。因此,微生物組的探測、理解和利用,將跨越“尚難培養(yǎng)微生物屏障”,帶來生命科學(xué)及其應(yīng)用的共性突破,而阻礙此跨越的技術(shù)瓶頸之一便是“在特定的環(huán)境條件下,菌群中哪些/哪個細(xì)胞代謝了哪種底物?為什么?”。

        RACS-Seq可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞表型與高質(zhì)量基因型的對接,將有助于解答上述難題;同時,RACSSeq可以從底物代謝追蹤的角度闡明菌群內(nèi)代謝分工,揭示菌群-環(huán)境相互作用和菌群功能理性調(diào)控的機(jī)制。然而由于分選通量和測序通量的限制,現(xiàn)階段只能處理分析<100個單細(xì)胞樣本。而微生物組的細(xì)胞組成較為復(fù)雜,細(xì)胞數(shù)量大,細(xì)胞種類繁多,少量單細(xì)胞信息根本無法反映整個菌群的真實(shí)情況,因此需要在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展自動化高通量單細(xì)胞檢測和分選的技術(shù),并與下游高通量單細(xì)胞測序平臺耦合?,F(xiàn)階段,憑借人工智能技術(shù)的發(fā)展,單細(xì)胞分辨率的圖像識別、鑒定、分類已成為可能。借助于該技術(shù),有望實(shí)現(xiàn)自動化的單細(xì)胞高通量分選。

        2 單細(xì)胞微液滴分選系統(tǒng)(EasySort)

        EasySort Lego/Compact通過光鑷輕松控制單細(xì)胞的移動軌跡,并通過獨(dú)有的重力驅(qū)動專利技術(shù),可將直徑0.5~30 μm的單細(xì)胞迅速包裹成單液滴并對接下游實(shí)驗(yàn)。EasySort Lego/Compact可廣泛應(yīng)用于各類單細(xì)胞的分離、分選、培養(yǎng)及測序?qū)嶒?yàn)中,可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中單個細(xì)胞精度的可靠分選與微液滴包裹,保證細(xì)胞活性和DNA/RNA質(zhì)量。另外,在EasySort Lego的基礎(chǔ)上,研究人員開發(fā)了新一代人工智能輔助的微生物單細(xì)胞自動化分選系統(tǒng)EasySort AUTO,可將常規(guī)顯微鏡升級為微生物單細(xì)胞的智能化、自動化分選裝置,并利用酵母和大腸桿菌細(xì)胞示范了單細(xì)胞分選-測序/培養(yǎng)的全流程。EasySort系列儀器為細(xì)胞資源的探測和挖掘提供了有力手段[圖3(a)]。

        圖3 基于EasySort的單細(xì)胞拉曼表型檢測分選裝備及分選流程Fig. 3 Equipment and process for Raman-activated single-cell phenotype detection and sorting based on EasySort

        2.1 儀器原理

        2.1.1 EasySort Lego/Compact儀器原理

        EasySort Lego/Compact在RAGE分選的基礎(chǔ)上,在微流控芯片中構(gòu)建出不受流動支路影響的準(zhǔn)靜態(tài)細(xì)胞池,創(chuàng)新性地提出了一種光鑷輔助靜態(tài)池成像分選技術(shù)(OPSI),實(shí)現(xiàn)了分選通量的顯著提升[34]。利用靜態(tài)池成像分選的思路,即在微流控芯片中構(gòu)建流速為0的穩(wěn)定靜態(tài)流場,對樣本細(xì)胞進(jìn)行限域,并在該流場內(nèi)進(jìn)行平面明場、熒光成像或拉曼掃描從而選取目標(biāo)細(xì)胞。之后通過低細(xì)胞損傷的1064 nm光鑷將目標(biāo)單細(xì)胞移出靜態(tài)流場,并進(jìn)行單細(xì)胞液滴包裹和導(dǎo)出完成分選。相比RAGE,由于靜態(tài)細(xì)胞池與分選支路互相獨(dú)立,無須對支路干擾細(xì)胞進(jìn)行清理,并且細(xì)胞池與分選通道的間距縮小至約150 μm,縮短了光鑷操控距離,最終分選通量由1~2細(xì)胞/min提高至約10細(xì)胞/min,并且分選體積仍為皮升級,因此有助于下游單細(xì)胞擴(kuò)增和測序。

        該系統(tǒng)流體驅(qū)動液滴生成與RAGE類似,同為重力進(jìn)樣法。通過調(diào)節(jié)進(jìn)樣架與芯片內(nèi)流體的液面差,進(jìn)行液滴生成的調(diào)控。當(dāng)液面差在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定時,可保證油水界面穩(wěn)定存在于油池位置,當(dāng)抬升進(jìn)樣架將液面差增加時,水相被擠入油池觸發(fā)液滴生成。

        EasySort Lego/Compact的單細(xì)胞分選準(zhǔn)確率大于99.7%,保證10~20細(xì)胞/min的分選通量,并高度保持了細(xì)胞活性。此外,EasySort Lego/Compact繼承了RAGE小尺寸分離反應(yīng)的特點(diǎn),顯著降低了傳統(tǒng)單細(xì)胞基因擴(kuò)增中存在的歧化現(xiàn)象。例如,使用該系統(tǒng)分選人體MCF-7單細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq,可獲得高質(zhì)量和高可重復(fù)性的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜。EasySort Lego/Compact的通用性、方便性、靈活性和低成本等優(yōu)勢為其在單細(xì)胞多組學(xué)研究中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。雖然EasySort Lego/Compact在RAGE單細(xì)胞分選技術(shù)原理的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了分選通量與便利性,但是單細(xì)胞的分選及收集導(dǎo)出仍需要復(fù)雜的人工操作。

        2.1.2 EasySort AUTO儀器原理

        EasySort AUTO在EasySort Lego/Compact的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了自動化與便利性,實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞自動化的分選及收集導(dǎo)出[35]。系統(tǒng)搭載的AI輔助圖像識別算法可以智能化、自動化地識別目標(biāo)細(xì)胞;系統(tǒng)嵌入的光鑷技術(shù)可以捕捉并精準(zhǔn)操控目標(biāo)細(xì)胞;最后,利用了基于界面接觸的微量液體分離專利技術(shù),目標(biāo)細(xì)胞能夠以單管單細(xì)胞(one-cell-one-tube)的形式自動收集于PCR管中。

        該系統(tǒng)由四個主要模塊組成:用于真空輔助樣品加載的真空進(jìn)樣模塊;用于圖像觀察細(xì)胞的顯微成像模塊;用于操控單細(xì)胞的光鑷模塊;用于自動單細(xì)胞打印的單細(xì)胞收集模塊。研究人員采用模塊化的設(shè)計理念,通過光鑷模塊、自動采集模塊、正置顯微鏡的耦合,可以很容易地將各種主要商業(yè)品牌的顯微鏡改裝成具有自動化單細(xì)胞分選收集的EasySort AUTO。該系統(tǒng)的AI圖像識別的準(zhǔn)確率達(dá)80%,分選通量約為120細(xì)胞/h,單管單細(xì)胞的概率高于93%,同時分選的目標(biāo)單細(xì)胞可以直接開展單細(xì)胞測序、培養(yǎng)等工作,單細(xì)胞測序成功率高于84.2%;酵母細(xì)胞和大腸桿菌單細(xì)胞培養(yǎng)的成功率分別約為85%和80%。

        EasySort AUTO的設(shè)計具備三個顯著特點(diǎn):①廣譜適用性,由于光鑷可以操控不同尺寸的細(xì)胞,該系統(tǒng)廣泛適用于各類單細(xì)胞的分離、分選、培養(yǎng)及測序?qū)嶒?yàn);②靈活性,該系統(tǒng)采用模塊化的設(shè)計,可通過安裝“巧手”——光鑷模塊和自動收集模塊,將生物實(shí)驗(yàn)室常見的正置顯微鏡升級為單細(xì)胞分選裝置;③高活性保持,分選后的目標(biāo)細(xì)胞具備較高的活性和DNA/RNA質(zhì)量。

        2.2 應(yīng)用

        EasySort系列儀器可依據(jù)細(xì)胞形態(tài)和SCRS分選色素酵母細(xì)胞[圖3(b)]。由于分選過程中,可以對細(xì)胞池內(nèi)所有細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞精度的拉曼成像鑒別,且拉曼成像時間不受限制,因此即使細(xì)胞池中僅存在1個目標(biāo)細(xì)胞,也可被EasySort識別并分選獲得,證明了其在低豐度目標(biāo)細(xì)胞體系的適用性。

        將色素酵母與非色素酵母混合(1∶100),以色素酵母細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選。利用EasySort對視野中的所有酵母細(xì)胞進(jìn)行拉曼判別,結(jié)果顯示視野中約80個細(xì)胞里存在1個色素酵母細(xì)胞[圖3(b)中圈出的細(xì)胞為色素酵母細(xì)胞],該細(xì)胞的明場形態(tài)與非色素酵母細(xì)胞無明顯差異,并且已進(jìn)入出芽狀態(tài),具有強(qiáng)色素峰。將該細(xì)胞導(dǎo)出到離心管中,加入培養(yǎng)基在30 ℃條件下孵育培養(yǎng)48 h,離心所得細(xì)胞沉淀,呈明顯橘黃色,即類胡蘿卜素顏色,與原始混合樣本的沉淀存在顯著區(qū)別,證明了EasySort可對低豐度樣本進(jìn)行單細(xì)胞拉曼篩選,分選細(xì)胞可再次培養(yǎng),分選結(jié)果具有高準(zhǔn)確度??紤]到每個細(xì)胞池中可裝載小于10 000個細(xì)胞,因此理論上單塊芯片上可分選豐度大于0.01%的目標(biāo)細(xì)胞。

        2.3 小結(jié)

        明場圖像、熒光圖像、拉曼光譜均可反映細(xì)胞豐富的表型信息,是匯集上述信息并具備單細(xì)胞精度索引、所見即所得特點(diǎn)的單細(xì)胞分選技術(shù),在單細(xì)胞分析工作中具有廣泛的適用性。EasySort Lego/Compact使細(xì)胞能夠以精確索引的方式進(jìn)行分類,“所見即所得”,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其單細(xì)胞率大于99.7%,近乎百分之百,并高度保持了細(xì)胞活性[34]。EasySort AUTO在EasySort Lego/Compact基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展了自動化單細(xì)胞檢測、目標(biāo)細(xì)胞識別、目標(biāo)細(xì)胞導(dǎo)出的功能,并與下游高通量單細(xì)胞測序平臺耦合,實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞自動化的分選及收集導(dǎo)出[35]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其單細(xì)胞率在93%以上,也說明了自動化的收集方式損失了一定的準(zhǔn)確率。EasySort系列儀器集成的光鑷模塊,適用于各類單細(xì)胞的精準(zhǔn)操控,因此EasySort廣泛適用于從細(xì)菌、古菌到人體細(xì)胞等不同尺寸大小的單細(xì)胞。另外,EasySort系列儀器分選的單細(xì)胞可以直接支撐高質(zhì)量的單細(xì)胞基因組/轉(zhuǎn)錄組測序,為該系列儀器在單細(xì)胞多組學(xué)研究中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。

        3 高通量流式拉曼分選儀(FlowRACS)

        SCRS具有非標(biāo)記、無損、快速測量細(xì)胞代謝表型組、可與單細(xì)胞測序?qū)拥葍?yōu)勢。每個SCRS均是一個信息豐富的生化指紋圖譜,可指示細(xì)胞的代謝狀態(tài),因此可以基于單峰、多峰乃至全譜的組合模式進(jìn)行建模從而解析不同細(xì)胞表型?;诶庾V強(qiáng)大的表型識別能力發(fā)展的FlowRACS,無須分離培養(yǎng)、在單細(xì)胞精度直接鑒定單細(xì)胞種類,可并行測量底物代謝、物質(zhì)合成、代謝物互作網(wǎng)絡(luò)、環(huán)境應(yīng)激、物種間互作等代謝表型組及其細(xì)胞間異質(zhì)性。FlowRACS實(shí)現(xiàn)了活體單細(xì)胞超高通量拉曼分選的高度自動化,為單細(xì)胞層面的代謝表型快檢、種質(zhì)資源挖掘和功能機(jī)制研究提供了新一代裝備解決方案[圖4(a)]。

        3.1 儀器原理

        RACS-Seq可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞表型與高質(zhì)量基因型對接,但其通量依然相對較低,難以實(shí)現(xiàn)自動化操作,這也極大地限制了RACS-Seq在大體系突變體庫中的應(yīng)用。概言之,通量低是限制當(dāng)前RACS技術(shù)在單細(xì)胞表型檢測與分選中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵瓶頸之一,急需發(fā)展高通量RACS技術(shù)。將拉曼光譜細(xì)胞識別技術(shù)與流式分選技術(shù)耦聯(lián)是建立高通量RACS技術(shù)的重要思路,即流式拉曼分選技術(shù)。

        研究人員以RAMS[26]、RADS[27]、pDEPRADS[28]等流式分選技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了FlowRACS,其自動化程度及通量相比RACS-Seq更高,因此更適合于合成生物表型檢測和分選,已成功示范微藻、酵母等細(xì)胞的色素、油脂等表型的篩選。Zhang等[26]構(gòu)建了RAMS平臺,其通過集成電極施加介電場捕獲單細(xì)胞進(jìn)行拉曼精確檢測,利用電磁閥吸吮分離獲取目標(biāo)細(xì)胞,最終實(shí)現(xiàn)了色素酵母細(xì)胞的拉曼流式篩選(約60個/min)。這一技術(shù)被The Scientist專文推介,被認(rèn)為是通往高通量拉曼細(xì)胞分選的關(guān)鍵技術(shù)突破?;诮殡妼⒏咚倭鲃訂渭?xì)胞捕獲在拉曼激光位點(diǎn)從而高效完成拉曼檢測的策略,為解決由于大多數(shù)細(xì)胞自發(fā)拉曼信號弱導(dǎo)致無法檢測高速流動細(xì)胞的拉曼信號的瓶頸問題提供了新思路。為進(jìn)一步提高分選通量和分選準(zhǔn)確率,Wang等[27]通過先拉曼檢測后液滴包裹的策略搭建了RADS平臺,引入液滴微流控技術(shù),使得系統(tǒng)的分選通量可達(dá)約260個細(xì)胞/min,針對雨生紅球藻中蝦青素含量的分選準(zhǔn)確率達(dá)到95%以上,分選后細(xì)胞存活率達(dá)93%,是當(dāng)時已報道工作中全譜分選通量最高的拉曼流式分選系統(tǒng)。但是,由于自然界中絕大多數(shù)細(xì)胞的自發(fā)拉曼信號較弱,RADS非捕獲的檢測策略使其同RAMS一樣局限于強(qiáng)拉曼信號(如共振拉曼信號)的檢測篩選。實(shí)現(xiàn)弱拉曼表型的檢測及高通量分選一直是拉曼分選的終極目標(biāo)之一。Wang等[28]在RADS平臺基礎(chǔ)上進(jìn)一步集成了介電捕獲細(xì)胞策略,開發(fā)了首套兼具普適性和通量的pDEP-RADS平臺,示范了油脂酵母甘油三酯含量和不飽和度的篩選,經(jīng)過一輪篩選成功從二?;视王;D(zhuǎn)移酶(DGAT)基因庫中篩選出3個已報道的強(qiáng)功能基因和2個未報道的弱功能基因[28]?;趐DEP-RADS和已研制的介電聚焦技術(shù),中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所(青島能源所)和青島星賽生物聯(lián)手推出國內(nèi)外首臺高通量拉曼流式分選儀FlowRACS,真正將拉曼分選推向市場應(yīng)用。然而,pDEP-RADS雖然解決了弱拉曼信號表型檢測的瓶頸問題,但其穩(wěn)定運(yùn)行時間僅有30 min,無法普適于大體系細(xì)胞篩選。為了提高系統(tǒng)的運(yùn)行時間以及系統(tǒng)的普適性,Wang等[9]近期開發(fā)了“介電誘導(dǎo)確定性側(cè)向位移實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞聚焦、捕獲/釋放的拉曼流式檢測技術(shù)”(positive dielectrophoresis induced deterministic lateral displacement-based Raman flow cytometry; pDEPDLD-RFC),通過寬流場高流量的進(jìn)樣策略,有效防止細(xì)胞沉降,從而實(shí)現(xiàn)了長時間穩(wěn)定運(yùn)行(>5 h),并證明其針對人體細(xì)胞(腫瘤)、植物(微藻)、酵母和細(xì)菌等多種細(xì)胞類型的廣譜適用性?;谏鲜鲫P(guān)鍵技術(shù)突破,青島能源所和青島星賽生物聯(lián)手推出了兼具廣譜通用性、高通量、運(yùn)行穩(wěn)定性等性能的新一代FlowRACS,為活體單細(xì)胞代謝表型組的高通量檢測提供了全新工具。

        3.2 應(yīng)用

        3.2.1 基于FlowRACS的DGATs酶活的篩選

        目前,流式拉曼分選服務(wù)于合成生物學(xué)領(lǐng)域中最為成功的應(yīng)用案例是基于FlowRACS的DGATs酶活篩選[28]。在酶和微生物細(xì)胞工廠的設(shè)計中,篩選酶庫的胞內(nèi)活性通常是一個限速步驟。傳統(tǒng)的DGATs篩選方法通常包括候選酶基因在底盤細(xì)胞中的表達(dá)、細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)以積累足夠生物質(zhì)、從生物質(zhì)中提取并通過薄層色譜法分離甘油三酯(TAG)產(chǎn)物、用氣相和液相質(zhì)譜來分析和定量TAG中組分等繁雜步驟[36-37],這一流程耗時耗力。Wang等[28]以產(chǎn)油酵母突變體庫的篩選進(jìn)行了應(yīng)用示范。將多個基因進(jìn)行同步轉(zhuǎn)化構(gòu)建突變體庫,經(jīng)誘導(dǎo)累積TAG后直接進(jìn)行基于FlowRACS的篩選,分選后的細(xì)胞一部分進(jìn)行高通量測序以檢測目標(biāo)細(xì)胞中的功能基因,另一部分平板培養(yǎng)后進(jìn)行單克隆測序以檢測每個克隆的細(xì)胞類型,從而獲取到目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測[圖4(b)]。

        結(jié)果表明,基于FlowRACS篩選甘油三酯含量的酵母表現(xiàn)出接近理論極限的準(zhǔn)確性,約120個(細(xì)胞)/min的通量和充分的活力保存,而篩選脂肪酸不飽和程度(FA-DU)在約40個(細(xì)胞)/min的準(zhǔn)確率為82%。從表達(dá)DGATs的酵母文庫中成功獲得3個已報道的強(qiáng)效基因和2個從未報道過的弱效基因[28]。這是FlowRACS用于酶發(fā)現(xiàn)的首次演示,與基于培養(yǎng)的方法相比,它在時間、耗材和勞動力方面節(jié)省了數(shù)百倍。

        3.2.2 高通量高穩(wěn)定性的拉曼流式細(xì)胞術(shù)

        基于新一代FlowRACS,研究人員開發(fā)了其在腫瘤細(xì)胞分類、微藻合成過程監(jiān)控、產(chǎn)油酵母多表型監(jiān)控、細(xì)菌藥敏性檢測等方面的應(yīng)用,展現(xiàn)了其在高通量拉曼流式檢測的廣闊應(yīng)用前景(圖5)[9]。

        圖5 基于FlowRACS單細(xì)胞拉曼表型檢測分選的應(yīng)用Fig. 5 Applications of FlowRACS for Raman-activated single-cell phenotype detection and sorting

        (1)植物生物制造過程的代謝監(jiān)控 基于共振拉曼信號,實(shí)現(xiàn)了雨生紅球藻中蝦青素含量的實(shí)時監(jiān)測,從而示范了單細(xì)胞精度的蝦青素累積過程細(xì)胞工廠代謝狀態(tài)的監(jiān)控,并考察了高光和缺氮等條件對細(xì)胞蝦青素累積速度及其同步性的影響。其蝦青素含量檢測速度達(dá)約2700 events/min,是目前最高的自發(fā)拉曼檢測/分選通量。

        (2)酵母生物制造過程的代謝監(jiān)控 基于非共振拉曼信號,示范了油脂酵母中細(xì)胞代謝活力、甘油三酯含量、油脂不飽和度等多個關(guān)鍵代謝表型的同步動態(tài)監(jiān)控,進(jìn)而通過拉曼組機(jī)器學(xué)習(xí)、拉曼組內(nèi)關(guān)聯(lián)分析(intra-Ramanome correlation analysis,IRCA)等算法,實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞代謝狀態(tài)(準(zhǔn)確率>96%)的實(shí)時鑒定,以及細(xì)胞內(nèi)代謝物相互轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)的實(shí)時重建。

        (3)細(xì)菌藥敏性的流式快檢 基于單細(xì)胞中心前期提出的重水飼喂單細(xì)胞拉曼藥敏原理,以大腸桿菌和多種常見抗生素為例,開發(fā)了流式藥敏快檢技術(shù),并通過與拉曼藥物應(yīng)激條形碼(Raman barcode for cellular stress-response,RBCS)、IRCA、拉曼組機(jī)器學(xué)習(xí)等算法結(jié)合,證明該流式藥敏快檢技術(shù)還能實(shí)時地判斷單菌體精度的藥物應(yīng)激狀態(tài)、構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)代謝物相互轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)等,從而揭示細(xì)菌-藥物互作機(jī)制。此外,流式檢測大大提高了藥敏檢測中SCRS取樣深度,對于識別群體中通常占比很低的耐藥細(xì)胞具有重要的意義。

        (4)腫瘤細(xì)胞類型的快速區(qū)分 基于SCRS中信息豐富的指紋區(qū),以膀胱癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌等細(xì)胞株為例,證明流式拉曼技術(shù)耦合拉曼組機(jī)器學(xué)習(xí)算法,能以平均大于95%的準(zhǔn)確率完成腫瘤細(xì)胞類型的快速判別。該方法對于腫瘤細(xì)胞質(zhì)量檢測等應(yīng)用具有潛在的應(yīng)用價值。

        3.3 小結(jié)

        FlowRACS的研制與發(fā)展經(jīng)過了漫長的技術(shù)迭代,結(jié)合了多種流式分選技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),發(fā)展為以pDEP-RADS技術(shù)為核心的儀器。FlowRACS的出現(xiàn)代表著拉曼流式分選儀真正走向市場應(yīng)用的開端,然而儀器的研制與發(fā)展需要經(jīng)受住市場的考驗(yàn)。FlowRACS在進(jìn)行實(shí)際樣品篩選時,由于樣品沉降導(dǎo)致的系統(tǒng)運(yùn)行時間較短。研究人員針對這一瓶頸問題,從原理創(chuàng)新開發(fā)了pDEP-DLD-RFC,通過寬流場高流量的進(jìn)樣策略有效防止細(xì)胞沉降,從而實(shí)現(xiàn)了長時間穩(wěn)定運(yùn)行(>5 h)。以pDEPDLD-RFC為技術(shù)核心的新一代FlowRACS目前僅具有拉曼流式檢測的功能,具有高通量拉曼流式分選功能的儀器版本已經(jīng)在研制中,將于近期發(fā)布。FlowRACS儀器以免培養(yǎng)和非標(biāo)記的方式有效地建立單細(xì)胞表型-基因型連接,可高通量、高穩(wěn)定性地分選功能單細(xì)胞,以滿足合成生物學(xué)等領(lǐng)域?qū)渭?xì)胞高通量表型篩選的需求。

        4 總結(jié)展望

        合成生物學(xué)的迅速發(fā)展為基于SCRS技術(shù)的合成表型測試分選裝備的發(fā)展提供了新的機(jī)遇。合成細(xì)胞表型的測試和分選是合成生物學(xué)的重要核心之一,也是當(dāng)前的限速步驟之一。發(fā)展高效的表型檢測和分選技術(shù)對于加速合成生物學(xué)的發(fā)展至關(guān)重要[38]。SCRS技術(shù)因其具有活體無損、非標(biāo)記式、提供全景式表型、能分辨復(fù)雜功能、快速且低成本、能與組學(xué)分析聯(lián)動等優(yōu)勢,被認(rèn)為是一種理想的表型識別技術(shù)[18-20]。基于SCRS技術(shù)強(qiáng)大的表型識別能力,國內(nèi)外已搭建了針對不同應(yīng)用場景的RACS平臺?;赗ACS發(fā)展的多種技術(shù)在合成生物學(xué)領(lǐng)域的潛力挖掘與實(shí)現(xiàn)還需克服諸多挑戰(zhàn),同時也存在巨大機(jī)遇。

        在基于拉曼光譜的表型檢測方面,針對不同場景、不同細(xì)胞、不同表型的拉曼表型檢測表明,SCRS可以解析或預(yù)測不同細(xì)胞功能表型,如在一定程度上量化檢測細(xì)胞利用含氫[39]、含碳[40]等底物的代謝速率、測定各種拉曼敏感產(chǎn)物(色素[41]、甘油三酯[42]、淀粉[43]、蛋白[44]等)的多樣性及其含量、表征細(xì)胞的環(huán)境應(yīng)激性(如微生物藥敏[45]、微生物藥物應(yīng)激機(jī)制[46]、腫瘤藥敏性與藥物應(yīng)激機(jī)制[47]等)、檢測細(xì)胞之間的代謝互作[48]、重建細(xì)胞內(nèi)代謝物相互轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)(拉曼組內(nèi)關(guān)聯(lián)分析;IRCA)[49],也可區(qū)分不同的物種[50]等。盡管SCRS具有這些的優(yōu)點(diǎn),但也在靈敏度和噪聲等方面存在一些劣勢。SCRS的信號強(qiáng)度通常較弱,因此,需要高功率的激光和高靈敏度的光譜儀才能夠獲取可靠的信號。對于一些化學(xué)成分含量較低的樣品可能會無法檢測到,或者誤判成噪聲信號。另外,在測量過程中會受到許多干擾。例如,來自儀器的背景噪聲、激光的強(qiáng)烈散射和熒光等。這些噪聲會干擾到拉曼信號的檢測和解析。因此。需要在實(shí)際應(yīng)用中加以考慮和解決。例如,基于無須預(yù)知靶點(diǎn)的標(biāo)記策略,如穩(wěn)定同位素標(biāo)記(13C、15N、2H等)策略[18],可在一定程度上補(bǔ)償并提高檢測靈敏度、特異性等。

        在原理創(chuàng)新方面,現(xiàn)有這些平臺中,靜態(tài)模式的RACS能精確將單個細(xì)胞分離到單管/孔中,從而和下游單細(xì)胞組學(xué)無縫銜接,以支撐功能單細(xì)胞的挖掘,但是目前的通量和自動化程度較低;流動模式的RACS自動化程度更高,在分選通量上也有了數(shù)量級的提高,但是目前的基于流動模式分選后的單細(xì)胞往往是以群體分類,丟失了索引信息。因此,根據(jù)實(shí)際的應(yīng)用需求選擇合適的模式,充分利用不同模式RACS的獨(dú)特優(yōu)勢,有望在一定程度上解決合成生物表型檢測和分選的瓶頸問題。另外,研制結(jié)合兩種模式優(yōu)勢的RACS有望帶給合成生物學(xué)領(lǐng)域更大的發(fā)展。

        在儀器研制方面,目前的RACS平臺技術(shù)更多處于實(shí)驗(yàn)室搭建狀態(tài),以RACS技術(shù)為核心的市場化儀器研制方面還比較空缺。以RACE為關(guān)鍵技術(shù)的PRECI SCS,可實(shí)現(xiàn)微生物單細(xì)胞的自動化分離并耦合下游單細(xì)胞測序,但由于RACE對細(xì)胞的損傷,導(dǎo)致其存在單細(xì)胞全基因組覆蓋度低的問題。以RAGE為關(guān)鍵技術(shù)的RACS-Seq,同樣實(shí)現(xiàn)了微生物單細(xì)胞分離并耦合下游單細(xì)胞測序,其損傷更小,單細(xì)胞全基因組測序覆蓋度更高,但第一代機(jī)器自動化程度較低。為了提高分選的便利性和通量,研究人員開發(fā)了EasySort系列儀器進(jìn)行了原理的創(chuàng)新和迭代,引入人工智能輔助的單細(xì)胞檢測、目標(biāo)細(xì)胞識別、目標(biāo)單細(xì)胞液滴導(dǎo)出技術(shù),并與下游高通量單細(xì)胞測序平臺耦合,初步實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞分選的自動化運(yùn)行。此外,以pDEP-RADS為技術(shù)核心的FlowRACS,其自動化程度及通量更高,因此更適合于合成生物表型檢測和分選,F(xiàn)lowRACS的出現(xiàn)代表著拉曼流式分選儀真正走向市場應(yīng)用的開端。然而儀器的研制與發(fā)展需要經(jīng)受住市場的考驗(yàn)。以pDEP-DLD-RFC為技術(shù)核心進(jìn)行了系統(tǒng)的迭代升級,推出了新一代FlowRACS,將大大加速拉曼流式分選平臺的推廣應(yīng)用。目前已在研制高通量流式拉曼分選儀版本,有望近期發(fā)布。該儀器已成功示范微藻、酵母等細(xì)胞的色素、油脂等表型的篩選,腫瘤細(xì)胞分類、微藻合成過程監(jiān)控、產(chǎn)油酵母多表型監(jiān)控、細(xì)菌藥敏性檢測,其更多應(yīng)用場景有待市場的拓展。

        最后,在儀器國產(chǎn)化方面,我國在拉曼分選儀研制方面處于國際領(lǐng)先地位,雖然已經(jīng)自主開發(fā)了智能化的光譜分析系統(tǒng)以及操作軟件,但儀器的一些核心部件,如光譜儀、CCD等仍依賴于進(jìn)口。儀器國產(chǎn)化的研制是接下來各行業(yè)共同的努力目標(biāo)。

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