盧揮，張芳麗，黃磊，2

（1 浙江大學(xué)杭州國際科創(chuàng)中心，杭州 浙江 311215； 2 浙江大學(xué)生物工程研究所，化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310058）

合成生物學(xué)是一個匯聚了生命科學(xué)、工程學(xué)和信息科學(xué)等諸多學(xué)科的新興交叉學(xué)科，是現(xiàn)代生物學(xué)最具發(fā)展?jié)摿Φ难芯款I(lǐng)域之一［1-2］。繼“DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)”和“人類基因組測序”之后，合成生物學(xué)被譽(yù)為第三次生物技術(shù)革命［3］。合成生物學(xué)將正向工程學(xué)“自下而上”的“建造”理念與系統(tǒng)生物學(xué)“自上而下”的“分析”理念相結(jié)合，對生物體進(jìn)行有目標(biāo)的設(shè)計、改造乃至重新合成，創(chuàng)建賦予非自然功能的“人造生命”［4］。研究過程涉及對大量基因元件、線路和系統(tǒng)的合成與調(diào)試，需要對細(xì)胞進(jìn)行“重編程”以實現(xiàn)特定功能［5］。因生命體是復(fù)雜的高維度非線性系統(tǒng)，人們對其有限的理解使得人工設(shè)計的基因線路往往難以達(dá)到預(yù)期的工作效果，而目前反復(fù)的人工試錯實驗?zāi)Ｊ揭矊?dǎo)致新的人工生命的研發(fā)周期長、失敗率高［6-8］。自動化合成生物技術(shù)的發(fā)展結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化實驗策略，高通量、低成本、多循環(huán)地完成“設(shè)計-構(gòu)建-測試”閉環(huán)，將有助于大幅度提高合成生物學(xué)的研究效率［9-10］。

自動化生物鑄造廠（BioFoundry）是一種集成式的自動化科學(xué)設(shè)施，把自動化工業(yè)的智能制造理念與合成生物學(xué)理論基礎(chǔ)相結(jié)合，通過智能化、自動化的高通量設(shè)備，實現(xiàn)對“重編程”生命體的快速構(gòu)建和測試［11-12］。目前，已有多個將BioFoundry用于支撐合成生物學(xué)相關(guān)研究和應(yīng)用的案例，展現(xiàn)了BioFoundry在提升實驗通量、降低實驗成本、快速積累大量數(shù)據(jù)和提高研究效率等多方面的優(yōu)勢。美國伊利諾伊大學(xué)香檳分校的iBioFAB平臺開發(fā)了釀酒酵母基因組定向進(jìn)化的全自動操作方法，并用于提高乙酸耐受性能的高通量篩選，實驗效率是手工操作的10倍以上［13］。iBioFAB每天還可以構(gòu)建約1000個定制化的TALEN，成功率在96%以上，平均構(gòu)建成本小于3美元，大約是人工操作成本的0.3%［14］。英國愛丁堡大學(xué)的EGF每周可以完成超過2000個DNA組裝反應(yīng)，通量相當(dāng)于研究人員手工操作的20倍［15］。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的自動化平臺每天可以完成300～600個自動化單基因克隆，對復(fù)雜質(zhì)粒的多模塊化組裝也達(dá)到100個/天的通量，組裝正確率達(dá)到90%以上［16］。2019年5月“全球合成生物設(shè)施聯(lián)盟”（Global Biofoundry Alliance，GBA）在日本正式成立［17］，截止到目前GBA成員已經(jīng)達(dá)到35個。GBA的成立促進(jìn)了全球BioFoundry成員之間的溝通交流，促成各方標(biāo)準(zhǔn)實驗程序、通用技術(shù)路線、數(shù)據(jù)模型和應(yīng)用實例等資源的開放共享，有助于推動BioFoundry成員間的合作以共同應(yīng)對和解決能源、健康、環(huán)境等全球性與社會性的問題［18-21］。

浙江大學(xué)杭州國際科創(chuàng)中心是浙江大學(xué)和杭州市全面深化市校戰(zhàn)略合作共建的重大科技創(chuàng)新平臺。中心下屬的生物與分子智造研究院利用浙江大學(xué)的學(xué)科會聚和工程化優(yōu)勢，建設(shè)合成生物學(xué)自動化裝置iBioFoundry，力爭構(gòu)建深度融合“BT+IT”的高能級合成生物學(xué)研究平臺。合成生物學(xué)、自動化技術(shù)及機(jī)器學(xué)習(xí)的天然互補(bǔ)屬性也使iBioFoundry成為實現(xiàn)“BT+IT”深度融合的理想載體。合成生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化和模塊化特性是實現(xiàn)合成生物構(gòu)建過程全流程自動化的理論基礎(chǔ)；iBioFoundry的高效性、高通量性和高度可重復(fù)性保障了機(jī)器學(xué)習(xí)所需大量的高質(zhì)量數(shù)據(jù)；而機(jī)器學(xué)習(xí)又可以指導(dǎo)合成生物元件和人工細(xì)胞的智能編程設(shè)計、自動化標(biāo)準(zhǔn)化構(gòu)建和測試、生產(chǎn)過程的精確控制，從而大幅提高合成生物學(xué)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究效率［22-23］。本文將從iBioFoundry的構(gòu)建方案、科研項目開展、實驗運(yùn)行和建設(shè)經(jīng)驗等方面進(jìn)行介紹。

1 iBioFoundry構(gòu)建方案

生命體作為合成生物學(xué)的研究對象具有高度動態(tài)、調(diào)控靈活、非線性等特征，如何對其進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測和設(shè)計是合成生物學(xué)面臨的核心挑戰(zhàn)。研究常需從“整體或系統(tǒng)”層面切入，對基因片段、代謝網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，甚至是細(xì)胞整體進(jìn)行人工設(shè)計與合成，實驗工作量大、通量需求高。本方案希望通過整合自動化設(shè)備、智能化控制以及數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，構(gòu)建一套合成生物學(xué)自動化裝置，實現(xiàn)從生物樣本存取、DNA元件組裝、細(xì)胞篩選及培養(yǎng)到產(chǎn)物檢測的全流程自動化操作，達(dá)到高通量實驗標(biāo)準(zhǔn)化和高效率的目標(biāo)。

1.1 設(shè)計思路

iBioFoundry采用模塊化設(shè)計，利用軌道式機(jī)械臂整合各種外周設(shè)備，構(gòu)建樣本庫、DNA元件組裝、細(xì)胞篩選及培養(yǎng)、分析檢測四大功能模塊，實現(xiàn)合成生物學(xué)實驗的自動化。裝置整體設(shè)計具備開放性，臺面布局相對寬松，后期可以通過設(shè)備的位移、層疊或添加，實現(xiàn)設(shè)備布局的靈活變動或裝置功能的升級。根據(jù)不同模塊的實驗操作需求和特點(diǎn)，裝置搭配使用工業(yè)級和協(xié)作式機(jī)械臂，從而兼具工業(yè)機(jī)械臂的高效率、高穩(wěn)定性和協(xié)作式機(jī)械臂操作靈活的特性。裝置中機(jī)械臂可與所有外周設(shè)備直接交互，避免以往某些設(shè)計中個別設(shè)備需要通過移液工作站中轉(zhuǎn)樣本的情況，以此提高設(shè)備調(diào)用的靈活性。對于裝置中經(jīng)常需要進(jìn)行耗材試劑補(bǔ)充或配件更換的設(shè)備，在設(shè)備底部增加滑軌或轉(zhuǎn)盤以方便其使用和維護(hù)。同時為了保障實驗環(huán)境的無菌需求，DNA元件組裝和細(xì)胞篩選及培養(yǎng)兩大模塊采用封閉式設(shè)計，配備全覆蓋式HEPA空氣過濾裝置。

為滿足不同科研任務(wù)需求，最大程度提升裝置使用效率，iBioFoundry設(shè)計具備多實驗任務(wù)進(jìn)程管理功能，能追蹤記錄全部實驗流程的過程處理信息，實現(xiàn)所有樣本的追蹤溯源。裝置的優(yōu)勢和特點(diǎn)包括：①自動化無人值守工作；②多個不同實驗任務(wù)可同時運(yùn)行；③運(yùn)行過程中可隨時修改或添加新實驗任務(wù)；④運(yùn)行過程中插入優(yōu)先處理的緊急樣本；⑤運(yùn)行過程中動態(tài)補(bǔ)充耗材、試劑；⑥根據(jù)實驗結(jié)果完成智能化邏輯判斷；⑦具有完備的設(shè)備故障恢復(fù)策略；⑧實現(xiàn)遠(yuǎn)程和批量接收任務(wù)指令功能等。

1.2 各模塊設(shè)備集成及功能

1.2.1 DNA元件組裝模塊

DNA元件組裝模塊承擔(dān)的主要實驗任務(wù)包括：基因片段的擴(kuò)增、純化、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及各種生化反應(yīng)體系的配制等。該模塊實驗操作通量大，樣品板在各設(shè)備間移動頻繁。工業(yè)級機(jī)械臂具有效率高、穩(wěn)定性好的特性，能承擔(dān)長時間、高頻率的高負(fù)荷任務(wù)，所以此模塊中配備了高性能的工業(yè)級F7機(jī)械臂來完成樣本在各設(shè)備間的轉(zhuǎn)移。整合的設(shè)備包括移液工作站、納升級聲波移液站、自動化封膜機(jī)和撕膜機(jī)、自動化PCR儀、自動化離心機(jī)和自動化耗材存儲設(shè)備等。

移液工作站作為該模塊的核心設(shè)備，同時配備了8通道和96通道兩個移液機(jī)械臂及一個抓扳手機(jī)械臂，主要用于樣品的高通量快速加樣、分裝、稀釋、混合等操作。移液工作站臺面還配置有溫控、振蕩和磁力架配件，可滿足試劑或感受態(tài)細(xì)胞低溫放置、樣品快速混勻、產(chǎn)物磁珠純化等實驗步驟中的多種操作需求。納升級聲波移液站可滿足小體積反應(yīng)體系的需求，設(shè)備通過聲波實現(xiàn)高精度微量樣本（最小液體轉(zhuǎn)移體積為25 nL）轉(zhuǎn)移，具有速度快、無需吸頭和無物理接觸的特點(diǎn)，可有效避免交叉污染。模塊內(nèi)還包含4臺自動化PCR儀，并由中控軟件設(shè)置為一個PCR設(shè)備集合，在同時進(jìn)行大量PCR實驗任務(wù)時可自動調(diào)整儀器分配，確保多個實驗任務(wù)的高效、連續(xù)運(yùn)行。緊鄰PCR儀的位置，配置有2臺封膜機(jī)和1臺撕膜機(jī)，分別用于孔板密封膜和透氣膜的封膜及撕膜需求。

1.2.2 細(xì)胞篩選及培養(yǎng)模塊

細(xì)胞篩選及培養(yǎng)模塊承擔(dān)的主要實驗任務(wù)包括：感受態(tài)細(xì)胞制備、菌液自動化涂板、平板靜置培養(yǎng)、克隆挑取、菌液振蕩培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、細(xì)胞破碎及蛋白純化等。此模塊也是利用工業(yè)級F7機(jī)械臂來進(jìn)行樣本在各設(shè)備間的傳遞，整合的設(shè)備包括移液工作站、自動化正壓過濾裝置、大體積快速分液器、自動化振蕩培養(yǎng)箱及靜置培養(yǎng)箱、自動化低溫冰箱、高速冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀和自動化耗材存儲設(shè)備等。

此模塊內(nèi)的移液工作站配備了8通道移液和抓扳手兩個機(jī)械臂，除配有溫控和振蕩配件外，還增加了克隆挑選和平板旋轉(zhuǎn)配件，滿足白光、熒光兩種方式菌落挑取及菌液涂布的需求。緊鄰移液工作站安裝有一套自動化正壓過濾裝置，可用于DNA和蛋白樣品的純化及液相色譜樣品的進(jìn)樣前處理。大體積快速分液器主要用于深孔板中培養(yǎng)基的快速分裝。2臺自動化振蕩培養(yǎng)箱和1臺靜置培養(yǎng)箱用于滿足微生物各種培養(yǎng)需求。高速冷凍離心機(jī)于臺面以下落地放置，在使用時可通過F7機(jī)械臂將需要低溫離心的樣品通過臺面的開孔送入離心機(jī)轉(zhuǎn)子內(nèi)。酶標(biāo)儀配置有吸收、熒光、自發(fā)光三種檢測模式，主要用于菌液生長情況和核酸濃度測定及各種酶活動力學(xué)分析。

1.2.3 分析檢測模塊

分析檢測模塊包括高效液相色譜儀、自動化核酸片段分析儀、流式細(xì)胞儀、熒光定量PCR儀四臺分析檢測設(shè)備和一臺耗材存儲堆棧，可滿足核酸質(zhì)檢、克隆鑒定、基因表達(dá)分析、蛋白及細(xì)胞代謝產(chǎn)物分析等多種檢測需求。不同于前述兩個模塊，分析檢測模塊采用開放式設(shè)計，可隨時接收并快速分析檢測樣品，也便于耗材、試劑的隨時添補(bǔ)及設(shè)備的日常維護(hù)。出于實驗工作量需求和安全性考慮，分析檢測模塊選擇使用協(xié)作式機(jī)械臂完成各設(shè)備及模塊間的實驗樣本傳送，主要原因有：①相較于前面兩大模塊，此處分析檢測實驗一般時間較長，機(jī)械臂移動頻率相對不高；②該模塊為開放模塊，操作人員可能隨時進(jìn)行樣本取放，協(xié)作式機(jī)械臂的碰撞檢測功能提高人機(jī)交互時的安全性；③在突然斷電或發(fā)生故障的情況下，孔板不會從機(jī)械臂抓手中掉落，實驗樣本的安全性得以保障。

在iBioFoundry日常運(yùn)行過程中，分析檢測設(shè)備常會有單機(jī)使用的需求，因此模塊內(nèi)還配備有一臺耗材存儲堆棧以提高分析檢測設(shè)備的使用靈活性。耗材存儲堆?？呻S時批量接收需在各設(shè)備待檢的新樣本，也可用于檢測完成樣本的暫存，保障裝置在控制系統(tǒng)調(diào)度下長時間、自動化批量處理多種分析檢測任務(wù)。另外，該耗材存儲堆棧處于開放環(huán)境中，操作人員可隨時經(jīng)由它向裝置內(nèi)的其他模塊補(bǔ)充耗材和試劑，同時裝置內(nèi)部的實驗樣本也可經(jīng)由它取出。

1.2.4 樣本庫模塊

樣本庫模塊用于菌種和合成生物學(xué)元件的存儲和取用。此模塊包含一臺可存儲超十萬根0.5 mL樣品管的-80 ℃自動化生物樣本存儲設(shè)備（Arktic，SPT labtech）以及配套的掃碼儀和開蓋機(jī)。Arktic可實現(xiàn)對大規(guī)模樣本的自動化管理，包括儲存、樣品追蹤以及按需自動化選取。設(shè)備內(nèi)部配置了二維條碼管理系統(tǒng)，所有樣品管帶有預(yù)制的二維條碼，全部存取過程均有記錄，可實現(xiàn)對樣品管的信息識別和存儲位置跟蹤。掃碼儀可以讀取樣品管的二維條碼并將二維條碼與樣本信息關(guān)聯(lián)上傳中央控制系統(tǒng)，開蓋機(jī)可以完成樣品管的整板開蓋和關(guān)蓋操作。樣本庫模塊與細(xì)胞篩選及培養(yǎng)模塊共用一個工業(yè)級F7機(jī)械臂完成樣本的傳輸。

iBioFoundry已建設(shè)完成并上線浙江大學(xué)杭州國際科創(chuàng)中心大型科研儀器開放共享平臺，對各高校、科研院所和企業(yè)用戶提供實驗服務(wù)和開展科研合作，裝置現(xiàn)場如圖1所示。

圖1 iBioFoundry裝置現(xiàn)場圖Fig. 1 Side view of iBioFoundry

2 科研項目的開展

2.1 科研項目的對接

不同于一般單臺儀器設(shè)備的使用，科研項目在裝置上成功落地運(yùn)行需要iBioFoundry研究團(tuán)隊（以下簡稱“IB團(tuán)隊”）和用戶之間充分且深入的溝通合作。在雙方初期溝通交流時，IB團(tuán)隊向用戶介紹iBioFoundry的構(gòu)造和功能，了解項目的研究背景、研究目標(biāo)、研究內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)和已有工作基礎(chǔ)等，明確用戶利用iBioFoundry完成的關(guān)鍵實驗內(nèi)容和實驗通量。在此基礎(chǔ)上，IB團(tuán)隊將從技術(shù)難度、通量需求、實驗安全性、研究周期和項目落地成熟度等方面對項目進(jìn)行綜合評估，同用戶商定工作目標(biāo)和進(jìn)度安排。在接下來的交流過程中，IB團(tuán)隊需要明確項目的技術(shù)路線、實驗材料、實驗方法、具體的實驗操作參數(shù)以及實驗中的注意事項等，擬定自動化方案設(shè)計意見并與用戶溝通確認(rèn)。

2.2 科研項目的自動化方案制定

自動化方案的制定是項目在iBioFoundry上成功運(yùn)行的關(guān)鍵。許多實驗操作在自動化運(yùn)行時與線下手工操作有所不同，因此相關(guān)的實驗步驟、反應(yīng)體系、實驗參數(shù)、實驗通量等都需進(jìn)行適應(yīng)于自動化操作的調(diào)整。好的自動化方案需要達(dá)到運(yùn)行流暢、通量高、靈活性好、通用性強(qiáng)、易拓展和成本合理等目標(biāo)。自動化方案的制定由實驗流程拆解、實驗方法調(diào)整、程序編寫和自動化程序測試四個環(huán)節(jié)組成。

2.2.1 實驗流程拆解

自動化方案設(shè)計的第一步就是將項目的實驗流程基于iBioFoundry運(yùn)行特性按先后順序進(jìn)行拆解而形成多個子任務(wù)。實驗中反應(yīng)體系的配置或待測樣品的準(zhǔn)備主要在移液工作站上完成，因此移液工作站的操作一般會是實驗流程拆解的流程節(jié)點(diǎn)。例如，基因片段的擴(kuò)增和鑒定可以拆解成四個子任務(wù)，每個子任務(wù)中的實驗分別是：①移液工作站中配置PCR反應(yīng)體系、PCR板封膜、PCR反應(yīng)和PCR板撕膜；②移液工作站上PCR產(chǎn)物的純化；③移液工作站配制檢測樣品、核酸片段分析儀檢測；④移液工作站根據(jù)檢測結(jié)果選取PCR產(chǎn)物、PCR產(chǎn)物的保存。

2.2.2 實驗方法調(diào)整

將平時手工操作的實驗在iBioFoundry上自動化運(yùn)行時，往往需要對實驗方法進(jìn)行調(diào)整。常見的調(diào)整主要有以下幾類：①技術(shù)調(diào)整，如將PCR產(chǎn)物的手工切膠純化調(diào)整為使用移液工作站進(jìn)行的磁珠純化或使用自動化正壓過濾裝置進(jìn)行的過濾純化；②設(shè)備調(diào)整，如核酸檢測使用的水平電泳儀更改為核酸片段分析儀；③耗材調(diào)整，如離心管、搖瓶等更換為微孔板、深孔板等孔板類耗材；④操作調(diào)整，如借助移液工作站的振蕩配件完成試劑混勻操作、借助克隆挑選配件完成克隆挑取、借助平板旋轉(zhuǎn)配件完成菌液涂布等。

2.2.3 程序編寫

程序編寫分為以移液工作站為主的單機(jī)設(shè)備程序編寫和利用中控軟件實現(xiàn)的實驗流程自動化程序編寫。在移液工作站的程序編寫中，需要統(tǒng)計所需生物樣本、試劑和耗材的種類及數(shù)量，明確其進(jìn)出工作站的轉(zhuǎn)接位置和在工作站內(nèi)臺面的擺放位置，通過調(diào)用相應(yīng)機(jī)械臂完成液體取樣、加樣、孵育、振蕩、挑菌、涂布等各種操作。其余單機(jī)設(shè)備的程序編寫主要在相應(yīng)設(shè)備上設(shè)置或編寫完成并保存為可執(zhí)行文件，以供中控軟件在整個項目自動化運(yùn)行時隨時調(diào)用。在所有單機(jī)設(shè)備程序完成后，整體實驗流程的自動化程序由中控軟件（Momentum，Thermo Fisher Scientific）編寫，通過機(jī)械臂的程序設(shè)定串聯(lián)各子任務(wù)實驗，將實驗樣本按設(shè)計流程在iBioFoundry中逐步傳遞至各設(shè)備中并完成相應(yīng)操作。除機(jī)械動作外，實驗流程自動化程序編寫中還應(yīng)注意實驗數(shù)據(jù)的匯總和分析，結(jié)合數(shù)據(jù)生成與存儲、數(shù)據(jù)文件調(diào)用、邏輯條件判斷和多變量參數(shù)控制等軟件功能實現(xiàn)實驗流程的智能化選擇，并保存所有樣本的全過程處理信息。

2.2.4 自動化程序測試

在項目自動化運(yùn)行前，需要對編寫完成的自動化程序進(jìn)行測試，測試分為三步：模擬測試、水樣測試和生物樣本測試。模擬測試是利用中控軟件的模擬測試功能，在計算機(jī)上模擬實驗的運(yùn)行情況，排查真實運(yùn)行過程中可能出現(xiàn)的諸如設(shè)備使用沖突、位置占用、耗材數(shù)量不足等問題。水樣測試是以水溶液或其他試劑代替生物樣品進(jìn)行的真實運(yùn)行測試，實驗流程中涉及的所有設(shè)備程序和機(jī)械臂動作指令都會按設(shè)計執(zhí)行。水樣測試主要檢查各種反應(yīng)體系的配置是否準(zhǔn)確，各種機(jī)械動作是否運(yùn)行到位，設(shè)備聯(lián)動和數(shù)據(jù)通訊是否能順利完成。生物樣本測試則是使用真實生物樣本，以實驗結(jié)果為導(dǎo)向，驗證整個自動化程序運(yùn)行過程中每一個實驗步驟是否都能順利完成并達(dá)到預(yù)期結(jié)果。

2.3 科研項目的自動化運(yùn)行

項目在iBioFoundry上正式運(yùn)行前，應(yīng)檢查系統(tǒng)確保所有的電源、通訊、空氣、液體管路都已連接，確保系統(tǒng)運(yùn)行涉及的設(shè)備及輔助設(shè)施均已開啟并進(jìn)入工作狀態(tài)。實驗運(yùn)行中機(jī)械臂途經(jīng)的各個位置沒有無關(guān)耗材占據(jù)，所需生物樣本、試劑、耗材等補(bǔ)充齊全。安全及環(huán)境控制設(shè)備妥善啟動，系統(tǒng)軟件正常且無特殊報警標(biāo)識。實驗運(yùn)行中注意觀察各種機(jī)械動作執(zhí)行到位情況，如有狀況及時處理，留意出現(xiàn)的各種實驗現(xiàn)象并記錄。運(yùn)行結(jié)束后，妥善保存實驗樣本并及時處理操作過程中產(chǎn)生的廢棄耗材和廢液，將系統(tǒng)整體清理干凈以備后續(xù)實驗任務(wù)的執(zhí)行。

IB團(tuán)隊將實驗運(yùn)行得到的樣本和運(yùn)行總結(jié)報告一并提供給用戶。雙方對實驗運(yùn)行情況、實驗數(shù)據(jù)和所得樣本一起分析、探討。IB團(tuán)隊根據(jù)運(yùn)行中各實驗進(jìn)程完成情況、各設(shè)備占用時間分布等提出自動化優(yōu)化建議，用戶就實驗結(jié)果進(jìn)一步反饋需求，雙方共同研究并制定后續(xù)項目執(zhí)行方案。

3 iBioFoundry實驗運(yùn)行案例

iBioFoundry目前已成功實現(xiàn)大腸桿菌、酵母細(xì)胞、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌等多種工業(yè)微生物“人工細(xì)胞”的全自動構(gòu)建。本文以大腸桿菌工程菌的批量構(gòu)建為例，介紹項目自動化方案的制定過程和實驗在iBioFoundry上的具體運(yùn)行情況，并通過酶的定向進(jìn)化及篩選案例就實驗流程的智能化選擇和實驗通量進(jìn)行分析。

3.1 大腸桿菌工程菌的批量構(gòu)建

3.1.1 自動化方案的制定

按流程順序可將整個實驗拆解成9個子任務(wù)，依次是：PCR反應(yīng)、PCR產(chǎn)物純化、核酸片段分析、DNA組裝、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、菌液涂布培養(yǎng)、克隆挑選與培養(yǎng)、菌落鑒定以及菌株保存（圖2）。為了適應(yīng)自動化操作，部分實驗方法做如下調(diào)整：①以磁珠純化法代替切膠回收，利用移液工作站完成PCR產(chǎn)物的純化；②使用自動化核酸片段分析儀檢驗PCR產(chǎn)物的質(zhì)量；③利用熒光定量PCR儀對菌株構(gòu)建的正確性進(jìn)行驗證。

圖2 工程菌批量構(gòu)建實驗流程Fig.2 Procedure of high-throughput engineered E. coli construction

編寫實驗流程中各單機(jī)設(shè)備的運(yùn)行程序，9個子任務(wù)中的關(guān)鍵設(shè)備和所編寫的程序名稱見表1。在此基礎(chǔ)上，確定各設(shè)備的實驗操作參數(shù)，通過中控軟件利用程序并行、變量控制、邏輯判斷、數(shù)據(jù)提取、數(shù)據(jù)寫入等功能編寫完成整個實驗流程的自動化程序（圖3）。根據(jù)模擬測試、水樣測試和生物樣本測試的反饋結(jié)果對整個實驗流程的自動化程序做出進(jìn)一步的調(diào)整與優(yōu)化，并最終形成實驗的自動化方案。

表1 子任務(wù)實驗步驟和單機(jī)程序Table 1 Relevant operation and involved scripts of the experiment

圖3 實驗流程自動化程序編寫示意圖Fig.3 A simplified scheme of automated program

3.1.2 實驗自動化運(yùn)行

實驗上機(jī)運(yùn)行前首先對裝置進(jìn)行全面檢查，確保所有設(shè)備已上線并處于正常工作狀態(tài)。根據(jù)實驗自動化方案中程序?qū)τ趯嶒灢牧系奈恢迷O(shè)定，將所需試劑包括引物、DNA模板、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、PCR反應(yīng)試劑等和各類耗材分別添加至自動化低溫冰箱和各個自動化耗材存儲設(shè)備并確認(rèn)放置位置正確。iBioFoundry中共有24列載架、10列載架和6列載架三種不同容量規(guī)格的耗材存儲設(shè)備，分別位于DNA元件組裝模塊、細(xì)胞篩選及培養(yǎng)模塊和分析檢測模塊。實驗所需試劑和耗材的種類、數(shù)量以及在裝置中實驗開始及結(jié)束時的位置見表2。

表2 試劑與耗材信息Table 2 Reagents and consumables used in experiment

實驗流程的第一個子任務(wù)是PCR反應(yīng)，使用96對引物分別擴(kuò)增得到96個目的基因片段。工業(yè)級F7機(jī)械臂將引物、DNA模板、PCR反應(yīng)試劑等從自動化低溫冰箱內(nèi)依次取出，送至撕膜機(jī)撕膜后移至移液工作站備用。機(jī)械臂再從自動化耗材存儲設(shè)備內(nèi)依次取出1盒50 μL黑色吸頭、2盒50 μL透明吸頭和1塊96 孔微孔板轉(zhuǎn)移至移液工作站。試劑和耗材齊備后，移液工作站執(zhí)行PCR反應(yīng)體系配制程序，利用8通道和96通道移液機(jī)械臂分別吸取水、DNA模板、PCR反應(yīng)試劑和引物至96孔微孔板內(nèi)，完成50 μL PCR反應(yīng)液的配制（PCR反應(yīng)試劑25 μL，引物各2 μL，DNA模板2 μL，水19 μL）。盛放PCR反應(yīng)液的96孔微孔板隨后由F7機(jī)械臂轉(zhuǎn)移至自動化封膜機(jī)進(jìn)行密封，經(jīng)自動化離心機(jī)2000 r/min轉(zhuǎn)速下離心1 min后送至自動化PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的同時，F(xiàn)7機(jī)械臂將移液工作站內(nèi)的各類試劑經(jīng)封膜機(jī)密封后放回自動化低溫冰箱。PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用移液工作站的磁力架配件完成PCR產(chǎn)物的磁珠純化。純化產(chǎn)物在核酸片段分析儀進(jìn)行片段大小和片段濃度的檢測，中控軟件根據(jù)檢測結(jié)果挑選質(zhì)量達(dá)標(biāo)（片段濃度在10 ng/μL以上，片段大小正確且無雜帶）的樣本進(jìn)行后續(xù)DNA組裝反應(yīng)。DNA組裝和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化完成后，吸取50 μL樣本涂布至8孔矩形培養(yǎng)板內(nèi)，利用移液工作站內(nèi)部的振蕩配件將8孔矩形培養(yǎng)板于500 r/min振蕩1 min將孔內(nèi)菌液分布均勻。靜置培養(yǎng)12 h后，利用移液工作站的克隆挑選配件每孔挑取3個直徑1.5 mm以上、間距大于3 mm的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。通過熒光定量PCR儀檢測菌液中是否含有目標(biāo)基因片段以驗證工程菌是否構(gòu)建成功。中控軟件根據(jù)熒光定量PCR檢測結(jié)果，指導(dǎo)移液工作站選取Ct值（cycle threshold，閾值循環(huán)數(shù)）≤25的陽性樣本并將其轉(zhuǎn)接至菌種保藏管內(nèi)，最終構(gòu)建成功的工程菌放置于Arktic冰箱保存。

3.2 酶的定向進(jìn)化及篩選

酶的定向進(jìn)化通過改造酶的結(jié)構(gòu)并利用高通量篩選手段，可以快速得到具有特定催化活性、穩(wěn)定性或選擇性的酶，以滿足各種研究或應(yīng)用需求。針對實驗中大量突變子的操作需求，通常需要將高通量的培養(yǎng)、檢測和數(shù)據(jù)分析手段相結(jié)合以提高研究效率。本文以酶標(biāo)檢測作為初篩方法結(jié)合高效液相色譜分析作為復(fù)篩方法，對在iBioFoundry上完成酶定向進(jìn)化的實驗案例進(jìn)行說明（圖4）。首先利用易錯PCR或?qū)﹃P(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)突變等方法構(gòu)建目標(biāo)基因的突變文庫，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后利用移液工作站的克隆挑選配件挑取菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，根據(jù)OD檢測數(shù)據(jù)掌握菌體生長情況并擇機(jī)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后測定菌液OD值。對于分泌表達(dá)的酶蛋白，孔板經(jīng)離心取上清即得到粗酶液。如果是胞內(nèi)蛋白，離心收集菌體后加入裂解液經(jīng)振蕩孵育破碎細(xì)胞，裂解液離心后取上清獲得粗酶液。利用酶標(biāo)儀檢測酶活，根據(jù)檢測結(jié)果篩選樣本進(jìn)行液相色譜復(fù)篩，最后根據(jù)檢測數(shù)據(jù)篩選優(yōu)勢菌株保存，用于后續(xù)測序分析或進(jìn)入下一輪的定向進(jìn)化實驗。

圖4 酶定向進(jìn)化及篩選實驗流程Fig.4 Procedure of enzyme directed evolution and screening

利用中控軟件中的變量控制、邏輯判斷、循環(huán)、數(shù)據(jù)提取、導(dǎo)入與導(dǎo)出等功能，可實現(xiàn)對實驗流程的智能化控制。在本案例的實驗流程中，有三個節(jié)點(diǎn)可以通過對實時檢測數(shù)據(jù)的分析而實現(xiàn)對下游實驗流程的智能選擇，分別是：①根據(jù)菌液OD數(shù)據(jù)選擇誘導(dǎo)時機(jī)；②根據(jù)酶標(biāo)檢測數(shù)據(jù)篩選樣本進(jìn)入復(fù)篩；③根據(jù)液相色譜檢測數(shù)據(jù)篩選菌液樣本保留備用。對于酶標(biāo)檢測和液相色譜分析得到的數(shù)據(jù)，可以直接根據(jù)其大小對樣本信息進(jìn)行排序。亦可通過計算處理得到檢測數(shù)值/菌液OD值的比值，即選取均一化的檢測數(shù)據(jù)來進(jìn)行分析，以降低由菌體生長差異而帶來的分析誤差。在篩選過程中，可以通過中控軟件的程序編寫實現(xiàn)多種樣本選取策略以滿足不同實驗需求，如：①選取檢測數(shù)據(jù)大于對照組的樣本；②選取檢測數(shù)據(jù)在設(shè)定數(shù)值以上的樣品；③選取一定比例檢測數(shù)據(jù)最高的樣本等。移液工作站根據(jù)中控軟件輸出的數(shù)據(jù)文件，選取指定孔位的樣本轉(zhuǎn)移至新的孔板并重新排列，完成樣本的挑選和保存。通常實驗的通量主要取決于裝置中各類耗材存放及細(xì)胞培養(yǎng)的空間大小。iBioFoundry中有三臺自動化耗材存儲設(shè)備用于各類耗材的存放，一臺大容量靜置培養(yǎng)箱和兩臺自動化振蕩培養(yǎng)箱分別用于細(xì)胞的靜置和振蕩培養(yǎng)。本案例中實驗的通量主要依賴于振蕩培養(yǎng)箱的儲存容量，每臺振蕩培養(yǎng)箱可以存放14塊96孔深孔板或32塊96孔微孔板。根據(jù)實驗需要，如將突變子挑取在96孔深孔板中培養(yǎng)，則在兩天內(nèi)可以完成28塊96孔板的篩選任務(wù)，即可同時操作2688個實驗樣本。如目標(biāo)酶蛋白是胞外產(chǎn)物，對細(xì)胞量的需求不高，此情況下若采用96孔微孔板培養(yǎng)細(xì)胞，則iBioFoundry可以同時處理64塊96孔板，即6144個實驗樣本。

4 iBioFoundry建設(shè)中幾點(diǎn)經(jīng)驗

4.1 耗材存儲空間的分配

自動化耗材存儲設(shè)備作為iBioFoundry中一個不可或缺的組成部分，其作用是存放實驗中所需的吸頭、深孔板、微孔板等各類耗材。iBioFoundry上運(yùn)行不同的科研項目，因?qū)嶒瀮?nèi)容和實驗通量的不同，所需耗材的種類和數(shù)量也會不盡相同。實驗開始前的準(zhǔn)備過程中就需要統(tǒng)籌考慮所需各種耗材在開始時和實驗結(jié)束時的存儲位置。自動化耗材存儲設(shè)備的擺放位置和其內(nèi)部空間的布局關(guān)系到整個自動化科學(xué)裝置的實驗通量和工作效率。

iBioFoundry裝置內(nèi)共有三臺自動化耗材存儲設(shè)備，分別位于DNA元件組裝模塊、細(xì)胞篩選及培養(yǎng)模塊、分析檢測模塊。不同容量的自動化耗材存儲設(shè)備包含的載架數(shù)量不同，同時載架上的每個耗材擺放位置的高度可以人為設(shè)置，其高度主要分4個級別：低位（酶標(biāo)板、微孔板等）、中位（深孔培養(yǎng)板等）、高位（吸頭盒等）和超高位（大容量吸頭盒等）。DNA元件組裝模塊位于整個裝置的中心位置，且耗材需求量大，因此將一臺24列大容量耗材存儲設(shè)備配置于此模塊的移液工作站邊上?？紤]到DNA元件組裝相關(guān)實驗會較多用到微孔板和一次性小體積的吸頭，因此該設(shè)備中低位載架和高位載架占比較大（表3）。細(xì)胞篩選及培養(yǎng)模塊則配備了一個10列耗材存儲設(shè)備，其中8列載架選擇中位載架和低位載架，用于存放細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用的深孔板、微孔板類耗材，另2列配置有超高位載架，存放1 mL規(guī)格的吸頭盒用于菌液或其他溶液的吸取。位于分析檢測模塊配置有一臺6列耗材存儲設(shè)備，其中4列選擇低位載架用于自動化核酸片段分析儀、流式細(xì)胞儀和熒光定量PCR儀的耗材存儲，另2列選擇高位載架用于高效液相色譜樣品板的存儲。

表3 自動化耗材存儲設(shè)備及其內(nèi)部位置分配情況Table 3 Automated consumable-storing devices and inner resource allocation

4.2 多實驗任務(wù)并行

多實驗任務(wù)并行能大幅提高iBioFoundry的運(yùn)行效率。本系統(tǒng)的中央控制軟件具備任務(wù)的動態(tài)進(jìn)程管理功能，可統(tǒng)籌計算并實現(xiàn)多個任務(wù)中各進(jìn)程的最佳時間和設(shè)備資源調(diào)配，達(dá)到多任務(wù)同時運(yùn)行的目標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，iBioFoundry還允許在實驗進(jìn)行中的任意時間點(diǎn)添加新任務(wù)，并按照實驗需求優(yōu)化時間和資源分配，同時保障多個實驗的運(yùn)行效率。在多任務(wù)并行時，存在公共耗材資源如何協(xié)調(diào)分配的問題，也可能遇到多個并行程序同時調(diào)用某個設(shè)備的情況。因此在前期自動化程序編寫及上機(jī)運(yùn)行時，需多加注意并解決因多任務(wù)對裝置中各種資源的需求而引發(fā)的矛盾。

自動化程序編寫時，為防止實驗流程中某些關(guān)鍵環(huán)節(jié)所需設(shè)備在使用時不被其他任務(wù)的程序調(diào)用，可在程序中設(shè)定設(shè)備鎖定參數(shù)，只有當(dāng)鎖定設(shè)備的程序結(jié)束后，設(shè)備鎖定參數(shù)才被釋放給其他程序并用于設(shè)備資源的調(diào)用。當(dāng)任務(wù)中存在實驗樣本在兩個實驗步驟之間不能等待而必須立即依次執(zhí)行操作的情況，可將此時的樣本設(shè)定成緊急樣本，通過程序優(yōu)先級的設(shè)置，實現(xiàn)緊急樣本對其他并行任務(wù)實驗流程所需設(shè)備的優(yōu)先占用，達(dá)到插隊操作的目標(biāo)。

對于多實驗任務(wù)并行，需要統(tǒng)計各個任務(wù)所需全部耗材的種類、數(shù)目并對始末存放位置做出規(guī)劃。在自動化程序編寫時，可將耗材屬性做公用和專屬的設(shè)定：公用耗材一般為新的吸頭、微孔板、深孔板等供多個任務(wù)共同使用；專屬耗材則為特定實驗任務(wù)所需的耗材，其他實驗任務(wù)的程序不能調(diào)用。在程序中通過添加耗材計數(shù)參數(shù)，使中央控制軟件能實時掌控耗材存儲設(shè)備中各類耗材的真實使用情況（如某一吸頭盒中剩余的可用吸頭數(shù)量），以致程序在耗材調(diào)用時做出正確選擇。在耗材準(zhǔn)備過程中，專屬耗材與公用耗材、同屬性中不同類型的耗材都需對其在自動化耗材存儲設(shè)備中的擺放位置做出相應(yīng)區(qū)分，以此避免多任務(wù)運(yùn)行中耗材選擇錯誤，也有助于任務(wù)開始前耗材的添加和任務(wù)結(jié)束后耗材的清理。在多任務(wù)運(yùn)行時，某個任務(wù)可能提前結(jié)束或需要臨時插入，此時有對相應(yīng)耗材進(jìn)行取出或添補(bǔ)需求。此類情況可通過修改自動化程序，將其耗材供應(yīng)或結(jié)束位置設(shè)定為位于分析檢測模塊（開放區(qū)域）的自動化耗材存儲堆棧，避免耗材存取過程對在線運(yùn)行項目的影響。

不同實驗任務(wù)可能分屬IB團(tuán)隊中的多人各自負(fù)責(zé)，各個成員應(yīng)在多實驗任務(wù)運(yùn)行前對運(yùn)行時間、運(yùn)行時長、實驗內(nèi)容、資源需求等進(jìn)行充分的溝通交流，合理分配設(shè)備與耗材等資源，制定出穩(wěn)定、高效的多任務(wù)運(yùn)行計劃。全部任務(wù)結(jié)束后，注意分工合作對各自實驗任務(wù)的實驗樣品和耗材等進(jìn)行整理，并對整個裝置進(jìn)行全面檢查。

4.3 實驗流程標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)

自動化實驗方案的制定過程中需要將具體實驗流程拆解成多個子任務(wù)并編寫相應(yīng)的自動化程序。許多合成生物學(xué)實驗中的子任務(wù)具有通用性高的特點(diǎn)，比如PCR反應(yīng)體系的配置、基因的質(zhì)檢和純化、菌落的挑取和涂布、菌種的培養(yǎng)等。不同用戶的實驗流程中可能都會包含諸如此類的子任務(wù)，雖然它們的實驗對象、實驗通量、具體實驗參數(shù)會有所不同，但用到的實驗耗材、試劑、設(shè)備及相應(yīng)機(jī)械臂操作動作都大致相同。iBioFoundry中實驗流程的標(biāo)準(zhǔn)化，即將實驗流程中各個子任務(wù)的自動化程序編寫和測試規(guī)范化并最終制定整個實驗流程的標(biāo)準(zhǔn)操作文檔。其中子任務(wù)自動化程序的標(biāo)準(zhǔn)化編寫和整體實驗流程標(biāo)準(zhǔn)化文檔的制定是兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

子任務(wù)自動化程序文檔包含實驗內(nèi)容、耗材種類及數(shù)量、程序名稱、程序存儲路徑和具體程序代碼等內(nèi)容。程序代碼需配上相應(yīng)注釋以備后續(xù)修改且方便他人閱讀。移液工作站的自動化程序文檔中需規(guī)范臺面耗材擺放位置，對不同類型板材或吸頭在移液工作站臺面的擺放做出區(qū)域劃分，明確耗材移動路徑，每一步自動化操作后的耗材位置都以圖片的形式留檔，方便程序測試時核對。自動化程序的編寫應(yīng)注重其靈活性和通用性，涉及的樣品數(shù)量、移液體積和反應(yīng)條件等各個實驗參數(shù)可采用變量的形式指定，以靈活應(yīng)對不同的實驗需求。在自動化程序文檔中最后應(yīng)寫明程序調(diào)試和測試方法及驗收標(biāo)準(zhǔn)。整體實驗流程標(biāo)準(zhǔn)化文檔包含實驗?zāi)康摹⑦m用范圍、實驗設(shè)備、試劑耗材、實驗方法、子任務(wù)程序、整體實驗流程自動化程序、數(shù)據(jù)分析方法、總結(jié)報告、樣品交付和注意事項等內(nèi)容。

對于在iBioFoundry上落地的不同科研項目的各種實驗流程，如果每個IB團(tuán)隊成員均按個人經(jīng)驗和偏好去制定相應(yīng)自動化實驗方案，不僅費(fèi)時費(fèi)力而且實驗需要在裝置上同時運(yùn)行時難免會存在各種沖突。實驗流程的標(biāo)準(zhǔn)化通過各種程序的規(guī)范化編寫提高它們的通用性，避免IB團(tuán)隊成員每次從頭編寫，通過簡單的調(diào)用和調(diào)試即可完成某一任務(wù)目標(biāo)。實驗流程的標(biāo)準(zhǔn)化也便于團(tuán)隊裝置使用經(jīng)驗的交流和積累，對提高裝置的運(yùn)行質(zhì)量、運(yùn)營效率和整體綜合服務(wù)能力都至關(guān)重要。

5 展 望

以合成生物學(xué)為代表的生物科技的顛覆性突破，將帶來生命健康、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等領(lǐng)域的巨大變革，產(chǎn)生難以估量的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益［24-25］。其發(fā)展趨勢之一是利用合成生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化和模塊化優(yōu)勢并結(jié)合生物過程自動化，全自動高效構(gòu)建功能生命體，實現(xiàn)人工合成生命的智能調(diào)控和復(fù)雜功能。合成生物學(xué)自動化裝置的應(yīng)用為提升高通量實驗的效率和大量高質(zhì)量數(shù)據(jù)的獲得提供了新的解決方案。所產(chǎn)生的大量多維度的數(shù)據(jù)與人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合，提升理性設(shè)計能力，助力“學(xué)習(xí)”和“設(shè)計”的自動化，從而最終實現(xiàn)“設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”全閉環(huán)的自動化運(yùn)行?！癇T+IT”的融合不僅會提升人類認(rèn)識生物、調(diào)控生物、改造生物的能力，還將改變生命科學(xué)的發(fā)展方式從“實驗驅(qū)動”向著“數(shù)據(jù)驅(qū)動”轉(zhuǎn)變。自動化合成生物技術(shù)的發(fā)展有望開啟合成生物學(xué)“BT+IT”融合新領(lǐng)域，對于搶占科技競爭和產(chǎn)業(yè)競爭的制高點(diǎn)具有重要的意義。