華羽彤，李尹，董瑞娟，郭秀歡，雷艷，辛泉誠(chéng)，魏鵬，袁瑞娟

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488

中藥動(dòng)物藥水蛭是臨床上常用的抗凝藥物，具有抗凝、溶栓、改善人體血液流變性等功能[1]，其來(lái)源有螞蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman及柳葉螞蟥W.acranulataWhitman[2]。水蛭素是從水蛭新鮮唾液中提取出的抗凝活性肽，是目前已知抗凝效果最強(qiáng)的天然凝血酶抑制劑。螞蟥又稱寬體金線蛭，是中藥水蛭的主要來(lái)源，但在寬體金線蛭中未檢測(cè)出水蛭素，然而其在臨床應(yīng)用中具有明確抗凝功效，目前有研究報(bào)道從寬體金線蛭中提取出的抗凝成分大部分是多肽或蛋白類物質(zhì)，然而其氨基酸序列尚不清楚[3]，導(dǎo)致寬體金線蛭抗凝物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確[4]。

隨著分子模擬計(jì)算及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，利用虛擬技術(shù)輔助篩選活性成分在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可節(jié)省大量時(shí)間及實(shí)驗(yàn)成本。分子對(duì)接能明確成分與已知靶點(diǎn)的相互作用方式及結(jié)合強(qiáng)弱，分子動(dòng)力學(xué)模擬能進(jìn)一步判斷成分與已知靶點(diǎn)之間結(jié)合的穩(wěn)定性。本課題組在前期研究基礎(chǔ)上已建立寬體金線蛭蛋白質(zhì)庫(kù)[5]。本研究擬利用虛擬酶切技術(shù)構(gòu)建寬體金線蛭多肽候選庫(kù)，將酶切所得多肽與凝血酶進(jìn)行分子對(duì)接初篩，并對(duì)結(jié)合能高的復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬復(fù)篩，根據(jù)MM-PBSA 計(jì)算結(jié)合自由能確定目標(biāo)抗凝肽，最后合成目標(biāo)抗凝肽并進(jìn)行體外抗凝活性測(cè)定，為寬體金線蛭抗凝物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供新思路。

1 材料

1.1 儀器

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 型四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；6125B型高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國(guó)）有限公司]；ChromCore120 C18Naco Chrom 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；SC40 型半自動(dòng)凝血分析儀（中勤世帝生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，Thermo Fisher 公司，批號(hào)：F22M9J202）；三氟乙酸（分析純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司，批號(hào)：C1830007）；烏拉坦（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：A41906130119）；TT 試劑盒（中勤世帝生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：STY20301-35-6）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康日本大耳白兔，1只，體質(zhì)量2.5 kg，雄性，購(gòu)于北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2020-0002，符合國(guó)家健康一級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。本研究所涉及的動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求，并獲得北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：BUCM-2022010806-0008）。

2 方法

2.1 虛擬酶切及多肽毒性預(yù)測(cè)

本課題組前期利用轉(zhuǎn)錄組對(duì)寬體金線蛭進(jìn)行基因研究，確定以Helobdella robusta（Californian leech，1 種加利福尼亞水蛭）庫(kù)為基準(zhǔn)進(jìn)行蛋白組研究，后利用同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)（iTRAQ）蛋白組學(xué)進(jìn)行寬體金線蛭的蛋白成分分析，最終得到寬體金線蛭蛋白質(zhì)庫(kù)。針對(duì)本課題組前期得到的寬體金線蛭蛋白質(zhì)庫(kù)[5]，利用SIB 瑞士生物信息學(xué)研究所的生物信息學(xué)資源平臺(tái)（https://web.expasy.org/peptide_mass/）[6]，選擇酶切方式為胰蛋白酶，將蛋白進(jìn)行虛擬酶切以得到寬體金線蛭所含多肽，并通過(guò)在線網(wǎng)站ToxinPred（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）預(yù)測(cè)虛擬酶切后多肽的毒性、突變?cè)O(shè)計(jì)和理化性質(zhì)[7]。

2.2 凝血酶-多肽分子對(duì)接

分子對(duì)接以凝血酶為靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)無(wú)毒性多肽為配體進(jìn)行對(duì)接。從PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（RCSBPDB，https://www.rcsb.org/）中提取凝血酶（PDB：2BVR）的結(jié)構(gòu)，利用HPEPDOCK 服務(wù)器[8]（http://huanglab.phys.hust.edu.cn）進(jìn)行全局分子對(duì)接，在Discovery Stuido 2016 中使用CDOCKER 以蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB：2BVR）中已有配體的殘基TYS18 為活性部位中心進(jìn)行半柔性對(duì)接[9]。選擇水蛭素變體（GDFEEIPEEYLQ）為陽(yáng)性對(duì)照[10]，后根據(jù)對(duì)接分?jǐn)?shù)篩選多肽進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。其中，蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB：2BVR）中已有配體與本實(shí)驗(yàn)所選陽(yáng)性對(duì)照均為水蛭素變體，但由于氨基酸TYS 不屬于20種常見(jiàn)氨基酸，無(wú)法實(shí)現(xiàn)不同方式的分子對(duì)接，故選擇另一水蛭素變體（GDFEEIPEEYLQ）作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。

2.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

利用生物分子建模和模擬平臺(tái)（CHARMMGUI，https://charmm-gui.org/）構(gòu)建凝血酶-多肽的復(fù)合物構(gòu)象。分子動(dòng)力學(xué)模擬使用GROMACS 2018.33 軟件進(jìn)行[11]，水分子采用TIP3P 模型[12]。采用最陡下降法對(duì)體系進(jìn)行模擬和優(yōu)化，以減少整個(gè)體系的不合理接觸或原子重疊；然后進(jìn)行受限分子動(dòng)力學(xué)模擬，進(jìn)行5 ns 的等溫等壓系綜（NPT）平衡過(guò)程，使模擬系統(tǒng)達(dá)到完全預(yù)平衡。采用Verlet LeapFrog 算法求解牛頓運(yùn)動(dòng)方程，積分步長(zhǎng)設(shè)為2 fs。在計(jì)算過(guò)程中，繪制Lennard-Jones函數(shù)來(lái)計(jì)算范德華力（VDW），非鍵截止距離設(shè)置為1.2 nm；Lincs 算法約束所有原子的鍵長(zhǎng)，粒子網(wǎng)格Ewald（PME）方法計(jì)算短程靜電相互作用。所有分子動(dòng)力學(xué)模擬都是在等溫等壓系綜下進(jìn)行的，熱力學(xué)溫度為310.15 K，壓力為101.325 kPa。溫度和壓力由V-Resale 和Parrinello-Rahman 方法控制。溫度和壓力耦合常數(shù)分別為0.1、0.5 ps。分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)間設(shè)置為50 ns，并進(jìn)行3 個(gè)獨(dú)立樣本模擬，使用PYMOL 2.5.0 軟件[13]生成可視化和圖形。

2.4 MM-PBSA計(jì)算

通過(guò)對(duì)利用分子對(duì)接篩選得到的穩(wěn)定復(fù)合物進(jìn)行MM-PBSA 計(jì)算[14]，得到凝血酶-多肽的結(jié)合自由能。MM-PBSA 計(jì)算通過(guò)GROMACS 進(jìn)行，設(shè)置介電常數(shù)pdie值為1，其余參數(shù)為默認(rèn)項(xiàng)，本研究結(jié)合能在整個(gè)50 ns 時(shí)間段內(nèi)每間隔100 ps 進(jìn)行采樣，從軌跡中產(chǎn)生500幀進(jìn)行計(jì)算。

2.5 多肽固相合成及純度驗(yàn)證

將利用分子模擬技術(shù)篩選得到的多肽交由吉爾生化（上海）有限公司進(jìn)行固相合成，并利用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行純度驗(yàn)證，利用四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）進(jìn)行多肽相對(duì)分子質(zhì)量確定。多肽用水溶解后，進(jìn)行HPLC 測(cè)定，流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸乙腈溶液（A）-0.1%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，26%～51%A）；流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣體積為10 μL。質(zhì)譜檢測(cè)條件為負(fù)離子模式，流動(dòng)相為水-乙腈（50∶50），電噴霧電離源（ESI），流速0.2 mL·min-1。

2.6 兔貧血小板血漿（PPP）的制備

向健康兔耳緣靜脈注射25%烏拉坦（0.9%氯化鈉溶液配制）致其麻醉，麻醉劑量為4 mL·kg-1，頸動(dòng)脈插管取血至裝有3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑（9∶1）的離心管中，輕輕顛倒后，立即3000 r·min-1離心10 min（離心半徑為2.795 cm），取得PPP備用。

2.7 抗凝血酶活性測(cè)定

將合成多肽利用50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.4）溶解，終質(zhì)量濃度分別為1、10、20、30、40 mg·mL-1。以比伐盧定作陽(yáng)性對(duì)照，利用50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.4）溶解，終質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5 μg·mL-1。取PPP，將多肽/比伐盧定與血漿以1∶9 加樣，以50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.4）為空白對(duì)照，利用TT 試劑盒，在半自動(dòng)凝血分析儀中進(jìn)行抗凝活性測(cè)定。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 寬體金線蛭蛋白組的虛擬酶切及毒性預(yù)測(cè)

用胰蛋白酶對(duì)課題組前期得到的寬體金線蛭112 條蛋白進(jìn)行虛擬酶切，酶切結(jié)果及毒性預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，最終酶切所得多肽共3365 條，其中預(yù)測(cè)無(wú)毒性多肽3317條用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

表1 寬體金線蛭蛋白酶切所得多肽數(shù)

3.2 凝血酶-多肽分子對(duì)接

將相對(duì)分子質(zhì)量為1000～2000 Da 的無(wú)毒性多肽利用HPEPDOCK服務(wù)器進(jìn)行全局對(duì)接，發(fā)現(xiàn)部分結(jié)合位點(diǎn)與水蛭素變體結(jié)合位點(diǎn)相同，且全部多肽均能對(duì)接成功。根據(jù)Weng 等[15]利用14 個(gè)對(duì)接軟件對(duì)蛋白-多肽進(jìn)行分子測(cè)評(píng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HPEPDOCK 全局對(duì)接方式更適用于蛋白-多肽對(duì)接，結(jié)合本研究結(jié)果，說(shuō)明全局對(duì)接位點(diǎn)具有更高的選擇性，對(duì)接成功的可能性更大。

根據(jù)HPEPDOCK 的結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[16]，將蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB：2BVR）中已有配體的殘基TYS18定義為活性位點(diǎn)，并用Discovery Studio 對(duì)全局對(duì)接分?jǐn)?shù)較高的多肽進(jìn)行半柔性對(duì)接（CDOCKER）。根據(jù)對(duì)接分?jǐn)?shù)及多肽與凝血酶相互作用的氨基酸殘基類型和數(shù)量，最終篩選出了31 條多肽進(jìn)行下一步分子動(dòng)力學(xué)模擬，以考察其結(jié)合穩(wěn)定性，其中凝血酶與無(wú)毒性多肽CDOCKER 對(duì)接能量分?jǐn)?shù)＞對(duì)照的31條多肽的分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 凝血酶與無(wú)毒性多肽分子對(duì)接結(jié)果

3.3 凝血酶-多肽復(fù)合體的分子動(dòng)力學(xué)模擬分析

對(duì)3.2 項(xiàng)下篩選出的31 條多肽分別進(jìn)行了凝血酶-多肽復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬（50 ns），以研究其對(duì)凝血酶的影響。

通過(guò)研究在50 ns的整個(gè)軌跡中主干與初始對(duì)接結(jié)構(gòu)的均方根偏差（RMSD）來(lái)分析凝血酶-肽復(fù)合體的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3。其中多肽QNTVGLDDFFSSYER（6）及QIEEAEEIAAVNLAK（16）利用HPEPDOCK 進(jìn)行對(duì)接的復(fù)合物的RMSD值低于0.3 nm，故對(duì)以上2個(gè)多肽的復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)50 ns的重復(fù)。結(jié)果顯示，QNTVGLDDFFSSYER多肽3 次分子動(dòng)力學(xué)RMSD 值均值分別為0.211、0.261、0.284 nm，QIEEAEEIAAVNLAK 多肽3 次分子動(dòng)力學(xué)RMSD 值均值分別為0.276、0.354、0.455 nm，QNTVGLDDFFSSYER 多肽3 次重復(fù)樣本間波動(dòng)較?。▓D1A），且含有凝血酶的復(fù)合物在整個(gè)模擬過(guò)程中保持高度穩(wěn)定，平均RMSD 值為0.2 nm（圖1B）。說(shuō)明該多肽與凝血酶結(jié)合更加穩(wěn)定，故選擇QNTVGLDDFFSSYER 多肽進(jìn)行后續(xù)研究，下文以WP-antithrombin-pep命名。

圖1 凝血酶-多肽QNTVGLDDFFSSYER分子動(dòng)力學(xué)模擬50 ns軌跡RMSD值（n=3）

表3 50 ns內(nèi)凝血酶-多肽復(fù)合物分子動(dòng)力學(xué)RMSD nm

氫鍵是蛋白質(zhì)和多肽之間的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力，有助于提高絡(luò)合結(jié)合能力和穩(wěn)定性。分別用LigPlot 2.2.5軟件[13]說(shuō)明了分子動(dòng)力學(xué)模擬前后凝血酶與WP-antithrombinpep復(fù)合物的親水和疏水相互作用（圖2）。

圖2 凝血酶與WP-antithrombin-pep相互作用2D圖

經(jīng)過(guò)對(duì)接后，發(fā)現(xiàn)凝血酶與WP-antithrombinpep 的殘基Leu130-Thr3、Leu130-Thr3、Arg233-Asp8、Asp178-Arg15、Asn179-Arg15、Arg101-Glu14 和His91-Glu14 之間形成了7 個(gè)氫鍵及16 個(gè)疏水作用，其中殘基Leu130-Thr3 之間形成了2 個(gè)氫鍵。在經(jīng)過(guò)50 ns 分子動(dòng)力學(xué)模擬后，氫鍵數(shù)量明顯增多，凝血酶 與WP-antithrombin-pep 的殘基Arg233-Tyr13、Arg233-Asp8、Arg233-Ser12、Phe232-Tyr13、Glu164-Gln1、Asp178-Arg15、Arg165-Asn2、Val163-Thr3、Gln131-Gln1 和Ala132-Gln1 之間形成了10 個(gè)氫鍵及11 個(gè)疏水作用。其中Arg233-Asp8、Asp178-Arg15依舊通過(guò)氫鍵作用穩(wěn)定結(jié)合。表明凝血酶殘基Arg233、Asp178 在與WP-antithrombin-pep 的靜電相互作用中起重要作用。

在得到的3D結(jié)構(gòu)中（圖3A），WP-antithrombinpep結(jié)合到凝血酶的活性溝槽上，采用部分α-螺旋構(gòu)象。Arg233 與Asp8、Arg233 與Ser12、Asp178 與Arg15、Arg165 與Asn2、Glu164 與Gln1 之間的靜電相互作用被突出顯示并標(biāo)記。凝血酶與WP-antithrombinpep 復(fù)合體的庫(kù)侖相互作用能約為-700 kJ·mol-1，遠(yuǎn)低于蘭納-瓊斯勢(shì)能，后者在整個(gè)模擬過(guò)程中穩(wěn)定在-200 kJ·mol-1（圖3B），表明靜電力是凝血酶與WP-antithrombin-pep復(fù)合體結(jié)合的驅(qū)動(dòng)力。

圖3 凝血酶與WP-antithrombin-pep相互作用3D圖及勢(shì)能分析

3.4 MM-PBSA結(jié)果分析

利用MM-PBSA 計(jì)算進(jìn)一步分析凝血酶與WPantithrombin-pep 的相互作用，得到的總自由結(jié)合能由范德華能、靜電能、極性溶劑化能和溶劑可及表面能組成，其中范德華能為-（257.614±36.087）kJ·mol-1，靜電能為-（2 789.063±227.564）kJ·mol-1，為（2 656.745±196.673）kJ·mol-1，溶劑可及表面能為-（37.574±3.144）kJ·mol-1，凝血酶與WP-antithrombinpep的總結(jié)合自由能為-（427.506±83.634）kJ·mol-1，且對(duì)500 幀總結(jié)合自由能進(jìn)行繪圖，見(jiàn)圖4，發(fā)現(xiàn)總結(jié)合能在50 ns內(nèi)趨于穩(wěn)定，說(shuō)明該復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定。

圖4 凝血酶與WP-antithrombin-pep在50 ns模擬軌跡中500幀樣本總結(jié)合自由能

3.5 多肽合成結(jié)果

采用HPLC 對(duì)合成的WP-antithrombin-pep 進(jìn)行純度檢測(cè)及質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6，具體出峰時(shí)間及峰面積見(jiàn)表4，通過(guò)峰面積計(jì)算含量，其純度為98.878%。由圖6 可知，在質(zhì)荷比為591.50及887.60處產(chǎn)生了分子碎片，最終確定相對(duì)分子質(zhì)量為1 777.84 Da，為高純度肽，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 WP-antithrombin-pep合成多肽HPLC圖

圖6 WP-antithrombin-pep合成多肽二級(jí)質(zhì)譜圖

表4 WP-antithrombin-pep的HPLC定量結(jié)果

3.6 WP-antithrombin-pep能延長(zhǎng)凝血酶時(shí)間（TT）

TT 用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)凝血途徑中共同途徑的影響作用，凝血酶位于共同途徑上，故本研究用TT驗(yàn)證WP-antithrombin-pep 的抗凝活性。研究結(jié)果見(jiàn)圖7，WP-antithrombin-pep延長(zhǎng)TT 的作用隨多肽質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，在WP-antithrombin-pep 質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1，即在體系中質(zhì)量濃度為1000 μg·mL-1時(shí)，TT值與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比伐盧定陽(yáng)性對(duì)照在體系中質(zhì)量濃度為0.015 μg·mL-1時(shí)，TT 值與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明WP-antithrombin-pep 可以作用于共同凝血途徑，具有抗凝活性。

圖7 WP-antithrombin-pep在體系中不同質(zhì)量濃度下對(duì)TT的影響（±s,n=3）

4 討論

動(dòng)物類中藥是中藥的一大組成部分，蛋白質(zhì)、多肽等大分子是其重要活性物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白進(jìn)入胃腸道后經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶降解得到大量多肽，傳統(tǒng)的分離方法難以快速篩選出有效的抗凝活性肽，得到抗凝活性肽的序列，分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)是一種借助計(jì)算機(jī)虛擬模擬受體和配體之間相互作用方式的手段，有望快速?gòu)闹兴幹泻Y選得到具有靶向性的抗凝活性肽。

分子對(duì)接可以探索構(gòu)象空間，展示蛋白質(zhì)與多肽的相互作用，預(yù)測(cè)多肽-蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力。分子對(duì)接結(jié)果直接取決于分子對(duì)接軟件的選擇，市面上對(duì)于蛋白-多肽對(duì)接的軟件相對(duì)較少，故本研究采用HPEPDOCK 蛋白-多肽對(duì)接軟件及CDOCKER 蛋白-小分子對(duì)接軟件進(jìn)行多肽篩選。根據(jù)表3 結(jié)果顯示，分子動(dòng)力學(xué)模擬后，HPEPDOCK 對(duì)接的凝血酶-肽復(fù)合物的平均RMSD 整體低于CDOCKER 對(duì)接的復(fù)合體，HPEPDOCK 屬于全局對(duì)接，其對(duì)接位點(diǎn)較CDOCKER對(duì)接更廣泛，表明HPEPDOCK可能產(chǎn)生更好的結(jié)合。Weng等[15]利用14個(gè)分子對(duì)接軟件對(duì)蛋白-多肽進(jìn)行對(duì)接性能測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在全局對(duì)接中，HPEPDOCK 對(duì)接性能最好，且提出使用多種不同的多肽初始構(gòu)象進(jìn)行對(duì)接是成功的關(guān)鍵。表明在進(jìn)行蛋白-多肽分子對(duì)接時(shí)，首選蛋白-多肽分子對(duì)接軟件，并且要綜合考慮多肽及受體蛋白的柔性，以提高蛋白-多肽結(jié)合成功率。

利用分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)能明確凝血酶與多肽QNTVGLDDFFSSYER 相互作用的具體方式，利用MM-PBSA 可以預(yù)測(cè)蛋白-多肽的結(jié)合自由能，對(duì)結(jié)合情況進(jìn)行進(jìn)一步判斷。3D 結(jié)構(gòu)及2D 相互作用圖均顯示，凝血酶Arg233、Asp178 殘基是凝血酶與多肽QNTVGLDDFFSSYER 結(jié)合的主要?dú)埢Ｔ诜肿觿?dòng)力學(xué)前后，凝血酶Arg233與多肽Asp8、凝血酶Asp178 與Arg15 殘基之間一直通過(guò)氫鍵作用緊密結(jié)合。凝血酶Arg233、Asp178 殘基均位于凝血酶的Exosite 2 結(jié)構(gòu)域上，與Arg165 殘基共同組成三聯(lián)體殘基離子簇，對(duì)凝血酶與血栓調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合產(chǎn)生影響[17]。Exosite 2 更易結(jié)合帶負(fù)電荷的配體[18-19]，Asp8為酸性殘基，更易與Arg233殘基結(jié)合。提示凝血酶Arg233 殘基可能是多肽與凝血酶結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，且多肽中含有酸性殘基（如Asp、Glu）越多，則與凝血酶形成穩(wěn)定結(jié)合的可能性越大。

本研究通過(guò)虛擬酶切技術(shù)，將課題組前期得到的寬體金線蛭蛋白進(jìn)行酶切，得到寬體金線蛭多肽候選庫(kù)。利用分子對(duì)接技術(shù)及分子動(dòng)力學(xué)技術(shù)進(jìn)行兩步篩選，篩選出了1 條多肽（QNTVGLDDF FSSYER），并對(duì)該多肽進(jìn)行TT 測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該多肽能延長(zhǎng)凝血酶時(shí)間，其體內(nèi)抗凝活性有待進(jìn)一步深入研究。