李冰琪,侯曉夢(mèng),楊揚(yáng),劉傲雪,李強(qiáng)
北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,北京 100029
阿爾茨海默病(AD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,是老年癡呆的最常見原因之一。AD 對(duì)60 歲以上患者的致殘率大于卒中、肌肉骨骼疾病、心血管疾病和癌癥[1],除了對(duì)患者生活的影響外,還給家人帶來了巨大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前,可用于治療AD 的藥物相對(duì)不足,開發(fā)新藥物與新療法迫在眉睫。AD 主要由淀粉樣β蛋白(Aβ)沉積引起,會(huì)出現(xiàn)腦組織萎縮、神經(jīng)損傷等病理現(xiàn)象[2]。所以,AD 的防治應(yīng)該從抑制Aβ的沉積、促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生著手。
中醫(yī)認(rèn)為,癡呆疾病是由腎虛氣弱導(dǎo)致。補(bǔ)腎益精法是癡呆治療的基本原則,攝入補(bǔ)腎藥可以一定程度上對(duì)大腦退化起到延緩甚至抑制作用[3]。腎精充足,可上充髓海,而中醫(yī)所言之髓海之精從功能上與腦中的神經(jīng)干細(xì)胞非常接近。通過本課題組對(duì)補(bǔ)腎中藥菟絲子的研究發(fā)現(xiàn)[4],從菟絲子中分離出的異槲皮苷促體外神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性顯著,說明異槲皮苷對(duì)改善AD 等神經(jīng)退行性疾病具有潛在的藥用價(jià)值。
秀麗隱桿線蟲CL4176(以下簡(jiǎn)稱線蟲)是AD相關(guān)研究常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,為溫度誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因株,在16 ℃的溫度下可正常生長(zhǎng),當(dāng)溫度升高到25 ℃時(shí),Aβ被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá),從而導(dǎo)致蟲體出現(xiàn)癱瘓[5-6]。因此,本研究考察了異槲皮苷對(duì)線蟲CL4176壽命和Aβ誘導(dǎo)毒性的潛在影響,并闡明其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制,為治療AD 的新藥研發(fā)提供依據(jù)。
轉(zhuǎn)基因線蟲CL4176由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院譚鵬課題組提供;大腸埃希菌Escherichia coliOP50由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉永剛課題組提供。
SPX-250 型生化培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司);ECLIPSE Ts2R 型熒光倒置顯微鏡、SMZ745 型體視顯微鏡(尼康映像儀器銷售中國(guó)有限公司);Multiskan FC 型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司);GTR10-2型高速冷凍離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);VORTEX-7 型渦旋振蕩儀、LX-300型離心機(jī)、QL-902型渦旋振蕩儀均購(gòu)于海門其林貝爾儀器制造有限公司;YXQ-LS-50SII 型高溫高壓滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);VD650 型超凈工作臺(tái)(浙通品牌有限公司);ABI 7500 型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(Applied Biosystems 公司);NanoDrop? ND-2000型分光光度計(jì)(Thermo Scientific 公司);Tanon 1600 型凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);Sub-Cell GT-1704486型水平電泳槽(Bio-Rad公司)。
2-(3,6-二乙酰氧基-2,7-二氯-9H-氧雜蒽-9-基)苯甲酸(上海麥克林生化科技有限公司);NaOH、NaCl、MgSO4、KH2PO4、NaH2PO4、CaCl2、NaClO、KOH 均為分析純(北京試劑有限公司);瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、膽固醇、鹽酸咪唑(Innochem 公司);二喹啉甲酸(BCA)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。
4 mol·L-1NaOH 溶液-H2O-NaClO(1∶1∶8)混合制備裂解液,挑出處于繁殖期的線蟲,用M9 緩沖液將其沖下轉(zhuǎn)移至離心管中,靜置沉降再去掉上清液,加入裂解液1 mL 使其裂解充分,將蟲卵轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
配制含有E.coliOP50 的固體培養(yǎng)基NGM 作為模型組。取異槲皮苷20 mg,用去離子水1 mL溶解,作為母液。給藥組在模型組NGM 中加入異槲皮苷,配制質(zhì)量濃度為100.00、25.00、6.25 μg·mL-1的含藥固體培養(yǎng)基。
將繁殖期的線蟲放置在含有E.coliOP50 的NGM板上產(chǎn)卵。每次處理在每個(gè)平板上保留大約50個(gè)蟲卵,并在16 °C 下孵育2 d。同步化的線蟲卵在16 °C 下培養(yǎng)至L3 時(shí)期,隨機(jī)挑選線蟲并放入給藥組與模型組中,每個(gè)培養(yǎng)皿的線蟲數(shù)量控制在50 條左右。然后將線蟲轉(zhuǎn)移至25 ℃培養(yǎng)箱,溫度變化刺激Aβ的表達(dá),Aβ聚集導(dǎo)致線蟲癱瘓。每2 h 在顯微鏡下觀察線蟲癱瘓情況。線蟲的癱瘓?zhí)卣鳛樵谟^察期間只有頭部擺動(dòng)而身體不動(dòng),甚至用鉑絲觸碰線蟲的身體后依然不動(dòng)。
將線蟲同步化至L3 期,在加藥組與模型組培養(yǎng)基中加入隨機(jī)挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲的數(shù)量控制在30 條,16 ℃為線蟲正常生長(zhǎng)時(shí)的溫度,培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移至25 ℃恒溫培養(yǎng)箱誘導(dǎo)Aβ表達(dá)。每天計(jì)算線蟲的存活或死亡情況,直到最后1 條線蟲死亡,線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)鉑絲的溫和刺激沒有反應(yīng)或沒有表現(xiàn)出咽部泵送運(yùn)動(dòng)。每隔2 d將線蟲轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中線蟲存活數(shù)量,直到所有線蟲死亡時(shí)終止計(jì)數(shù)。
將線蟲同步化至L3 期,在加藥組與模型組培養(yǎng)基中,加入隨機(jī)挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲的數(shù)量控制在50 條,保持溫度在16 ℃下培養(yǎng)4 d。為了防止線蟲培養(yǎng)過程中出現(xiàn)食物不足的情況,需要2 d換1次培養(yǎng)基。將各組培4 d后的線蟲用M9緩沖液沖洗3 次,靜置使其沉降,吸去上清液,轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。從各組隨機(jī)挑取10 條線蟲,每次在體視顯微鏡下觀察1 條,對(duì)線蟲身體彎曲次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)時(shí)時(shí)間為30 s。
將線蟲同步化至L3 期,在加藥組與模型組培養(yǎng)基中,加入隨機(jī)挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲的數(shù)量控制在50 條,線蟲置于16 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d后,隨機(jī)挑取10 條線蟲對(duì)線蟲的吞咽次數(shù)進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù),每次在體式顯微鏡下觀察1 條,線蟲頭部位置的咽泵上下跳動(dòng)時(shí)則計(jì)為完成1 次吞咽,計(jì)時(shí)時(shí)間為20 s。
將線蟲同步化至L3 期,在加藥組與模型組培養(yǎng)基中加入隨機(jī)挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲數(shù)量控制在30條,16 ℃培養(yǎng)36 h,然后將線蟲轉(zhuǎn)移至25 ℃培養(yǎng)箱處理36 h。將各組培養(yǎng)好的線蟲用M9緩沖液沖下轉(zhuǎn)移至離心管中,靜置沉降再棄掉上清,在暗棕色離心管中加入2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),將DCFH-DA 探針的終濃度控制在20 μmol·L-1,每管中加入100 μL 左右,實(shí)驗(yàn)需要避光操作且在室溫下孵育2.5 h。隨后在熒光倒置顯微鏡下觀察線蟲,調(diào)整好顯微鏡拍攝熒光圖片(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用Image J軟件對(duì)每組線蟲的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行測(cè)量。
將線蟲同步化至L3 期,在加藥組與模型組培養(yǎng)基中加入隨機(jī)挑取的處于L3 期的線蟲。每皿線蟲的數(shù)量控制在30 條,保持溫度在16 ℃下培養(yǎng)2 d,之后將線蟲轉(zhuǎn)移至25 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。將各組培養(yǎng)好的線蟲用M9 緩沖液沖下轉(zhuǎn)移至離心管中,靜置沉降再棄掉部分上清液,4 ℃下用自動(dòng)勻漿器勻漿,12 000 r·min-1離心4~5 min(離心半徑為13 cm),取上清液,按照試劑盒的說明書測(cè)定各組線蟲的蛋白質(zhì)、MDA含量和SOD、CAT活性。
將線蟲同步化至L3 期,在加藥組與模型組培養(yǎng)基中加入隨機(jī)挑取的處于L3 期的線蟲。保持溫度為16 ℃培養(yǎng)1 d,之后將線蟲轉(zhuǎn)移至25 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 d。通過Trizol 法獲取線蟲的總RNA,操作步驟嚴(yán)格遵循說明書,SYBR Green 作為DNA 熒光染料,通過qRT-PCR 對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定,以actin-1為內(nèi)參測(cè)定daf-16及其下游靶基因的表達(dá)量,相對(duì)定量結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算,以擴(kuò)增效率為100%計(jì)算基因表達(dá)量差異。引物設(shè)計(jì)見表1。
表1 線蟲基因qRT-PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)
所有計(jì)量資料均使用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,數(shù)據(jù)結(jié)果用(±s)表示。采用單因素(ANOVA)檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。事后比較時(shí),方差齊者用Tukey,方差不齊者用Tamhane'sT2。采用Origin 2022軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。
與模型組比較,異槲皮苷對(duì)線蟲的僵化速率有一定的延緩作用(圖1)。質(zhì)量濃度為6.25 μg·mL-1的異槲皮苷處理后,線蟲僵化速率達(dá)到50%的時(shí)間(PT50)[7]延長(zhǎng)了11.0 h(P<0.001)。這表明異槲皮苷可以緩解Aβ蛋白沉積對(duì)線蟲的毒性作用。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用6.25 μg·mL-1作為異槲皮苷給藥質(zhì)量濃度。
圖1 異槲皮苷對(duì)線蟲非癱瘓率的影響
結(jié)果顯示,模型組線蟲的平均壽命為(7.556±0.667)d,最長(zhǎng)壽命為11 d(圖2)。異槲皮苷組線蟲平均壽命為(9.956±0.583)d,最長(zhǎng)壽命為14 d;與模型組相比,異槲皮苷給藥能顯著延長(zhǎng)線蟲壽命,延長(zhǎng)率為31.7%(P<0.01)。
圖2 異槲皮苷對(duì)線蟲生存率的影響
運(yùn)動(dòng)能力下降說明線蟲本身的機(jī)體功能受到影響,其整體活躍程度能夠通過運(yùn)動(dòng)能力這一重要指標(biāo)反映出來[8]。模型組線蟲30 s 內(nèi)身體彎曲次數(shù)為18.30±2.36,異槲皮苷給藥4 d后,線蟲身體彎曲次數(shù)為25.40±1.89,與對(duì)照組比較增加了38.79%(P<0.001)。
線蟲的吞咽速率在正常生理狀況下能夠反映出線蟲進(jìn)食的能力,進(jìn)而間接反映線蟲的機(jī)體功能是否衰退[9]。實(shí)驗(yàn)第4 天,模型組線蟲20 s 內(nèi)吞咽次數(shù)為38.70±2.45、異槲皮苷組線蟲20 s 內(nèi)吞咽次數(shù)為40.90±1.91;第6 天模型組線蟲20 s 內(nèi)吞咽次數(shù)為32.30±4.01、異槲皮苷組線蟲20 s 內(nèi)吞咽次數(shù)為35.50±1.96。與模型組比較,異槲皮苷組線蟲吞咽頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明異槲皮苷并未對(duì)線蟲的攝食能力產(chǎn)生影響。
極高ROS 水平會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激,這是誘導(dǎo)AD神經(jīng)退行性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要機(jī)制之一[10]。模型組線蟲體內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度為2.645±0.188,異槲皮苷組線蟲體內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度為0.676±0.043。與模型組比較,異槲皮苷組線蟲體內(nèi)ROS 水平明顯降低(P<0.001),熒光圖見圖3。這表明異槲皮苷在線蟲體內(nèi)能夠表現(xiàn)較強(qiáng)的抗氧化能力,可能通過改善氧化應(yīng)激發(fā)揮抗AD的作用。
圖3 線蟲體內(nèi)ROS水平熒光圖
抗氧化酶在減少氧化損傷中起著重要作用[11]。模型組與異槲皮苷組線蟲體內(nèi)SOD 活力分別為(13.376±0.162)、(24.451±0.216)U·mg-1;CAT活力分別為(1.540±0.005)、(8.895±0.014)U·mg-1;MDA 含量分別為(14.558±0.022)、(6.421±0.016)nmol·mg-1。由于SOD、CAT 是線蟲體內(nèi)主要的抗氧化酶,線蟲抗氧化能力的變化可以通過酶活力的升高或降低來表現(xiàn)。異槲皮苷處理能使CL4176 線蟲體內(nèi)的SOD、CAT 活力顯著提高(P<0.01,P<0.001)。MDA 的堆積具有一定的細(xì)胞毒性,是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物。MDA 含量可以反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映出細(xì)胞受損情況。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,給藥組線蟲體內(nèi)MDA的含量相較于模型組顯著降低(P<0.001),表明異槲皮苷組在一定程度上能夠提高線蟲體內(nèi)抗氧化能力,緩解氧化損傷。
與對(duì)照組相比,異槲皮苷給藥組線蟲的AβmRNA 表達(dá)量顯著降低,經(jīng)異槲皮苷處理后線蟲體內(nèi)daf-16轉(zhuǎn)錄水平提高了3.2 倍,下游sod-3轉(zhuǎn)錄水平提高2.3 倍;熱激蛋白基因hsf-1轉(zhuǎn)錄水平提高3.9 倍;skn-1轉(zhuǎn)錄水平提高3.3 倍,下游gst-4轉(zhuǎn)錄水平提高2.1 倍;抗氧化酶基因ctl-1轉(zhuǎn)錄水平提高3.1 倍,可見經(jīng)異槲皮苷處理后,CL4176 線蟲應(yīng)激抗性能夠有所增強(qiáng)(圖4)。
圖4 異槲皮苷對(duì)相關(guān)基因的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(±s,n=3)
AD 是一種常見的與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,其主要致病因素是Aβ寡聚體的錯(cuò)誤折疊和形成,導(dǎo)致不溶性聚集體,最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[12]。線蟲是篩選和發(fā)現(xiàn)抗AD 藥物的理想模式生物,因?yàn)槠渚哂泻?jiǎn)單但有代表性的神經(jīng)系統(tǒng)、生命周期短、遺傳特征較為完善和藥物消耗劑量低[13]。此外,通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因線蟲的AD 模型,可以研究Aβ參與病理行為的直接影響[14]。
Aβ基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致線蟲出現(xiàn)僵化表型,本研究通過線蟲癱瘓實(shí)驗(yàn)篩選出異槲皮苷最佳活性質(zhì)量濃度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,異槲皮苷處理后能夠延緩線蟲CL4176僵化,最佳質(zhì)量濃度為6.25 μg·mL-1。異槲皮苷處理后,能夠顯著延長(zhǎng)在25 ℃條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生Aβ的CL4176 線蟲的生存時(shí)間,同時(shí)線蟲PT50延長(zhǎng)了11.0 h(P<0.001)。異槲皮苷對(duì)線蟲吞咽速率并沒有顯著影響,不存在飲食限制問題,但能夠增強(qiáng)線蟲的運(yùn)動(dòng)能力。并且異槲皮苷能夠顯著降低線蟲體內(nèi)ROS 含量,提高SOD、CAT 活性,降低線蟲體內(nèi)MDA 含量,說明異槲皮苷能夠顯著增強(qiáng)其氧化抗性。
有研究表明,突變導(dǎo)致的胰島素受體功能喪失能夠延長(zhǎng)線蟲壽命[15]。其中,與胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1 信號(hào)通路(IIS)相關(guān)的DAF-16、SKN-1 和HSF-1 轉(zhuǎn)錄因子至關(guān)重要。DAF-16 作為IIS/IGF-1 通路的下游靶標(biāo),是發(fā)育、繁殖、新陳代謝、應(yīng)激反應(yīng)和壽命的中央調(diào)節(jié)因子,并且能正向調(diào)節(jié)SKN-1和HSF-1的活性[16]。HSF-1是調(diào)節(jié)熱應(yīng)激和蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。HSF-1 和DAF-16/FoxO 通過與編碼小熱休克蛋白的基因啟動(dòng)子中的熱休克元件(HSEs)和DAF-16/FoxO 結(jié)合元件(DBEs)結(jié)合延緩衰老[17]。轉(zhuǎn)錄因子SKN-1 是抗氧化活性和異源防御的重要調(diào)節(jié)因子,通過飲食限制或抑制TORC1或TORC2途徑延長(zhǎng)線蟲壽命[18]。研究結(jié)果表明,異槲皮苷依賴并能夠通過激活中央調(diào)節(jié)因子DAF-16,同時(shí)激活關(guān)鍵的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)劑SKN-1 并依賴于SKN-1 來延長(zhǎng)線蟲的壽命。且異槲皮苷還通過激活HSF-1提高了抗熱應(yīng)激能力。
總體而言,上述結(jié)果表明,異槲皮苷依賴并作用于IIS,通過增加應(yīng)激抵抗力,尤其是抗氧化能力,延長(zhǎng)了線蟲模型的壽命并延緩了神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展。
綜上,本研究為異槲皮苷抗AD 的深入研究提供了一定的理論依據(jù)。但本研究尚有不足之處,線蟲體內(nèi)Aβ蛋白的表達(dá)水平及其聚集形態(tài)的觀察指標(biāo)還需要進(jìn)一步研究。