楊青青，米爾扎提·麥麥提，陳星，趙璐，馬璇，

1.新奇康藥業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011；

2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；

3.新疆奇沐醫(yī)藥研究院，新疆 烏魯木齊 830011

沒食子是殼斗科植物沒食子樹Quercus infectorinOliv.幼枝上的干燥蟲癭，是由沒食子蜂Cynips gallae-tinctoriaeOliv.寄生而成，主要產(chǎn)于地中海沿岸阿拉伯、土耳其、巴基斯坦等地區(qū)[1]。沒食子藥用歷史悠久，是維吾爾族醫(yī)常用藥，維吾爾藥物名為莫扎。沒食子藥性溫，入肺、脾、腎經(jīng)，具有固氣、澀精、斂肺、止血的功效[2]。以沒食子為原料，采用現(xiàn)代制劑工藝生產(chǎn)的西帕依固齦液，是國(guó)家基本藥物目錄品種，在臨床用于治療口腔疾病，包括牙齦出血腫痛、牙齒松動(dòng)、咽喉腫痛、瘡瘍腐爛、傷口不愈等。

沒食子化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有固醇類、黃酮類、生物堿類、鞣質(zhì)類、揮發(fā)油、皂苷、蒽醌類等[3]。在這些成分中，以鞣質(zhì)為主，占總成分的50%～70%[4-5]，迄今，已確定了約10 種鞣質(zhì)類化合物[4]。中藥化學(xué)組成復(fù)雜，常用的定量檢測(cè)方法只測(cè)定其中的1 種或者幾種成分，存在著一定局限性；另外，采用大型精密儀器測(cè)定多成分含量的成本較高，檢測(cè)樣品需要進(jìn)行前處理、建立方法較費(fèi)時(shí)、整體操作繁瑣，且過程中使用一定毒性試劑的情況較多，長(zhǎng)期使用對(duì)環(huán)境不利。紅外光譜技術(shù)具有靈敏度高、特征性強(qiáng)、快速、無(wú)損等特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的整體性、客觀性、科學(xué)性，能反映藥材內(nèi)部復(fù)雜成分峰的疊加，一定程度上也可以反映藥材大類成分及其比例，故可較全面地體現(xiàn)藥材的質(zhì)量。有關(guān)沒食子藥材的紅外鑒別結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析在其質(zhì)量差異方面的研究未見報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建了不同來(lái)源沒食子藥材的紅外光譜，采用二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜和多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合的方法對(duì)25 批沒食子藥材進(jìn)行了鑒別，以補(bǔ)充其鑒別信息，使研究結(jié)果能夠相互印證，為分析和評(píng)價(jià)其質(zhì)量差異提供參考。

1 材料

1.1 樣品

沒食子藥材共25批（編號(hào)S1～S25），其中S1～S5來(lái)源于廣西玉林市、S6～S10 來(lái)源于廣東廣州市、S11～S15來(lái)源于安徽亳州市，采購(gòu)時(shí)間為2019—2021年；S16～S20產(chǎn)于伊朗哈吉阿巴德、S21～S25產(chǎn)于土耳其約茲加特，采購(gòu)時(shí)間為2018—2020 年。所有藥材經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院蘇來(lái)曼·哈力克主任藥師鑒定，均為殼斗科植物沒食子Gall ofQuercus infectoriaOliv.。

1.2 試藥

溴化鉀（光譜純，批號(hào)：20200408）、無(wú)水乙醇（分析純，批號(hào)：20220528）均購(gòu)于天津市鑫鉑特化工有限公司；水為純凈水。

1.3 儀器

Spectrum Two 型傅里葉變換紅外分光光度計(jì)（美國(guó)PekinElmer 公司）；YP-15 型粉末壓片機(jī)[中世沃克（天津）科技發(fā)展股份有限公司]；FW-80 型粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；ME204T型萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅外光譜的建立

2.1.1 樣品制備與數(shù)據(jù)處理 除去沒食子藥材中的雜質(zhì)，粉碎，200 目過篩，密封保存，存放在干燥處。將沒食子樣品粉末3 mg與干燥溴化鉀300 mg研磨混合；將混合好的樣品150 mg 放入專用壓片模具中，以30 MPa壓制3 min，得到1塊均勻、半透明的薄片，同法制備溴化鉀作為空白片。數(shù)據(jù)處理通過利用Spectrum 5.0.1 軟件，二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜處理參數(shù)：平滑點(diǎn)13。

2.1.2 測(cè)定條件 傅里葉變換紅外分光光度計(jì)掃描范圍為4000～400 cm-1，設(shè)置自動(dòng)扣除CO2和H2O 的干擾，掃描頻率為16 次/s，掃描速度0.2 cm·s-1，光譜分辨率4 cm-1，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為25～30 ℃，相對(duì)濕度為25%～40%。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 將沒食子樣品（編號(hào)S1）的粉末按2.1.1 項(xiàng)下的步驟配制，按2.1.2 項(xiàng)下條件，連續(xù)測(cè)6 次，并用Spectrum 軟件進(jìn)行紅外光譜圖對(duì)比。結(jié)果表明，該方法的紅外光譜相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0、0.998 4、0.996 9、0.997 1、0.998 6、0.998 1，RSD 為0.11%，說(shuō)明該方法的精密度較好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取沒食子樣品（編號(hào)S1）的粉末6 份，按2.1.1 項(xiàng)下方法配制供試樣品片，按2.1.2 項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，并用Spectrum 軟件進(jìn)行紅外光譜圖對(duì)比。結(jié)果顯示，譜間相關(guān)系數(shù)為1.000 0、0.998 4、0.996 9、0.996 2、0.996 2、0.995 5，RSD為0.16%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將沒食子樣品（編號(hào)S1）粉末體按2.1.1 項(xiàng)下方法配制成試樣，置于干燥器中，分 別在0、30、60、90、120、150、180 min，按2.1.2 項(xiàng)下方法測(cè)定，并用Spectrum 軟件進(jìn)行紅外光譜圖對(duì)比。結(jié)果顯示，譜間相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0、0.997 8、0.995 0、0.992 3、0.989 9、0.987 2、0.986 6，RSD為0.52%。說(shuō)明該樣品在常溫下放置180 min，其穩(wěn)定性較好。

2.1.6 紅外光譜數(shù)據(jù)分析 采用2.1.1 項(xiàng)下方法，將25 批食子樣品粉末制成供試樣品片，并按2.1.2項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，利用Spectrum 軟件采集以上藥材樣品的紅外光譜圖進(jìn)行比對(duì)，共獲得25 批沒食子藥材的紅外光譜圖，結(jié)果見圖1。研究表明，25 批次沒食子樣品的紅外光譜圖的相關(guān)系數(shù)為0.932 7～0.995 6；所得的紅外光譜圖峰形、峰位基本相似，表明不同來(lái)源的沒食子藥材中的化學(xué)成分相近，所含的特征峰和形態(tài)基本相同，而指紋區(qū)（900～1800 cm-1）則有明顯的差別。利用OMNIC 8.2軟件對(duì)25批沒食子樣品的紅外光譜圖進(jìn)行了分析，并將其透過率轉(zhuǎn)化為吸光度，從而得出了不同來(lái)源沒食子藥材的平均紅外光譜圖，見圖2。

圖1 25批沒食子藥材樣品的紅外透過率疊加光譜

圖2 不同來(lái)源沒食子樣品的平均紅外光譜圖

將不同產(chǎn)地沒食子進(jìn)行吸光度處理后，發(fā)現(xiàn)25批沒食子藥材樣品有18個(gè)峰（圖2）。中藥沒食子粉末主要在3380、2928、2832、2714、1718、1612、1534、1448、1374、1315、1197、1081、1027、868、757、651、590、526 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰。O-H 基的伸縮振動(dòng)值為3650～3200 cm-1，是判斷是否存在醇類、酚類和有機(jī)酸的主要依據(jù)。當(dāng)醇和酚溶于非極性溶劑（如CCl4），在3650～3580 cm-1處出現(xiàn)游離O-H 基的伸縮振動(dòng)吸收峰，峰形較尖，不受其他吸收峰的影響，容易辨認(rèn)。隨著樣品濃度的增大，羥基化合物出現(xiàn)結(jié)合現(xiàn)象，O-H 基的伸縮振動(dòng)吸收峰向低波數(shù)偏移，并在3400～3200 cm-1處形成了一個(gè)較大的吸收峰[6-7]；在該實(shí)驗(yàn)中，3400～3200 cm-1的大吸收峰是分子間氫鍵O-H 伸縮振動(dòng)吸收峰。在3000 cm-1以下，存在著飽和C-H 伸縮振動(dòng)，而在3000～2800 cm-1處，取代基對(duì)C-H 伸縮振動(dòng)偏移影響不大；在2928 cm-1處，是亞甲基C-H 反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；在2832 cm-1處，是亞甲基C-H 的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰[8-9]。在2714 cm-1處存在醛基伸縮振動(dòng)吸收峰。在1900～1650 cm-1處，C=O 產(chǎn)生伸縮振動(dòng)，這是一種非常典型的紅外光譜，可以很好地分辨出酮類、醛類、酸類、酯類及酸酐等有機(jī)物質(zhì)。由于振動(dòng)耦合作用，酸酐的羰基吸收帶呈現(xiàn)出雙峰。在1718 cm-1處，吸收峰為C=O伸縮振動(dòng)峰，如羧酸類和酯類[10]。在1612、1448 cm-1處對(duì)應(yīng)苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)的吸收峰，結(jié)合1718 cm-1位置的峰特征，推測(cè)其為鞣質(zhì)類化合物，與文獻(xiàn)中所報(bào)告的沒食子中所含的化學(xué)成分相符[2,11-13]。1534 cm-1主要表現(xiàn)為N-H的彎曲振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)，是蛋白酰胺Ⅱ帶吸收峰[10]。1374 cm-1的譜帶為甲基的C-H 對(duì)稱彎曲振動(dòng)。結(jié)合1718 cm-1處酯羰基，1197 cm-1可能為丙酸伸縮振動(dòng)峰。譜圖中1300～1100 cm-1處存在較強(qiáng)的C-O 吸收峰，1900～1650 cm-1具有較強(qiáng)的C=O 吸收峰，這說(shuō)明其為典型的羧酸酯類化合物。在1081、1027 cm-1處，吸收峰為糖類和糖苷類成分中的C-O 伸縮振動(dòng)峰。糖環(huán)振動(dòng)吸收峰值為1000～800 cm-1，糖骨架振動(dòng)吸收峰值為1200～1000 cm-1[14-15]，沒食子藥材紅外光譜峰歸屬詳見表1。

表1 沒食子藥材紅外光譜峰歸屬

2.1.7 沒食子的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜分析 二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜可以分離出原光譜中的一些相互重疊的吸收峰，從而提高了譜的分辨率。從圖3 可以看出，在2928、2832 cm-1的亞甲基伸縮振動(dòng)吸收峰原光譜中并不明顯，在紅外導(dǎo)數(shù)圖譜中，可以很明顯地確認(rèn)。1800～1600 cm-1沒食子二階導(dǎo)數(shù)圖可以將其在原譜圖上重疊的紅外吸收峰區(qū)別開，出現(xiàn)具有特征的三峰等。在1580～1420、1200～950 cm-1波段的譜峰特征有明顯增加，1362 cm-1處在原光譜中不明顯的肩峰在二階導(dǎo)數(shù)圖譜中表現(xiàn)出了不同來(lái)源沒食子的差異性。

圖3 沒食子藥材不同來(lái)源平均二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖

2.2 正態(tài)分布分析

以1027 cm-1最大吸收峰值為參考，通過Spectrum軟件對(duì)共有峰峰高進(jìn)行歸一化處理，得出了1 個(gè)共有峰的相對(duì)峰高，由于3380 cm-1是O-H 的吸收峰，在1900～1700 cm-1處以酯類成分為主，在1700～1500 cm-1處以酸類成分為主，在1200～800 cm-1處以糖類成分為主，其余4個(gè)波數(shù)是沒食子藥材紅外光譜中最強(qiáng)的吸收峰，在上述3個(gè)波段內(nèi)，選取了6個(gè)共有峰進(jìn)行了分析。由圖4可知，1612 cm-1處5個(gè)不同來(lái)源沒食子藥材樣品區(qū)分開來(lái)，采用Microsoft Excel 2016軟件，以不同來(lái)源沒食子藥材樣品1612 cm-1處吸收峰的相對(duì)峰高比值為橫、縱坐標(biāo)繪制正態(tài)分布曲線，見圖5。由圖5可知，廣西和安徽沒食子藥材的正態(tài)分布曲線不相交，說(shuō)明兩者之間的質(zhì)量有顯著的差別；中國(guó)廣西、廣東的沒食子藥材與伊朗來(lái)源的沒食子藥材正態(tài)分布曲線有相交，說(shuō)明它們之間的樣品質(zhì)量接近。

圖4 不同來(lái)源沒食子樣品中6個(gè)共有峰的相對(duì)峰高

圖5 不同來(lái)源沒食子樣品的正態(tài)分布曲線

2.3 聚類分析

從25 批沒食子藥材樣品18 個(gè)峰中選取11 個(gè)特征 峰（3380、1718、1612、1534、1448、1374、1315、1081、1027、868、757 cm-1附近處吸收峰），以其相對(duì)峰強(qiáng)度為原始數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，采用組間連接法，以平方Euclidean距離為分類依據(jù)，對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，見圖6。由圖6可知，當(dāng)組間距離為10～15時(shí)，25批沒食子藥材樣品可聚為4 類，其中S1、S2、S4、S5、S9、S11、S13、S16、S17、S19、S24 聚為一類，S6、S7、S8、S10、S12、S15、S18、S20、S21、S22、S23聚為一類，S3、S25聚為一類，S14聚為一類。

圖6 25批沒食子藥材樣品的聚類分析樹狀圖

2.4 主成分分析

主成分分析是多個(gè)變量變換以選出較少重要變量的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，目前已被廣泛用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析[16]。以25 批沒食子藥材樣品中11 個(gè)特征峰的相對(duì)強(qiáng)度為原始數(shù)據(jù)，通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行降維因子分析。結(jié)果顯示，前4 個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為89.565%＞85%，充分地反映沒食子樣品中11個(gè)特征峰的基本特征和主要信息，故選取特征值＞1的前4 個(gè)主成分特征值，分別為4.659、2.736、1.920、1.433（表2），前4 個(gè)因子斜率陡峭，后趨于平緩（圖7），故將前4 個(gè)因子作為主成分進(jìn)行分析。按公式（1）計(jì)算綜合得分，綜合得分是以各主成分的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重，對(duì)主成分得分和對(duì)應(yīng)權(quán)重進(jìn)行加權(quán)平均，可反映沒食子藥材的質(zhì)量，較高得分表示其質(zhì)量較好。在25 批沒食子藥材中，廣西來(lái)源的綜合得分最高，而安徽來(lái)源的綜合得分最低，結(jié)果見表3。

表2 25批沒食子藥材主成分特征值與方差貢獻(xiàn)率

表3 25批沒食子藥材樣品的綜合得分

圖7 沒食子藥材的主成分分析碎石圖

式中A1（主成分1）、A2（主成分2）、A3（主成分3）、A4（主成分4）是4個(gè)主成分的新變量名。

2.5 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

將25 批沒食子樣品共有峰的相對(duì)峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，進(jìn)行OPLS-DA，結(jié)果見圖8，25批沒食子樣品可很好地聚類為4 類，與聚類分析、主成分分析結(jié)果一致。提取OPLS-DA 模型中11 個(gè)變量的變量重要性投影（VIP）值并從大到小排序，以VIP 值＞1 為引起沒食子藥材批次間差異的主要標(biāo)志性成分，是區(qū)分樣品最關(guān)鍵的色譜峰，對(duì)樣品分類作用較大[17-19]，結(jié)果見圖9。共篩選出5 個(gè)影響沒食子藥材質(zhì)量的關(guān)鍵波數(shù)，其VIP 值從大到小對(duì)應(yīng)的波數(shù)依次為1614（1.316 3）、1373（1.117 4）、1535（1.082 2）、1027（1.070 6）、1079（1.025 1）、1448（1.012 4）cm-1，其中1614、1535 cm-1處為酸類成分的特征吸收峰，1079、1027 cm-1處為糖苷類成分的特征吸收峰。

圖8 25批沒食子藥材樣品的OPLS-DA得分圖

圖9 25批沒食子藥材共有峰波數(shù)的VIP值

3 討論

傅里葉變換紅外光譜是鑒別化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)常用的方法，將其應(yīng)用于中藥類鑒別可避免復(fù)雜的樣品前處理，且具有快速、樣品無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)中藥所含化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行整體、有效地分類識(shí)別。本研究建立了紅外光譜法測(cè)定沒食子藥材的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果顯示，該方法的精密度高、重復(fù)性好、在0～180 min 內(nèi)穩(wěn)定性較好。同時(shí)，在進(jìn)行該方法的建立時(shí)，還考察了樣品的壓片情況，試驗(yàn)了100、150、200 mg 壓片，結(jié)果表明，100 mg的樣品量較少，壓片成形性不好；200 mg 壓的片較厚，透明度較差；150 mg 壓片成型與透明度較好，最后，確定了壓片使用的樣品量為150 mg。此外，還考察了樣品與溴化鉀壓片的比例（1∶100、1∶150、1∶200），其中1∶100的比例效果最佳。

通過對(duì)25 批沒食子藥材樣品正態(tài)性分析可知，廣西來(lái)源與安徽來(lái)源沒食子藥材質(zhì)量存在明顯差異，中國(guó)廣西、廣東來(lái)源沒食子藥材與伊朗來(lái)源藥材樣品質(zhì)量相近。聚類分析將波數(shù)相似大的藥材聚為一類，結(jié)果聚為4 類。根據(jù)主成分分析結(jié)果可知，廣西來(lái)源沒食子藥材的綜合得分最高，安徽來(lái)源沒食子藥材的綜合得分最低。OPLS-DA 模型與聚類分析結(jié)果一致，VIP值分析得到了5個(gè)影響沒食子藥材質(zhì)量的關(guān)鍵波數(shù)，其中1614、1535 cm-1處為鞣質(zhì)類、蛋白質(zhì)類成分的特征吸收峰，1079、1027 cm-1處為糖苷類成分的特征吸收峰。

本研究結(jié)果顯示，沒食子紅外光譜圖、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜、結(jié)合正態(tài)分布、聚類分析、主成分分析和OPLS-DA，結(jié)果相互補(bǔ)充和印證，該方法可對(duì)不同來(lái)源的沒食子藥材進(jìn)行快速鑒別，本研究結(jié)果豐富了沒食子藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，為藥材鑒別提供了一種新的方法。