唐進(jìn)程，祁曉娟，趙江怡，張媛，2，劉鳳波，2，趙婷，2*，魏勝利，2*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；

2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102

大黃為蓼科大黃屬植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃R.tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃R.officinaleBaill.的干燥根及根狀莖，具有瀉下攻積、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)等功效，臨床上主要用于實熱便秘、積滯腹痛、瀉痢不爽等[1]。大黃應(yīng)用廣泛，是常用大宗藥材之一，也是傳統(tǒng)的出口中藥材之一[2-3]。

對中藥材的質(zhì)量評價主要包括外觀性狀和內(nèi)在成分兩方面，其中傳統(tǒng)性狀特征在鑒別中藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣和保障臨床用藥安全有效方面發(fā)揮著重要作用。大黃傳統(tǒng)以根粗大、質(zhì)堅實、顏色棕紅或黃色、味苦為佳[4-5]。而對于大黃的內(nèi)在質(zhì)量，已有研究認(rèn)為雙蒽酮類和結(jié)合蒽醌類成分是其發(fā)揮瀉下攻積功效的主要成分[6-7]，游離蒽醌類是其發(fā)揮清熱瀉火功效的主要成分[8]，而鞣質(zhì)類成分是其發(fā)揮逐瘀通經(jīng)功效的主要成分[9]。但是，以上大黃的外在性狀與其內(nèi)在質(zhì)量之間有無顯著的相關(guān)性、能否基于“辨狀論質(zhì)”理論對大黃質(zhì)量進(jìn)行快速綜合的評價還有待進(jìn)一步研究。代婉瑩等[10]研究了銓水大黃外觀性狀與5個蒽醌類成分含量的關(guān)系，劉書斌等[11]基于性狀與灰色關(guān)聯(lián)法對不同規(guī)格大黃飲片質(zhì)量進(jìn)行比較研究，結(jié)果均表明，大黃的外觀性狀與成分含量有一定的相關(guān)性。但是，上述研究中大黃顏色、硬度、味道等性狀指標(biāo)的數(shù)量化和系統(tǒng)性不足；另一方面，由于大黃在野生資源為主時期的主流藥用部位是根狀莖，所以優(yōu)質(zhì)大黃的性狀特征主要指根狀莖，而目前栽培大黃的主要藥用部位既有根狀莖也有根，過去“辨狀論質(zhì)”的顏色、粗度和硬度是否適合栽培藥材，目前未見報道。本研究以栽培4 年的唐古特大黃為研究對象，在大范圍取樣的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)探討大黃部位（根狀莖及不同粗度的根）、硬度、顏色、苦味與主要藥效成分5 個游離蒽醌（大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚）、番瀉苷A、番瀉苷B、沒食子酸、兒茶素、總蒽醌含量之間的相關(guān)性，旨在為唐古特大黃的“辨狀論質(zhì)”理論提供實驗支撐，為建立客觀、科學(xué)的唐古特大黃質(zhì)量評價方法提供參考。

1 材料

1.1 樣品

在青海、四川、甘肅3 個省的栽培試驗地采集4 年生唐古特大黃7 批，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院魏勝利教授鑒定為唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.。為了探究藥材部位與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性，處理樣品時將每批大黃藥材根狀莖和根分開加工，根按照直徑分為＜3 cm、3～5 cm、＞5 cm 3個水平[12]，60 ℃烘干48 h，用于后續(xù)實驗的測定。28 份樣品信息見表1。

表1 唐古特大黃樣品信息

1.2 試藥

對照品沒食子酸（批號：Y19M8C36143）、兒茶素（批號：P20O7F23087）、番瀉苷A（批號：P01S8F42887）、番瀉苷B（批號：Y23M8Y17128），大黃酸（批號：T30A8F42628）、大黃酚（批號：T23A8F42188）、大黃素（批號：C18F8Q29652）、蘆薈大黃素（批號：T28D6F8264）、大黃素甲醚（批號：T26A8F34784），純度均≥98%，均購自上海源葉生物科技有限公司；水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；甲醇、濃鹽酸、三氯甲烷（分析純，北京化工廠）；甲醇、乙腈（色譜級，賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸（色譜級，天津市光復(fù)化工研究所）。

1.3 儀器

CM-5 型分光測色儀（日本柯尼卡美能達(dá)有限公司）；α-Astree Ⅱ型電子舌（法國Alpha MOS 公司）；TMS-PRO 型質(zhì)構(gòu)儀（北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司）；e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ5200D 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-3000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；BT 25S 型十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AL204型萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；FW100 型高速萬能粉碎機(jī)、LG-01型手提式高速粉碎機(jī)（瑞安市百信制藥機(jī)械有限公司）；JA31002 型電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；DZTW型電子調(diào)溫電熱套（北京鑫潤科諾儀器儀表有限公司）；0201001 型游標(biāo)卡尺（上海三圈刃具銷售有限公司）；KD0248 型切片鍘刀（廣州膳道信息科技有限公司）。

2 方法

2.1 性狀特征客觀量化

2.1.1 粗度 將唐古特大黃分為根狀莖和根，使用游標(biāo)卡尺測量唐古特大黃根的直徑，按＞5 cm、3～5 cm、＜3 cm 進(jìn)行分類。

2.1.2 硬度

2.1.2.1 測定方法 以上述干燥唐古特大黃的根與根狀莖為材料，根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，選擇采用穿刺法對藥材硬度進(jìn)行測定。

2.1.2.2 條件 采用P/2n 針狀探頭（直徑2 mm）；力量感應(yīng)元量程：1000 N；分辨率：0.01 N；起始力：1.5 N；試驗檢測速度：30 mm·min-1；穿刺距離：15 mm；回程速度：40 mm·min-1；回程距離：20 mm。將樣品放置在水平臺上，通過探頭下壓直至樣品達(dá)到設(shè)定的穿刺深度，每批樣品重復(fù)測試3次。

2.1.2.3 精密度考察 取同一供試品，按2.1.2.2項下條件重復(fù)測定6次，記錄硬度值，RSD為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.1.2.4 樣品測定 按照2.1.2.2 項下條件重復(fù)測定9次，記錄硬度值。

2.1.3 顏色 按本課題組前期建立的方法[13]，采用分光測色儀測定唐古特大黃樣品的明度值（L*）、紅色值（a*）、黃色值（b*）。

2.1.4 味道 大黃味苦，因此本研究只測定樣本的苦味值（SCS）。

2.1.4.1 電子舌分析條件 電子舌經(jīng)過診斷、預(yù)平衡、校準(zhǔn)，確保儀器采集的數(shù)據(jù)可靠、穩(wěn)定。采集溫度：25 ℃；采集時間：120 s；采集周期：1 s；攪動速度：1 r·s-1；清洗液：純化水。正式檢測前用清洗液清洗傳感器30 s，重復(fù)5 次。樣品體積25 mL，每份樣品按照上述條件平行測定9次，取后3次測定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.1.4.2 供試品溶液的制備 取藥材0.5 g，加入沸水50 mL，煎煮10 min，趁熱濾過，濾液加蒸餾水定容至50 mL，5000 r·min-1離心10 min（離心半徑為4 cm），取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液25 mL于樣品杯中測定。

2.2 藥效成分含量測定

按本課題組前期建立的方法[14]測定大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、番瀉苷A、番瀉苷B、沒食子酸、兒茶素9個成分（以下簡稱9 個成分）的含量。采用《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（一部）[1]大黃藥材游離蒽醌、總蒽醌的含量測定方法，分別測定水解前游離蒽醌和水解后游離蒽醌含量，總蒽醌含量為5 個水解后游離蒽醌含量之和，按公式（1）計算5 個結(jié)合蒽醌（大黃素苷、大黃酸苷、蘆薈大黃素苷、大黃素甲醚苷、大黃酚苷）含量。

2.2.1 對照品溶液的制備

2.2.1.1 9 個成分對照品溶液的制備 分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、番瀉苷B、番瀉苷A 對照品適量，加甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.233 0、0.225 0、0.172 0、0.242 0、0.176 0、0.278 0、0.372 0 mg·mL-1的對照品儲備液；分別精密稱取沒食子酸、兒茶素對照品適量，加甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.092 8、0.147 6 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.2.1.2 總蒽醌對照品溶液的制備 按《中國藥典》2020 年版（一部）[1]大黃藥材總蒽醌含量測定項下對照品溶液制備方法制備。

2.2.2 供試品溶液的制備

2.2.2.1 9 個成分供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末0.25 g，置具塞三角瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h（200 W，40 Hz），放冷，稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.2 總蒽醌供試品溶液的制備 按《中國藥典》2020年版（一部）[1]大黃藥材總蒽醌、游離蒽醌含量測定項下供試品溶液制備方法。

2.2.3 色譜條件 Agilent ZQRBA SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脫（0～5 min，2%～10%A；5～13 min，10%～15%A；13～20 min，15%～16%A；20～25 min，16%～22%A；25～30 min，22%～23%A；30～36 min，23%～24%A；36～45 min，24%～26%A；45～55 min，26%～36%A；55～61 min，36%～60%A；61～86 min，60%～80%A）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。該條件下對照品及供試品色譜圖見圖1?？傒祯?個結(jié)合蒽醌含量測定流動相洗脫條件按《中國藥典》2020 年版（一部）[1]大黃中總蒽醌含量測定項測定，該條件下對照品及供試品色譜圖見圖2。

圖2 5個蒽醌類成分對照品及唐古特大黃供試品色譜圖

2.3 統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對唐古特大黃外觀性狀指標(biāo)（粗度、硬度、顏色、苦味）與主要藥效成分（5 個游離蒽醌及其苷類、番瀉苷A、番瀉苷B、沒食子酸、兒茶素、總蒽醌）含量進(jìn)行相關(guān)性分析和聚類分析，繪制聚類圖。

3 結(jié)果

3.1 外觀性狀指標(biāo)測定結(jié)果

對唐古特大黃不同藥用部位的硬度、顏色、苦味3 項性狀指標(biāo)進(jìn)行量化測定（表2）。方差分析結(jié)果表明，不同部位的硬度、a*、b*、SCS 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。多重比較結(jié)果表明，根狀莖的以上4個指標(biāo)水平均顯著高于3～5 cm根及＜3 cm根（P＜0.05），且與＞5 cm 根的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明，根狀莖的外觀性狀與＞5 cm 根差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與3～5 cm 根及＜3 cm 根的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 唐古特大黃根狀莖及各粗度根外觀性狀指標(biāo)測定結(jié)果（±s,n=7）

表2 唐古特大黃根狀莖及各粗度根外觀性狀指標(biāo)測定結(jié)果（±s,n=7）

注：不同小寫字母表示P＜0.05；表3同。

3.2 藥效成分指標(biāo)測定結(jié)果

對唐古特大黃根狀莖及各粗度根藥效成分含量進(jìn)行測定（表3）。方差分析結(jié)果表明，不同部位的沒食子酸、番瀉苷B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酚苷、大黃素甲醚苷及總蒽醌含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。多重比較結(jié)果表明，根狀莖的沒食子酸含量顯著低于＜3 cm根（P＜0.05），番瀉苷含量顯著高于各粗度根（P＜0.05），蘆薈大黃素、大黃酸含量顯著高于＜3 cm 根（P＜0.05），大黃酚、大黃素甲醚及總蒽醌含量顯著高于3～5 cm根及＜3 cm根（P＜0.05），大黃酚苷含量顯著高于3～5 cm根（P＜0.05），大黃素甲醚苷含量顯著低于各粗度根（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，根狀莖的藥效成分含量與各粗度根差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且與3～5 cm根及＜3 cm根的差異較為明顯。

表3 唐古特大黃根狀莖及各粗度根藥效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（±s,n=7）%

表3 唐古特大黃根狀莖及各粗度根藥效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（±s,n=7）%

3.3 性狀指標(biāo)與藥效成分含量的相關(guān)性分析

相關(guān)分析結(jié)果表明，唐古特大黃外觀性狀與部分藥效成分含量之間存在顯著的相關(guān)性（圖3）。根粗度與大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、總蒽醌含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與大黃素含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與沒食子酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。根硬度與大黃酸含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與番瀉苷B、大黃素、大黃酚含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；根的L*與番瀉苷A含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），a*與沒食子酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），b*與大黃酚含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；根的SCS與沒食子酸、番瀉苷A 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。上述性狀指標(biāo)與藥效成分含量在根莖中的相關(guān)趨勢與根一致。但也有部分性狀指標(biāo)與藥效成分含量的相關(guān)趨勢在根與根莖之間有所差異。根的a*與大黃酚、大黃素甲醚含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），b*與大黃素甲醚含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；根的SCS與大黃素甲醚含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。上述性狀指標(biāo)與藥效成分含量在根莖中的相關(guān)趨勢與根相反。這表明在一定范圍內(nèi)，根及根狀莖的粗度和硬度越大、顏色偏橙色且暗（L*小，a*、b*大）、苦味越小，藥材中的沒食子酸、番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸、大黃素及總蒽醌含量就越高。不同的是，大黃酚、大黃素甲醚均在顏色偏橙色（a*、b*大）的根中含量較高，大黃酚在顏色偏黃色（a*小、b*大）的根狀莖中含量較高，大黃素甲醚在顏色偏褐色（a*、b*?。┑母鶢钋o中有較高含量。

圖3 唐古特大黃外觀性狀與化學(xué)成分的相關(guān)性分析

3.4 聚類分析

聚類分析結(jié)果顯示，28 個唐古特大黃樣品可以分為3類（圖4），各類唐古特大黃的外觀性狀指標(biāo)及各類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表4。S6-G1、S17-GJ、S5-GJ、S13-GJ、S10-G1、S18-G1、S9-GJ、S1-GJ、S2-G1、S22-G1、S24-G3、S28-G3、S26-G1、S27-G2聚為第1 類，該類唐古特大黃部位主要為根狀莖及＞5 cm根，硬度大，顏色偏橙（a*、b*大），苦味小，結(jié)合蒽醌及蒽酮總量、游離蒽醌總量均高于其他唐古特大黃，表明該類大黃在發(fā)揮瀉下攻積和清熱瀉火功效上具有潛在優(yōu)勢。S15-G2、S20-G3、S7-G2、S16-G3、S8-G3、S19-G2、S11-G2、S12-G3、S3-G2、S4-G3 聚為第2 類，該類唐古特大黃部位主要為3～5 cm 及＜3 cm 根，硬度小，顏色偏黃（b*大），苦味小，鞣質(zhì)總量為3類唐古特大黃中最高，說明該類大黃在發(fā)揮逐瘀通經(jīng)功效上具有潛在優(yōu)勢。S21-GJ、S23-G2、S14-G1、S25-GJ 聚為第3 類，該類唐古特大黃硬度小，顏色偏淡（L*、b*?。?，其味較苦，游離蒽醌總量次于第1 類，鞣質(zhì)總量、結(jié)合蒽醌及蒽酮總量均為3 類唐古特大黃中最低，表明該類大黃總體質(zhì)量較差。值得注意的是，第1 類唐古特大黃中除S24-G3、S28-G3、S27-G2外，其他樣品均為根狀莖或者＞5 cm 根，這表明根狀莖與＞5 cm 根在外觀性狀及化學(xué)成分上較為相似，這與外觀性狀及藥效成分含量方差分析結(jié)果一致。

圖4 唐古特大黃樣品聚類圖

表4 不同類唐古特大黃外觀性狀指標(biāo)及各類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（±s,n=7）

表4 不同類唐古特大黃外觀性狀指標(biāo)及各類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（±s,n=7）

4 討論

“辨狀論質(zhì)”是一種快速辨別中藥材品質(zhì)的方法，在判斷藥材質(zhì)量優(yōu)劣方面發(fā)揮著重要作用。《本草經(jīng)集注》記載大黃“味甚苦，色至濃黑為佳”[15]?！吨袊幍洹?963 年版記載“大黃，傳統(tǒng)以質(zhì)堅實、紅棕色、味苦為佳”[4]?！吨袊幍洹?020 年版對大黃的性狀描述為“質(zhì)堅實、斷面淡紅棕色或者黃棕色、味苦”[1]。本研究結(jié)果表明，唐古特大黃外觀性狀與其內(nèi)在藥效成分（沒食子酸、番瀉苷A、番瀉苷B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酚苷、大黃素甲醚苷、總蒽醌）具有顯著或極顯著的相關(guān)性，優(yōu)質(zhì)的唐古特大黃部位多為＞5 cm 的根及根狀莖，往往具有硬度大、顏色偏橙、苦味小的性狀特點。其中，硬度大與傳統(tǒng)評價經(jīng)驗“質(zhì)堅實”相符合。代婉瑩等[10]研究表明，無糠芯大黃中蒽醌含量較高，側(cè)面反映硬度大的大黃質(zhì)量較好；顏色偏橙與部分本草記載中相符，也有其他研究表明顏色偏紅黃且暗的大黃中蒽醌含量較高，質(zhì)量較優(yōu)[10-11,16]，與本研究結(jié)果一致。以上表明，傳統(tǒng)經(jīng)驗在辨別優(yōu)質(zhì)藥材時是非常實用的。但是，也有一些傳統(tǒng)經(jīng)驗性狀指標(biāo)存在值得商榷之處，如大黃傳統(tǒng)經(jīng)驗以“味苦為佳”則與本研究結(jié)論不符，后續(xù)需要通過進(jìn)一步研究加以驗證。

對根狀莖和根之間的外觀性狀與藥效成分含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根狀莖的外觀性狀與＞5 cm根差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與3～5 cm 根及＜3 cm 根差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；根狀莖中大部分藥效成分含量與＞5 cm根差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與3～5 cm根及＜3 cm 根差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，部位也是影響藥材質(zhì)量的重要因素。相關(guān)性分析結(jié)果表明，外觀性狀與藥效成分含量相關(guān)性趨勢在根狀莖和根中基本一致，但也有例外，如a*、b*、SCS 與大黃素甲醚含量相關(guān)性趨勢在兩者中相反。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)不同性狀的唐古特大黃內(nèi)在質(zhì)量存在不同的特點，如顏色偏淡（L*、a*?。⒖辔缎〉奶乒盘卮簏S藥材中鞣質(zhì)總量較高；硬度大、顏色偏橙（a*、b*大）及苦味小的唐古特大黃藥材中結(jié)合蒽醌及蒽酮總量較高；部位為根狀莖及＞5 cm 根，硬度大、顏色偏橙（a*、b*大）、苦味大的唐古特大黃藥材中游離蒽醌總量較高。而不同類成分對應(yīng)不同的藥效，大黃中的鞣質(zhì)類、游離蒽醌類、結(jié)合蒽醌及蒽酮類成分分別對應(yīng)大黃的逐瘀通經(jīng)、清熱瀉火及瀉下攻積功效[6-9]。因此，可以通過外觀性狀來選擇合適藥效的藥材，這是對“辨狀論質(zhì)”理論的一種新應(yīng)用。

本研究基于“辨狀論質(zhì)”理論，探索了唐古特大黃外觀性狀與主要藥效成分含量之間的相關(guān)性，以期為完善大黃質(zhì)量評價體系奠定實驗基礎(chǔ)，為其他藥材“辨狀論質(zhì)”研究提供方法借鑒，為闡釋“辨狀論質(zhì)”理論的科學(xué)性奠定基礎(chǔ)。