董克臣，張萌，梁毅，李松，費(fèi)新雄

作者單位：黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）頭頸腫瘤內(nèi)科，湖北 黃石435200

急性放射性口腔黏膜炎（ROM）是口腔黏膜受射線照射后出現(xiàn)的以紅斑和潰瘍?yōu)橹饕卣鞯募毙匝装Y［1］。急性ROM是頭頸部腫瘤放療最常見的并發(fā)癥之一，也是主要的劑量限制性毒性反應(yīng)［2］?，F(xiàn)有理論認(rèn)為，炎癥反應(yīng)在急性ROM中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞是口腔中重要的固有免疫細(xì)胞，生理情況下處于靜息狀態(tài)，維持口腔微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。放射刺激可使口腔黏膜中的巨噬細(xì)胞迅速被極化為M1和M2兩種表型［3-5］。M1型（經(jīng)典活化）巨噬細(xì)胞高表達(dá)促炎因子，介導(dǎo)促炎反應(yīng)，造成組織損傷。M2型（替代性活化）巨噬細(xì)胞高表達(dá)抗炎因子，介導(dǎo)抗炎反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)［6-7］。因此，抑制巨噬細(xì)胞M1型極化，促進(jìn)M2型極化可能為防治急性ROM的新策略。康復(fù)新液富含表皮生長因子、多元醇類及多種氨基酸等活性成分，對急性ROM具有較好的防治作用，文獻(xiàn)報(bào)道其機(jī)制主要與抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)［8］，能否調(diào)控巨噬細(xì)胞極化從而改善放射誘導(dǎo)的口腔黏膜炎癥尚不明確。本研究于2021年7月至2022年4月以SD大鼠為研究對象，通過體外照射模擬急性ROM，探討康復(fù)新液對大鼠急性ROM的防治效果及對巨噬細(xì)胞極化的影響，旨在為臨床用藥提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 SD大鼠54只，雌性，SPF級，周齡范圍6～8周，體質(zhì)量（200±20）g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，使用許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。試驗(yàn)前常規(guī)飼喂5 d，降低應(yīng)激反應(yīng)。飼養(yǎng)條件：自由進(jìn)食水，溫度22 ℃，濕度范圍45%～55%，自然光照。將大鼠用苦味酸進(jìn)行體表標(biāo)記后使用隨機(jī)數(shù)字表法分成對照組、照射組和給藥組，每組各18只。給藥組［9］：康復(fù)新液5 mL/kg，分3次滴入左側(cè)頰黏膜，可咽下，間隔2 h，每次給藥后禁食、禁水30 min，從照射第1天開始連續(xù)給藥21 d。照射組與對照組：等量生理鹽水，用法同給藥組。本研究符合一般動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 主要試藥及儀器 康復(fù)新液（四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號B190219）；細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-10及轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）ELISA試劑盒（PeproTech公司）；大鼠單抗CD86、山羊多抗CD206（Santa Ctuz）；Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG、異硫氰酸熒光素標(biāo)記驢抗山羊IgG（Jackson ImmunoResearch公司）；Thunderbird Sybr qPCR Mix試劑盒（TOYOBO公司）；Trizol（invitrogen公司）；RevertAID-TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Fermentas公司）；放療定位機(jī)（GE公司）；直線加速器（瓦里安公司）；紫外分光光度計(jì)（Nanodrop公司）；生物顯微鏡（OLYMPUS公司）；PCR儀（BIO-RAD公司）。

1.3 模型制作［10］使用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定于治療床，用自制鉛防護(hù)罩撐開大鼠口腔暴露頰黏膜，鉛皮遮擋頭部及身體其他部位。定位大鼠左側(cè)頰黏膜，源皮距=100.0 cm，射野大小1.5 cm×1.5 cm。采用6MV-X射線單次大劑量（30 Gy）照射，劑量率200 Gy/min。每次照射9只，分4次照射單純照射組和給藥組大鼠共36只。造模期間大鼠未出現(xiàn)身體扭動，照射后未出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、抽搐、提尾時(shí)身體旋轉(zhuǎn)反射及截癱等體征。

1.4 HE染色 照射后第5、14、21天用頸椎脫臼法處死大鼠，每次各組處置6只，剝離左側(cè)頰黏膜，置于-80 ℃冰箱備用。將大鼠頰黏膜組織置于4%甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋、連續(xù)切片、HE染色，顯微鏡觀察病理形態(tài)并采集圖像。

1.5 免疫熒光法檢測巨噬細(xì)胞CD86/Ibal和CD206/Ibal表達(dá) 將包埋好的黏膜組織進(jìn)行切片、破膜、滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，分別加入CD86/Ibal（200∶1）、CD206/Ibal（100∶1），4 ℃孵育過夜，加入Cy3標(biāo)記山羊抗鼠/驢抗兔和異硫氰酸熒光素標(biāo)記山羊抗兔/驢抗山羊二抗（1∶100）室溫孵育0.5 h，最后進(jìn)行封片。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)，每張切片選擇4個(gè)不重復(fù)的視野，取平均值。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測頰黏膜組織細(xì)胞因子 取照射后第14天大鼠頰黏膜組織，用生理鹽水浸泡、清洗干凈，加入兩倍的生理鹽水，置于勻漿器中充分勻漿。離心后取上清液用于細(xì)胞因子檢測。細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、TGF-β及IL-10檢測嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書要求在酶標(biāo)儀中進(jìn)行操作，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣本中細(xì)胞因子水平。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測M1和M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物基因表達(dá) 取照射后第14天頰黏膜組織進(jìn)行RT-PCR。用1 mLTrizol抽提50 mg總RNA，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量及純度測定（A260/A280=1.6～1.8），取0.5 μg總RNA行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。取1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR，反應(yīng)體系：2×Sybr qPCR Mixture 5 μL，各基因?qū)?yīng)正反向引物各1 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free water 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性3 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：β-肌動蛋白（β-actin）正向引物5'-CTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3'，反向引物5'-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3'；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）正向引物5'-GTGAAGGGACTGAGCTGTTAGA-3'，反向引物5'-GCACTTCTGCTCCAAATCCA-3'；共刺激分子CD86正向引物5'-GAGAAGACCCAATGCCACC-3'，反向引物5'-TGCCCATCACGACAGGAA-3'；精氨酸酶1（Arginase 1，Arg1）正向引物5'-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3'，反向引物5'-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3'；CD206正向引物5'-GGGTTCACCTGGAGTGATGG-3'，反向引物5'-ATTGTCTTGAGGAGCGGGTG-3'。應(yīng)用2-ΔΔCt法［11］計(jì)算各基因相對β-actin的表達(dá)量。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá) 將大鼠頰黏膜組織剪碎，加入適量裂解液進(jìn)行勻漿裂解，離心后取上清液，參照BCA法測定蛋白濃度。20 μg蛋白煮沸后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液浸泡NC膜，室溫?fù)u床封閉1.5 h。加入一抗4 ℃過夜，TBST溶液洗膜3次，加入倍比稀釋的二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，ECL顯色曝光，掃描膠片并保存。使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參照，并計(jì)算與β-actin的比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠一般情況比較 實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均存活，照射組和給藥組大鼠可見口鼻部皮膚脫毛改變。對照組飲水、進(jìn)食量無變化，體質(zhì)量增加；照射組照射后第4～9天飲水、進(jìn)食量減少，體質(zhì)量下降，第15天以后飲水、進(jìn)食量恢復(fù)，體質(zhì)量增加；給藥組照射后第7～10天飲水、進(jìn)食量減少，體質(zhì)量下降，第11天以后飲水、進(jìn)食量恢復(fù)，體質(zhì)量回升。

2.2 三組大鼠病理觀察比較 對照組：上皮完整，層次清晰，基底層緊密排列，黏膜下層無炎細(xì)胞浸潤。單純照射組：第5天見假膜形成，上皮結(jié)構(gòu)破壞，固有層見膠原水腫，黏膜下層見炎細(xì)胞；第14天上皮脫落、崩解、潰瘍，黏膜下層毛細(xì)血管擴(kuò)張，大量炎細(xì)胞浸潤；第21天上皮結(jié)構(gòu)破壞，黏膜下見大量炎細(xì)胞、新生血管和成纖維細(xì)胞。給藥組：上皮結(jié)構(gòu)尚完整，層次清晰；第5天見少許炎細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張；第14天炎性細(xì)胞增多，血管充血加重，見少量膠原纖維；第21天炎癥消退，成纖維細(xì)胞增生，見大量新生血管和纖維組織。

2.3 康復(fù)新液對大鼠頰黏膜組織炎性因子的影響 由病理觀察可知，照射后第14天大鼠頰黏膜組織損傷最為嚴(yán)重，與李春陽等［12］結(jié)論高度吻合，因此本研究選擇照射后第14天作為主要觀測時(shí)點(diǎn)。與對照組比較，照射組和給藥組大鼠頰黏膜組織促炎因子IL-6和TNF-α水平顯著升高（P＜0.001），抗炎因子TGF-β和IL-10水平也明顯升高（P＜0.001）；與照射組比較，給藥組大鼠頰黏膜組織IL-6和TNF-α水平明顯下降（P＜0.001），而TGF-β及IL-10水平則顯著升高（P＜0.001），見表1。

表1 各組大鼠頰黏膜組織IL-6、TNF-α、TGF-β及IL-10水平比較/（μg/L，）

表1 各組大鼠頰黏膜組織IL-6、TNF-α、TGF-β及IL-10水平比較/（μg/L，）

注：IL為白細(xì)胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子-β。①與對照組相比，P＜0.05。②與照射組相比，P＜0.05。

IL-10 0.58±0.08 0.96±0.14①1.44±0.21①②47.69＜0.001組別對照組照射組給藥組F值P值鼠數(shù)6 6 6 IL-6 0.46±0.04 1.12±0.16①0.74±0.08①②58.79＜0.001 TNF-α 0.12±0.02 0.68±0.10①0.34±0.06①②102.34＜0.001 TGF-β 0.32±0.06 0.75±0.12①1.26±0.20①②68.72＜0.001

2.4 康復(fù)新液對巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)影響 免疫熒光雙標(biāo)記試驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組中未見CD86/Ibal陽性細(xì)胞，照射組CD86/Ibal陽性細(xì)胞數(shù)為（152.54±6.95），給藥組CD86/Ibal陽性細(xì)胞數(shù)為（99.51±3.61），ANOVA分析顯示各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對照組中無CD206/Ibal陽性細(xì)胞，照射組中CD206/Ibal陽性細(xì)胞數(shù)為（88.26±3.10），給藥組CD206/Ibal陽性細(xì)胞數(shù)為（129.99±2.61），ANOVA分析顯示各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.5 康復(fù)新液調(diào)控巨噬細(xì)胞極性變化 與對照組比較，照射組和給藥組大鼠頰黏膜組織iNOS、CD86、Arg1和CD206 mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.001）。與照射組比較，給藥組大鼠頰黏膜組織iNOS和CD86 mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.001），而Arg1和CD206 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.001）。見表2。蛋白印跡法質(zhì)結(jié)果顯示，照射組和給藥組大鼠頰黏膜組織iNOS、CD86、Arg1和CD206蛋白表達(dá)水平較空白對照組均顯著升高（P＜0.001）。與照射組比較，給藥組大鼠頰黏膜組織iNOS和CD86蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.001），Arg1和CD206蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001）。見圖1。

圖1 三組大鼠頰黏膜組織蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

表2 各組大鼠頰黏膜組織iNOS、CD86、Arg1與CD206 mRNA 表達(dá)水平比較/

表2 各組大鼠頰黏膜組織iNOS、CD86、Arg1與CD206 mRNA 表達(dá)水平比較/

注：iNOS為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，CD86為共刺激分子86，Arg1為精氨酸酶1，CD206為共刺激分子206。①與對照組相比，P＜0.05。②與照射組相比，P＜0.05。

組別對照組照射組給藥組F值P值CD206 0.004 23±0.000 38 0.006 82±0.000 56①0.008 24±0.000 86①②62.14＜0.001鼠數(shù)6 6 6 iNOS 0.004 43±0.000 25 0.006 82±0.000 41①0.005 94±0.000 38①②70.13＜0.001 CD86 0.003 42±0.000 20 0.005 84±0.000 43①0.004 22±0.000 35①②78.76＜0.001 Arg1 0.004 24±0.000 16 0.005 20±0.000 55①0.006 61±0.000 53①②42.00＜0.001

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為放射線為火熱毒邪，急性ROM的基本病機(jī)為熱毒傷陰，臨床多見陰虛津虧證，兼見熱證、氣滯血瘀等證，治療以養(yǎng)陰潤燥、清熱解毒及涼血化瘀等為原則［13-15］?？祻?fù)新液是美洲大蠊的乙醇提取物，為純中藥制劑，具有解毒消腫、養(yǎng)陰生肌、通利血脈等功效［16］，防治急性ROM符合“熱毒傷陰”的病機(jī)。本研究中，單次大劑量照射后照射組和給藥組大鼠均出現(xiàn)飲食量、進(jìn)水量減少及體質(zhì)量下降等改變，病理觀察可見頰黏膜急性炎性病變，提示造模成功。與對照組比較，給藥組大鼠飲食量、進(jìn)水量減少及體質(zhì)量下降的程度較輕且時(shí)間相對滯后，HE染色可見頰黏膜病理損傷較輕。表明康復(fù)新液能改善急性ROM大鼠的一般情況，減輕頰黏膜炎癥。

目前，急性ROM的病理機(jī)制尚未完全闡明。根據(jù)Sonis［17-18］理論，炎性反應(yīng)幾乎貫穿急性ROM的始終，由巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子在此過程中起著關(guān)鍵作用。促炎因子IL-6和TNF-α等與口腔黏膜損傷程度呈正相關(guān)，而抗炎因子IL-10和TGF-β可抑制過度的炎性反應(yīng)，對口腔黏膜具有保護(hù)作用［19-21］。筆者研究發(fā)現(xiàn)，照射后照射組和給藥組大鼠頰黏膜組織IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β水平均顯著升高，病理切片見不同程度的炎性改變，表明促炎因子與抗炎因子共同參與大鼠急性ROM。給予康復(fù)新液治療后大鼠頰黏膜炎癥明顯減輕，IL-6和TNF-α水平顯著下降，而IL-10和TGF-β水平明顯升高。提示康復(fù)新液防治大鼠急性ROM可能與抑制促炎因子，促進(jìn)抗炎因子分泌相關(guān)。

巨噬細(xì)胞廣泛分布于口腔黏膜，在不同環(huán)境因素刺激下可分化出不同表型，表現(xiàn)出功能上的差異，這種現(xiàn)象被稱為極化［22］。活化的巨噬細(xì)胞可極化為M1和M2兩種表型。巨噬細(xì)胞的極化現(xiàn)象可看作細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的改變，如M1型巨噬細(xì)胞可高表達(dá)共刺激分子CD86及特異性標(biāo)志物iNOS，承擔(dān)促炎功能，并分泌大量的促炎因子如IL-6和TNF-α等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)共刺激分子CD206及特異性標(biāo)志物Arg1，產(chǎn)生抗炎因子如IL-10和TGF-β等，發(fā)揮抗炎作用，并參與修復(fù)損傷組織［23-25］。本研究顯示，康復(fù)新液可抑制大鼠頰黏膜組織M1型巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物iNOS和CD86蛋白和mRNA表達(dá)，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物Arg1和CD206蛋白和mRNA表達(dá)。免疫熒光試驗(yàn)顯示，康復(fù)新液可減少大鼠頰黏膜組織M1型（CD86陽性）巨噬細(xì)胞數(shù)量，增加M2型（CD206陽性）巨噬細(xì)胞數(shù)量，提示康復(fù)新液可抑制巨噬細(xì)胞M1極化，促進(jìn)M2極化。

綜上所述，康復(fù)新液對大鼠急性ROM有較好的防護(hù)作用，可改善大鼠的一般情況，減輕口腔黏膜炎癥。推測康復(fù)新液的放射防護(hù)作用可能與抑制大鼠頰黏膜組織中巨噬細(xì)胞M1極化，促進(jìn)M2極化，從而下調(diào)促炎因子IL-6和TNF-α，促進(jìn)抗炎因子TGF-β和IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)相關(guān)。急性ROM的機(jī)制極其復(fù)雜，康復(fù)新液防治大鼠急性ROM的確切機(jī)制及本試驗(yàn)數(shù)據(jù)的合理性有待進(jìn)一步深入研究。