曾慶躍 徐嬌 施奕 牟钘雨 李雙慶

(四川大學(xué)華西醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,四川 成都 610041)

在世界范圍,心臟疾病是主要的致死原因。許多類型的心臟疾病,例如心肌梗死、壓力負(fù)荷性心肌病等,導(dǎo)致了不可逆轉(zhuǎn)的心肌細胞死亡。在心肌細胞直接重編程中,許多心臟發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是各種編程方案的基石。目前許多組合被用于心肌細胞直接重編程。希望通過以闡述心臟發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)容為基礎(chǔ),從而更好地明白直接重編程的方案構(gòu)成,甚至進一步創(chuàng)造新型的、更高效的編程方案,最終實現(xiàn)心臟再生,逆轉(zhuǎn)心力衰竭。

1 心臟發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子

在心臟的發(fā)育過程中,不同的信號通路及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與其中,從而形成了復(fù)雜的心臟結(jié)構(gòu)。在心臟發(fā)育的早期階段,心臟多能祖細胞來源于心臟中胚層。轉(zhuǎn)錄因子Mesp1是這些心臟祖細胞最早的標(biāo)志[1],這些心臟祖細胞在不同的時間點形成兩個心臟祖細胞區(qū)域,稱為第一心區(qū)和第二心區(qū)。第一心區(qū)的心臟祖細胞向前側(cè)遷移構(gòu)成心臟新月體,并分化形成左心室、部分室間隔、部分心房及小部分的右心室;第二心區(qū)形成了大部分的右心室、流入和流出道及部分心房[2]。值得注意的是,在第二心區(qū)的一部分區(qū)域(被命名為前心區(qū)),這里有以轉(zhuǎn)錄因子Mef2c活躍表達作為標(biāo)志的心臟祖細胞,通過表達N-鈣黏蛋白與經(jīng)典的Wnt信號通路相互作用[3],這部分心臟祖細胞具有多向分化潛能。第一心區(qū)和第二心區(qū)具有許多不同但又相互重疊的轉(zhuǎn)錄因子表達譜。二者共同表達了轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和Gata,第一心區(qū)額外表達了Tbx5等轉(zhuǎn)錄因子,而第二心區(qū)額外表達了Mef2c和Isl1等轉(zhuǎn)錄因子[4]。其實,上述轉(zhuǎn)錄因子在其他細胞中也有表達,如轉(zhuǎn)錄因子Isl1也在早期的心臟祖細胞中有所表達。所以,并不是單一的轉(zhuǎn)錄因子決定了細胞的分化,而是不同的轉(zhuǎn)錄因子組合決定了細胞的分化命運。在心臟的發(fā)育過程中,許多轉(zhuǎn)錄因子至關(guān)重要。

Mef2是MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族的一員。在脊椎動物中Mef2家族有4個成員,分別為:Mef2a、Mef2b、Mef2c、Mef2d。Mef2b和Mef2c是首先表達的Mef2亞型,出現(xiàn)在心臟中胚層時期;Mef2a和Mef2d在線性心管時期表達。其中Mef2c對于心肌收縮蛋白基因表達及第二心區(qū)的正常形成至關(guān)重要。在Mef2c無效突變純合子小鼠中,心肌收縮的相關(guān)蛋白沒有形成,心管及右心室結(jié)構(gòu)也不完整[4]。

Hand1和Hand2是螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。Hand2在流出道、心外膜、心瓣膜祖細胞、右心室的大部分區(qū)域表達;然而Hand1在大部分的左心室區(qū)域表達。去除Hand2會導(dǎo)致右心室嚴(yán)重發(fā)育不全[5]。實際上,右心室區(qū)域的Mef2c缺失突變與Hand2表達的下調(diào)有相關(guān)性,所以Hand2與許多參與心臟發(fā)育基因的非編碼區(qū)有廣泛的交互作用。

Gata4在心臟祖細胞、心肌細胞、心內(nèi)膜細胞、心外膜細胞都有所表達。它對于心肌細胞的分裂、心內(nèi)膜墊的形成、右心室的發(fā)育及流出道分割具有重要的作用[6]。Gata4在心臟的表觀遺傳方面也具有調(diào)節(jié)作用。Gata4結(jié)合并促進H3k27ac的沉積進而活化了心臟發(fā)育的相關(guān)基因[7]。

Isl1是具有LIM結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。Isl1能夠作為第二心區(qū)心臟祖細胞的標(biāo)志[8]。在右心室、流出道、房間隔、竇房結(jié)、房室結(jié)等處也可見Isl1的表達。表達Isl1的心臟祖細胞具有分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞的多分化潛能。通過目前的基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),Isl1的下游調(diào)控分子包括一些重要轉(zhuǎn)錄因子:Mef2、Hand2、Gata4等;但有關(guān)Isl1的上游調(diào)控分子還是不清楚,可能的分子是Nkx2.5等[9]。

Tbx5屬于T-box家族的轉(zhuǎn)錄因子。Tbx5被發(fā)現(xiàn)表達在左心室的心肌細胞中,而對于第二心區(qū)來說,Tbx5在第二心區(qū)的后面部分細胞(發(fā)育為心房)中有所表達[10]。在2009年Takeuchi等[11]通過Gata4、Baf60c和Tbx5的異位表達,實現(xiàn)了轉(zhuǎn)化小鼠中胚層細胞為能收縮的心肌細胞,他們提到在中胚層Tbx5抑制非心肌基因(例如成纖維細胞相關(guān)基因)表達從而促進中胚層細胞向心肌細胞分化。

Nkx2.5屬于homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族。Nkx2.5被發(fā)現(xiàn)表達在心臟新月體階段,具有管理心肌細胞分化的作用。Nkx2.5被敲除后,小鼠胚胎死于嚴(yán)重的心臟發(fā)育不全[12]。相較于第一心區(qū),Nkx2.5在第二心區(qū)的心肌祖細胞中表達水平更低;同時,Nkx2.5表達水平的不同及與其他轉(zhuǎn)錄因子的不同組合可能會導(dǎo)致不同的結(jié)果。在第二心區(qū)的心肌祖細胞中,Nkx2.5連同轉(zhuǎn)錄因子Foxh1能夠促進分裂增殖和激活成纖維細胞生長因子-10、Mef2c的表達;然而在第一心區(qū),Nkx2.5抑制成纖維細胞生長因子-10和Isl1的表達從而促進誘導(dǎo)心肌細胞(induced cardiomyocytes,iCMs)的分化[13]。

Mesp1是具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。低劑量的Nodal/Smad2/3誘導(dǎo)了T-box轉(zhuǎn)錄因子Eomes的表達進而激活了Mesp1在原腸胚時期的心臟中胚層的表達[14]。表達Mesp1的心肌細胞從原條遷徙出來,然后進入心臟區(qū)域,最后形成了線性心管。Mesp1作為調(diào)節(jié)心臟祖細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,激活了許多促進心肌發(fā)育的重要基因,同時也抑制了中胚層、外胚層細胞的一部分基因,從而實現(xiàn)了對細胞分化命運的調(diào)節(jié)[1]。

在表1中對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及主要表達區(qū)域進行了簡要總結(jié)。

表1 轉(zhuǎn)錄因子及主要表達區(qū)域

2 心肌細胞直接重編程

直接重編程,也稱為轉(zhuǎn)分化,允許從一種體細胞類型直接轉(zhuǎn)換為另一種體細胞類型,而不需要經(jīng)過中間的多能狀態(tài)[15]。通過直接重編程細胞的方法,可以避免腫瘤形成等相關(guān)風(fēng)險[16]。近年來,通過過度表達轉(zhuǎn)錄因子、miRNA或運用小分子化學(xué)物質(zhì),已經(jīng)實現(xiàn)了心肌細胞的直接重編程[17]。對于這方面的內(nèi)容主要從心肌細胞直接重編程方案、培養(yǎng)條件、轉(zhuǎn)運媒介這三方面進行綜述。

2.1 心肌細胞直接重編程方案

2.1.1 轉(zhuǎn)錄因子對重編程方案的優(yōu)化

轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)是第一種心肌細胞直接重編程方法。重編程成纖維細胞形成iCMs至少需要3個轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c、Tbx5(GMT)[18]。但是僅僅利用GMT直接將成纖維細胞轉(zhuǎn)化為iCMs,轉(zhuǎn)化率為0.01%～0.10%,為了提升轉(zhuǎn)化率需要不斷地完善轉(zhuǎn)錄因子的組合,同時也需要對轉(zhuǎn)錄因子的先后順序及濃度(化學(xué)計量學(xué))進行探索。

Tang等[19]通過在人類iCMs和功能性心肌細胞之間進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較,發(fā)現(xiàn)了人類心肌細胞直接重編程的潛在缺失因子Tbx20。Tbx20與GMT協(xié)同作用于心臟收縮相關(guān)的基因增強子上,促進染色質(zhì)結(jié)合,更顯著地激活了靶基因的轉(zhuǎn)錄。由GMT+Tbx20產(chǎn)生的iCMs表現(xiàn)出更頻繁的搏動、鈣振蕩和更高的能量代謝。Wang等[20]測試GMT不同的濃度與順序,發(fā)現(xiàn)Mef2c最先表達且濃度最高時,轉(zhuǎn)化率最高。其中的機制是Mef2c充當(dāng)了后續(xù)轉(zhuǎn)錄因子“領(lǐng)頭羊”的角色,Mef2c結(jié)合到基因組,形成后續(xù)轉(zhuǎn)錄因子的募集位點,這個轉(zhuǎn)錄因子集合體通過重塑染色體結(jié)構(gòu),激活了之前封閉的心肌發(fā)育相關(guān)基因區(qū)域[21],同時沉默了成纖維細胞活躍的增強子區(qū)域。這證明了GMT化學(xué)計量優(yōu)化對于重編程的重要作用。

2.1.2 miRNA對重編程方案的優(yōu)化

miRNA具有更廣泛的表觀遺傳靶點,包括轉(zhuǎn)錄因子和細胞信號通路。心肌細胞高表達的幾種miRNA,如miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499[22],在心臟發(fā)育期間,它們主要在基因翻譯過程中起作用。miRNA和轉(zhuǎn)錄因子的主要機制有所差異。轉(zhuǎn)錄因子與基因結(jié)合并激活。相反,miRNA是抑制劑,這些miRNA靶向附著在mRNA的3’-非翻譯區(qū),抑制其翻譯過程[23]。Baksh等[24]使用miRNA組合(miRNA-1,miRNA-133a,miRNA-208a和miRNA-499)將豬、狗和人的心臟成纖維細胞直接重編程為心肌細胞,這一發(fā)現(xiàn)很有意義,因為驗證了miRNA組合也是人類心肌損傷后心肌再生的一種潛在治療方式,同時也證明了在重編程中成纖維細胞積極抑制心肌細胞基因表達。

同時聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子及miRNA也構(gòu)成了新的重編程方案。在最新的重編程方案中,使用GMT組合及miRNA-133a,在人體成纖維細胞中進行重編程[25]。最終,iCMs可在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的兩周內(nèi)以40%～60%的效率獲得并呈現(xiàn)出心肌細胞特征。

2.1.3 小分子化合物對重編程方案的優(yōu)化

雖然轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的應(yīng)用取得了顯著的成功,但在安全、效率和技術(shù)方面仍舊存在缺陷[26]。

最近,研究人員使用小分子化合物重新編程心肌細胞,這便可以減少基因相關(guān)操作。這些化合物調(diào)節(jié)表觀遺傳酶、信號通路、代謝和轉(zhuǎn)錄。僅用轉(zhuǎn)錄因子Oct4和化合物便能促進小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化為心肌細胞[27];其他研究人員在沒有任何轉(zhuǎn)錄因子的情況下,僅使用小分子化合物CHIR99021、RepSox、Forskolin、VPA、Parnate、TTNPB和DZnep,成功地將小鼠胚胎和人類成纖維細胞轉(zhuǎn)化為了心肌細胞,這些iCMs表達所有心肌細胞特異性標(biāo)志物,同時具有典型的肌節(jié)結(jié)構(gòu)、電生理活性及鈣振蕩活性[28]。

2.2 培養(yǎng)條件

與體內(nèi)相似的微環(huán)境特性,如細胞因子、機械生物學(xué)等,都可以影響細胞的分化命運。

2.2.1 細胞因子

培養(yǎng)條件極大地影響重編程效率。在過去的十年中,許多細胞因子(轉(zhuǎn)化生長因子-β和Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶)[29]、信號通路(Akt1和Notch)[30]和生長因子(成纖維細胞生長因子-2、成纖維細胞生長因子-10和血管內(nèi)皮生長因子)已被報道可提高重編程效率。最近的證據(jù)表明,環(huán)磷酸腺苷在心肌細胞直接重編程中具有重要作用。抑制cAMP/PKA/CREB通路可以保持成纖維細胞的可塑性,使iCMs的效率提高1.46倍[31]。

2.2.2 機械生物學(xué)

在心肌細胞直接重編程的機械生物學(xué)方面,最近的一項研究[32]發(fā)現(xiàn),介質(zhì)剛性可通過YAP/TAZ信號通路作為機械轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子影響重編程結(jié)果。低介質(zhì)剛性的培養(yǎng)系統(tǒng)(約8 kPa)通過抑制YAP/TAZ信號通路,將重編程效率提高15%[32]。這一發(fā)現(xiàn)可能會顯著影響心肌細胞直接重編程的研究,因為大多數(shù)離體研究都是在高介質(zhì)剛性的硬質(zhì)聚苯乙烯盤中進行的[33]。

另一項研究[34]開發(fā)了一種模擬心肌細胞電刺激的培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)由納米多孔的薄膜構(gòu)成。研究人員使用Gata4、Mef2c、Tbx5、Hand2和Nkx2.5轉(zhuǎn)錄因子組合進行重編程,轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞被放置于膜上,接受與內(nèi)源性心臟電活動相似的,頻率為5 Hz、電壓為1 V持續(xù)5 ms的雙向電刺激。隨后,膜被放入心肌細胞培養(yǎng)物上,保持電刺激。相比于普通培養(yǎng)系統(tǒng),該系統(tǒng)產(chǎn)生了更多的心肌細胞。

新興的研究探索了三維微環(huán)境對重編程效率的影響。在2016年,Li等[35]開發(fā)了三維水凝膠環(huán)境進行重編程,與對照組相比,重編程效率增強20倍。作者認(rèn)為,在3D培養(yǎng)基中,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-3和MMP-8的上調(diào)參與了成纖維細胞預(yù)處理過程,并提高了重編程效率。在最新研究中,Paoletti等[36]通過培養(yǎng)成人心臟成纖維細胞21 d后,繼續(xù)于3D生物基質(zhì)包被的水凝膠中培養(yǎng),成功開發(fā)了用于心肌細胞直接重編程的3D生物基質(zhì)。心肌相關(guān)基因(TNNT2、MYL7、SCN5A、ACTC1和CACNA1C)的整體表達在3D生物基質(zhì)包被水凝膠中很高,分別在50%和32%的重編程細胞中觀察到心肌肌鈣蛋白T陽性和鈣振蕩。這些結(jié)果表明,三維微環(huán)境提高了直接重編程的轉(zhuǎn)化率。

因此,培養(yǎng)微環(huán)境不僅可以影響成纖維細胞到心肌細胞的分化數(shù)量,還可以影響其分化質(zhì)量。

2.3 轉(zhuǎn)運媒介

目前的重編程方法僅限于病毒轉(zhuǎn)導(dǎo),這種方法含有基因整合所致的過度表達的風(fēng)險,這會導(dǎo)致腫瘤的形成。囊泡、納米粒子等轉(zhuǎn)運方案可能替代病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。

在最近的一項研究中,Kim等[37]將兩種小分子與來源于正在進行心臟分化的胚胎干細胞的囊泡結(jié)合進行重編程。與傳統(tǒng)病毒和小分子方法相比,將兩個小分子(CHIR99021和SB431542)和生長因子(堿性成纖維細胞生長因子和成纖維細胞生長因子-10)與細胞外囊泡合并,效率提高了3倍,功能提高了7倍。因此,小分子與細胞外囊泡的結(jié)合在提高轉(zhuǎn)化率方面具有重要的潛力。

Chang等[38]使用聚乙烯亞胺共軛的陽離子金納米粒子作為GMT的載體,成功地實現(xiàn)了iCMs的形成,提升了編程效率及受損心肌的修復(fù)面積,減輕了心肌的瘢痕程度。該方法減低了細胞毒性及DNA整合風(fēng)險。Wang等[39]用FH-肽修飾的中性粒細胞模擬膜去覆蓋介孔二氧化硅納米粒子,作為miRNA組合(miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499)的載體進行重編程。利用中性粒細胞膜的炎癥歸巢特性和FH-肽對于心肌成纖維細胞產(chǎn)生的腱糖蛋白-C的高度親和性,實現(xiàn)對受損心臟的成纖維細胞進行靶向的編程分子導(dǎo)入。安全、靶向地實現(xiàn)了重編程,提升了心臟功能且減少了瘢痕組織的形成。

3 小結(jié)

本篇綜述基于心臟發(fā)育中一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子作為基礎(chǔ)來講述心肌細胞直接重編程。從重編程的發(fā)展中,筆者明白不是單一的轉(zhuǎn)錄因子充當(dāng)了轉(zhuǎn)分化的“開關(guān)”,而是相互協(xié)同的分子網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)了直接重編程。

在心肌細胞直接重編程被認(rèn)為是一種可行的治療策略之前,目前還有許多障礙和困難需要克服。(1)心肌細胞直接重編程效率低是一個嚴(yán)重的問題。與誘導(dǎo)多能干細胞相比,經(jīng)歷過重編程的成纖維細胞迅速失去了增殖能力,因此,高效率是至關(guān)重要的。同時,iCMs轉(zhuǎn)換的速度和質(zhì)量必須足夠。據(jù)估計,50%的成纖維細胞必須在轉(zhuǎn)導(dǎo)后5～10 d內(nèi)重新編程為功能性心肌細胞,才能在臨床上改善心肌梗死的狀況。(2)重編程的機制仍舊不清楚。清晰的細胞重編程機制對于提高轉(zhuǎn)化效率至關(guān)重要,許多正在進行的研究正試圖闡明人類和動物模型中細胞重編程的確切分子機制。至少在表觀遺傳水平上,人類和動物模型的不同機制可能與轉(zhuǎn)錄因子化學(xué)計量學(xué)有關(guān),然而,進一步的機制,如表觀遺傳模式、細胞內(nèi)信號及細胞外方面,仍然不清楚[40]。(3)iCMs的不成熟及異質(zhì)性。許多研究觀察到iCMs的收縮力、電生理及肌節(jié)結(jié)構(gòu)的不同,說明每個iCMs的成熟度水平不同。不同電生理性質(zhì)的iCMs可誘發(fā)心律失常的危險[41]。(4)研究范圍相對局限。目前的研究大多集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控上,然而,轉(zhuǎn)錄水平與具體蛋白質(zhì)形成之間還存在許多不同。在心肌細胞直接重編程過程中,蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的動力學(xué)的研究卻很少。蛋白質(zhì)組學(xué)的最新進展已經(jīng)開始描述心肌細胞直接重編程早期階段的蛋白質(zhì)變化特征[42]。

除了基礎(chǔ)研究外,還應(yīng)在動物模型中,特別是利用豬和非人靈長類動物等大型動物,對給藥方法、安全問題和長期效應(yīng)進行優(yōu)化和仔細監(jiān)測。雖然有許多挑戰(zhàn)擺在面前,但進行心肌細胞直接重編程的機會和潛在好處是巨大的。隨著技術(shù)的快速發(fā)展和對心肌細胞直接重編程基礎(chǔ)生物學(xué)的理解,筆者相信這項技術(shù)將會比預(yù)期更快地用于臨床,使心臟疾病患者受益。