劉薇，趙孔發(fā)，張鋒倫，茍仕坤，何銀江，聶韡，馬世宏，單承鶯*

（1.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 211111；2.江蘇省天然香料工程技術(shù)中心，江蘇 南京 211111；3.昭通市大成農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，云南 昭通 657100）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb. et Zucc.）為蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物青花椒的成熟果皮，主產(chǎn)于我國(guó)云貴川等西南地區(qū)［1］。青花椒具有獨(dú)特濃郁的香氣和口感，在我國(guó)被廣泛用作烹飪和食品加工行業(yè)的食品辛香料。同時(shí)，青花椒也在《中國(guó)藥典》中被列為多種中藥方劑中的有效成分，具有溫中止痛的作用，用于治療頭痛、腹痛、牙痛、嘔吐等疾?。?］。青花椒具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其主要含有揮發(fā)油、生物堿、香豆素、類(lèi)黃酮、植物甾體和酰胺類(lèi)化合物［3］。青花椒的香氣來(lái)自于精油成分，主要包含烯醇類(lèi)、酮類(lèi)、烴類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)等揮發(fā)性化合物，這些均與青花椒的品質(zhì)密切相關(guān)［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，不同品種青花椒精油的組成及含量是有差異的，同一品種的青花椒種植在不同地區(qū)，其精油組成和含量會(huì)因這些地區(qū)的海拔、光照、氣候、溫度和濕度等自然條件不同而有所差異［6］?，F(xiàn)代研究表明，青花椒精油還可以對(duì)部分人體致病菌有一定的抑制作用，如大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等［7-9］。

幽門(mén)螺桿菌是一類(lèi)微需氧革蘭陰性菌，可在人體胃酸中生存，是最常見(jiàn)的傳染性病原體之一，全球有50%以上的人口感染，我國(guó)感染人數(shù)超過(guò)6億，并有逐年增加的趨勢(shì)［10-11］。人感染幽門(mén)螺桿菌，可引起多種胃腸道疾病，如胃炎、胃十二指腸潰瘍，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生胃粘膜相關(guān)性淋巴樣惡性瘤及胃癌等消化系統(tǒng)疾病［12-13］。根除幽門(mén)螺桿菌可降低胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，臨床上最多采用的是三聯(lián)、四聯(lián)療法治療幽門(mén)螺桿菌，但由于抗生素濫用及治療方案不規(guī)范等因素，幽門(mén)螺桿菌的耐藥性和致病力逐漸上升，療效也受到很大的影響［14］，因而尋求安全、高效的抗幽門(mén)螺桿菌的抑菌劑新藥對(duì)現(xiàn)在臨床藥學(xué)尤為重要。中西醫(yī)結(jié)合治療提高幽門(mén)螺桿菌的根除率，可改善患者癥狀，目前，已有中藥包括單味藥、復(fù)方制劑、提取物或者單體成分用于抗幽門(mén)螺桿菌的治療，如：姜成等研究了15味中藥抑制幽門(mén)螺桿菌的藥效作用，發(fā)現(xiàn)黃連的藥效最佳［15］。青花椒是一種重要的藥食兩用資源，具有辛辣和芳香氣味，利用的部位為其果實(shí)。迄今，尚未有青花椒精油對(duì)幽門(mén)螺桿菌抑制作用的報(bào)道，因而本文提取青花椒果中的精油，并研究其對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑制效果。

本研究采用水蒸氣蒸餾法提取云南8個(gè)不同產(chǎn)地新鮮的青花椒精油，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）法分析精油中可揮發(fā)性化學(xué)成分。同時(shí)選用濾紙片法測(cè)試青花椒精油對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑菌效果，以期為青花椒資源的品質(zhì)評(píng)價(jià)、品種選擇以及青花椒的綜合利用開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 材料與試劑

新鮮青花椒品種的編號(hào)、名稱(chēng)和采樣地點(diǎn)見(jiàn)表1，將新鮮的青花椒剪去枝葉，得到青花椒果實(shí)。

表1 青花椒品種的編號(hào)、名稱(chēng)和采樣地點(diǎn)Tab.1 Number， name and sampling place of Z. schinifolium

菌株：人類(lèi)胃粘膜活檢標(biāo)本中獲得的幽門(mén)螺桿菌菌株（ATCC 43579），購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心ATCC代理商上海百風(fēng)生物科技有限公司。

試劑：丙酮，分析級(jí)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；腦心浸液肉湯，生化試劑，購(gòu)自北京普納德科技有限公司；瓊脂，試劑級(jí)，購(gòu)自上海生工公司；氯化鈉，分析級(jí)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

精油提取器（上海達(dá)豐玻璃儀器廠）；DZTW電子調(diào)溫電熱套（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；DHG-9143BS-III電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制藥有限公司）；7820A-5975 MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）；PL403電子天平（梅特勒托利多科技有限公司），CH-SQ50B三氣培養(yǎng)箱（杭州川恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；96孔酶標(biāo)板（康寧公司）；60 mm一次性無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿（耐思生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 青花椒精油的提取

稱(chēng)取新鮮青花椒果實(shí)200 g，再按料液比1∶5加蒸餾水放入圓底燒瓶中，然后加熱至產(chǎn)生蒸汽，開(kāi)始計(jì)時(shí)提取精油，提取時(shí)間為1 h。收集精油，將收集的青花椒精油用干燥的NaCl分層除去多余的水分，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 青花椒精油可揮發(fā)成分分析

采用Agilent HP-5氣相毛細(xì)管色譜柱（30 mm ×0.25 mm，0.25 μm）高純度氦氣作為載氣，載氣流速為1.0 mL/min，分流比為120∶1?；ń肪筒捎帽♂?zhuān)♂尡稊?shù)為100倍。進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度設(shè)為250 ℃。采用程序升溫方式進(jìn)行分析：初始溫度為80 ℃，該溫度下保持6 min，接著以8 ℃·min-1的升溫速率將溫度升至180 ℃，維持10 min，然后以10 ℃·min-1的升溫速率將溫度升至250 ℃，維持20 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊式離子源（EI），離子化能量、離子源溫度和接口溫度分別為70 eV、200 ℃和250 ℃，掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍為35 ～ 550 m/z。

2.3 培養(yǎng)基制備

固體培養(yǎng)基由腦心浸液肉湯加瓊脂組成，分別稱(chēng)取腦心浸液肉湯和瓊脂7.7 g和3 g溶于200 mL超純水中，高壓滅菌冷卻，倒平板，備用。保菌液的制備：將腦心浸液肉湯按比例加入30%甘油，高壓滅菌冷卻后，每1 mL分裝于無(wú)菌凍存管中，儲(chǔ)存溫度為-80 ℃，備用［16］。

2.4 抑菌敏感性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法，以生理鹽水（0.9%氯化鈉）為陰性對(duì)照組，腦心浸液肉湯加瓊脂配制固體培養(yǎng)基。用無(wú)菌棉簽蘸取孵育72 h的菌種，制備含菌濃度為1×107～ 1×108cfu/mL的菌懸液。取100 μL菌懸液于平板中，酒精燈旁揮干后，在含菌平板中央放置濾紙片，滴加10 μL不同產(chǎn)地的青花椒精油使其完全浸透（每個(gè)產(chǎn)地的青花椒精油平行三份），用無(wú)菌鑷子輕輕按壓，于三氣培養(yǎng)箱中（O2：5%；CO2：15%；N2：80%）37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，記錄每組紙片的抑菌圈直徑（mm）。

2.5 最低抑菌濃度測(cè)定

采用稀釋擴(kuò)散法，50%無(wú)水乙醇作為陰性對(duì)照組，采用50%無(wú)水乙醇連續(xù)按2倍梯度稀釋青花椒精油濃度為50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg/mL于96孔板中。然后在各孔中加入100 μL的菌懸液，混勻，于三氣培養(yǎng)箱中（O2：5%；CO2：15%；N2：80%）37℃恒溫培養(yǎng)24 h。體式顯微鏡下觀察各孔培養(yǎng)基表面，以孔內(nèi)無(wú)菌生長(zhǎng)為最低抑菌活性濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。采用測(cè)定青花椒精油抑制幽門(mén)螺桿菌的MIC濃度梯度的方法，分別移取100 μL菌懸液于固體平板上，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，無(wú)菌生長(zhǎng)的精油濃度即為最低殺菌濃度（Minimal bactericide concentration， MBC）值。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同產(chǎn)地青花椒品種精油含量分析

經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取的云南8個(gè)不同地區(qū)的青花椒精油呈半透明液體，顏色為淺黃綠色，具有濃郁的青花椒特色香氣。各產(chǎn)地青花椒提取的精油含量見(jiàn)表2，可以發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地青花椒提取的精油含量存在差異。八個(gè)產(chǎn)地青花椒所提取的精油含量從高到低依次為：魯?shù)榍嗷ń?號(hào)、東川青花1號(hào)、東川青花椒2號(hào)、昭通轉(zhuǎn)紅椒、魯?shù)榍嗷ń?號(hào)、紅河青花椒、麗江青花椒、香格里拉青花椒，它們的精油提取率分別為9.8、9.6、9.5、9.0、9.0、7.8、7.0、6.8 mL/100g，平均精油提取率為8.56%。青花椒精油的含量在一定程度上取決于其品種的優(yōu)劣，本文不同產(chǎn)地青花椒提取率比之前文獻(xiàn)報(bào)道采用水蒸氣蒸餾法對(duì)青花椒精油的提取率高［17-18］，說(shuō)明云南這八個(gè)產(chǎn)地的青花椒果質(zhì)量均較好。

表2 不同產(chǎn)地青花椒品種精油含量Tab.2 The essential oil content of Z. schinifolium from different producing areas

3.2 不同產(chǎn)地青花椒品種精油成分分析

采用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析得到8個(gè)產(chǎn)地青花椒提取的精油的總離子流圖（圖1），再利用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)NIST17結(jié)合峰面積歸一化法對(duì)精油中的各個(gè)組分進(jìn)行定性分析和相對(duì)含量的計(jì)算，各個(gè)青花椒中所含的揮發(fā)性組分和相對(duì)含量如表3所示。從8種不同來(lái)源的青花椒精油中共鑒定出44種成分，已鑒定成分的峰面積之和占青花椒精油總峰面積的99%以上，其中不同產(chǎn)地青花椒精油的共有成分3種，分別為芳樟醇、D-檸檬烯和4-萜烯醇，這三種共有成分總相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到85%以上，其中紅河青花椒精油達(dá)92.96%。從圖1看出，8個(gè)產(chǎn)地的青花椒精油的主要峰群的整體圖貌基本一致，具有較高的相似度。但是，青花椒精油成分含量之間依然存在一定差異，如香格里拉青花椒精油和昭通轉(zhuǎn)紅椒精油除了三種共有成分外，水合檜烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較高，分別達(dá)3.43%和4.40%，而其他6種精油中不含該成分。另外魯?shù)榍嗷ń?號(hào)精油、紅河青花椒精油和麗江青花椒精油中含有β-水芹烯，且占比例較高，分別達(dá)8.34%、3.41%和4.57%，其他品種中均未發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)。由表3可知，8個(gè)產(chǎn)地青花椒精油中芳樟醇含量最高，其中紅河青花椒精油中芳樟醇含量達(dá)到87.64%，其他品種青花椒精油中芳樟醇含量也均大于72%。綜上所述，芳樟醇、D-檸檬烯和4-萜烯醇是云南青花椒精油的主要成分，其中芳樟醇含量占比最大，同時(shí)產(chǎn)地差異會(huì)對(duì)青花椒精油的化學(xué)成分產(chǎn)生一定的影響，即使在同一省份，青花椒精油的成分也會(huì)因環(huán)境的影響而有所不同。

圖1 不同產(chǎn)地青花椒精油總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of essential oil of Z. schinifolium from different producing areas

圖2 不同產(chǎn)地青花椒精油抑制幽門(mén)螺桿菌抑菌圈圖Fig.2 Inhibition zone diagram of Helicobacter pylori by essential oil of Z. schinifolium from different producing areas

表3 不同產(chǎn)地青花椒品種精油成分的GC-MS分析結(jié)果Tab.3 GC-MS analysis results of essential oil components in Z. schinifolium from different producing areas

3.3 不同產(chǎn)地青花椒精油對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑制活性分析

不同產(chǎn)地青花椒精油對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，選取不同產(chǎn)地青花椒的3個(gè)平行樣中一個(gè)樣品對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑菌效果作為代表進(jìn)行拍照。

表4 不同產(chǎn)地青花椒精油抑制幽門(mén)螺桿菌效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Experimental results on the inhibition of Helicobacter pylori by essential oil of Z. schinifolium from different producing areas

抑菌圈直徑是判定抗生素敏感性的標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感抑菌；抑菌圈直徑為10 ～ 15 mm屬于中度敏感度抑菌；抑菌圈直徑大小為5 ～ 10 mm屬于低度敏感度抑菌表示抑菌圈直徑小于5 mm或者是未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，無(wú)抑菌效果［19］。根據(jù)敏感度判定標(biāo)準(zhǔn)可以得出，8種產(chǎn)地的青花椒精油均對(duì)幽門(mén)螺桿菌具有高度敏感抑制作用，且抑菌圈的直徑均大于25 mm，其中紅河青花椒精油對(duì)幽門(mén)螺桿菌抑制最強(qiáng)，抑菌圈直徑為33.2 mm。八個(gè)不同產(chǎn)地青花椒精油的芳樟醇含量分別為84.30%、81.53%、72.22%、77.97%、87.64%、85.72%、81.29%和83.32%，其抑菌圈直徑大小平均值分別為31.3、28.2、25.5、26.5、33.2、30.3、27.4、30.3 mm，與芳樟醇含量成正比例關(guān)系，見(jiàn)圖3。芳樟醇為無(wú)色液體，屬于鏈狀萜烯醇類(lèi)，具有鈴蘭香氣。研究發(fā)現(xiàn)，芳樟醇具有多種作用，可以用做香料、除臭劑、抗齲齒劑、抑菌劑等［20］，且具有抗菌殺蟲(chóng)的功效［21］。還有報(bào)道稱(chēng)芳樟醇對(duì)蛋白質(zhì)具有破壞作用，使牛清蛋白熒光產(chǎn)生淬滅，改變牛清蛋白的蛋白質(zhì)構(gòu)象，降低α-螺旋含量［22］，同時(shí)也會(huì)損傷大腸桿菌的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，起到抑菌作用［23］。由此可知，青花椒精油中抑制幽門(mén)螺桿菌的成分很可能與芳樟醇有關(guān)。這8個(gè)產(chǎn)地青花椒精油中紅河青花椒精油中芳樟醇的含量最高，且抑制幽門(mén)螺桿菌的抑菌圈直徑最大，同時(shí)該地所產(chǎn)青花椒具有產(chǎn)量大、質(zhì)量好、精油含量較高等優(yōu)點(diǎn)。故后續(xù)選擇以紅河青花椒精油為原料開(kāi)展幽門(mén)螺桿菌最小抑菌濃度研究。

圖3 不同產(chǎn)地青花椒精油抑菌圈大小與芳樟醇含量對(duì)比圖Fig.3 Comparison of the antibacterial circles and linalool content in essential oil of Z. schinifolium from different producing areas

3.4 MIC和MBC值的測(cè)定

將所選菌種在96孔板中培養(yǎng)之后，通過(guò)孔的澄清度來(lái)判定紅河青花椒精油的最低抑菌濃度，結(jié)果表明紅河青花椒精油對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑制作用較強(qiáng)，MIC為0.20 mg/mL。在MIC的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)平板劃線，得到紅河青花椒精油的最低殺菌濃度MBC為0.39 mg/mL，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 紅河青花椒精油的MBC值Tab.5 MBC values of Z. schinifolium essential oil from Honghe state

4 結(jié)論

4.1 精油提取率

采用水蒸氣蒸餾法提取青花椒精油來(lái)計(jì)算精油得率，由計(jì)算結(jié)果可知，云南不同產(chǎn)地的8份樣品青花椒精油得率不同。羅凱［25］等認(rèn)為精油的含量在一定程度上反映了花椒的品質(zhì)，并且國(guó)家現(xiàn)有青花椒和青花椒加工制品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中就是采用青花椒呈香物質(zhì)（揮發(fā)油）的含量指標(biāo)來(lái)衡量花椒品質(zhì)的。來(lái)自昭通地區(qū)的三份樣品（昭陽(yáng)轉(zhuǎn)紅椒和魯?shù)榍嗷ń?號(hào)、2號(hào)）以及產(chǎn)自昆明市東川區(qū)的兩份樣品精油產(chǎn)率較高，開(kāi)發(fā)價(jià)值較大；其中魯?shù)榍嗷ń?號(hào)精油產(chǎn)率最高為9.8 mL/100g。

4.2 成分分析

云南8個(gè)產(chǎn)地的青花椒精油共鑒別出的44種化合物，共有的3個(gè)已知組分為芳樟醇、D-檸檬烯和4-萜烯醇，其中芳樟醇在所有樣品中相對(duì)含量最高。這三個(gè)共有成分的總相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高達(dá)85%以上，分別為：產(chǎn)地1占90.53%；產(chǎn)地2占86.54%；產(chǎn)地3占83.34%；產(chǎn)地4占85.74%；產(chǎn)地5占91.38%；產(chǎn)地6占90.15%；產(chǎn)地7占87.99%；產(chǎn)地8占88.64%，推測(cè)不同產(chǎn)地的青花椒精油可能因產(chǎn)地的光照、氣候、溫度和濕度影響了這三種組分的比例。

4.3 幽門(mén)螺桿菌抑菌效果

云南8個(gè)產(chǎn)地的青花椒精油均對(duì)幽門(mén)螺桿菌具有高度敏感抑制作用，且抑菌圈的直徑大小均大于25 mm。其中紅河青花椒精油對(duì)幽門(mén)螺桿菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為33.2 mm，最小抑菌濃度為0.20 mg/mL，低于已有研究中荊芥屬植物精油對(duì)幽門(mén)螺桿菌的最小抑菌濃度（MIC90為0.256 mg/mL）［24］，說(shuō)明該地區(qū)的青花椒精油抑制幽門(mén)螺桿菌效果好。

綜上，不同產(chǎn)地青花椒精油的化學(xué)成分存在一定差異，但均有抑制幽門(mén)螺桿菌的作用，且抑制幽門(mén)螺桿菌效果與精油中的芳樟醇含量成正相關(guān)性，由此推測(cè)青花椒精油中抑制幽門(mén)螺桿菌的成分很可能與芳樟醇有關(guān)。該結(jié)論為后期綜合開(kāi)發(fā)利用青花椒精油抑制幽門(mén)螺桿菌提供了理論依據(jù)。