張帥，劉文叢，任珅，王梓，李偉，3*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.梧州學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，廣西 梧州 543002；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

平貝母又名平貝，為百合科植物平貝母（Fritillaria ussuriensisMaxim.）的干燥鱗莖［1］，其性味苦、甘、微寒，歸肺、心經(jīng)，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳的作用。臨床上常用于治療肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咳痰帶血［2-4］。平貝母的主要化學(xué)成分為異甾體類(lèi)生物堿、多糖、腺苷以及揮發(fā)油等［5］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其在降壓、抗癌、抗?jié)?、抗炎、抗氧化等方面?-8］具有非常好的療效。

平貝母與川貝母、浙貝母具有相同或相似的臨床功效［9］，因其市場(chǎng)價(jià)格較其他貝母便宜，因此臨床上常作為其他貝母的替代品。近年來(lái)，平貝母野生種群及數(shù)量明顯減少，市場(chǎng)上主要為栽培品。東北三省作為平貝母的道地產(chǎn)區(qū)［10］，平貝母的產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的90%以上。2020版《中國(guó)藥典》對(duì)浙貝母的含量測(cè)定為貝母素甲和貝母素乙的總量不得少于0.080%。目前，關(guān)于平貝母中總生物堿［11］、貝母素甲及貝母素乙含量檢測(cè)［12］等質(zhì)量方面的研究報(bào)道較少。2020版《中國(guó)藥典》只對(duì)平貝母總生物堿含量進(jìn)行要求，不能精準(zhǔn)地體現(xiàn)其質(zhì)量?jī)?yōu)劣。因此，本研究采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（High performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）法檢測(cè)東北三省平貝母藥材中貝母素甲及貝母素乙的含量，并基于2020版《中國(guó)藥典》對(duì)不同生長(zhǎng)環(huán)境下平貝母中水分、總灰分及醇浸出物進(jìn)行質(zhì)量評(píng)測(cè)，為東北道地藥材平貝母的深度開(kāi)發(fā)利用及質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的完善提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)儀器

Waters e2695高效液相儀（美國(guó)Waters公司）；Waters 2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；SXL-1304馬弗爐（杭州卓馳儀器有限公司）；DSH-50-5電子水分測(cè)定儀［上海越平科學(xué)儀器（蘇州）制造有限公司］；SPECTRO star Nano全波長(zhǎng)掃描式酶標(biāo)儀（德國(guó)BMG LABTECH公司）。

1.2 試劑與藥品

貝母素甲標(biāo)準(zhǔn)品、貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品（ ≥ 99.99 %，成都普思生物科技有限公司）；鄰苯二甲酸氫鉀，分析純（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：877247）；溴百里香酚藍(lán)，分析純（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：76595）；二乙胺、三氯甲烷、乙醇、甲醇均為分析純；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

平貝母樣品共22份，其中產(chǎn)自黑龍江省2份，遼寧省3份，吉林省17份。經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院李偉教授鑒定，樣品均為百合科植物平貝母（Fritillaria ussuriensisMaxim.）的干燥鱗莖，詳細(xì)產(chǎn)地見(jiàn)表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 平貝母中水分的測(cè)定方法

參照2020版《中國(guó)藥典》通則0832第二法，用電子水分測(cè)定儀對(duì)平貝母的水分含量進(jìn)行檢測(cè)［1］。

2.2 平貝母中總灰分的測(cè)定方法

參照2020版《中國(guó)藥典》通則2302，對(duì)平貝母的總灰分含量進(jìn)行檢測(cè)［1］。

2.3 平貝母中醇浸出物的測(cè)定方法

參照2020版《中國(guó)藥典》通則2201，用50 %乙醇作溶劑，采用熱浸法對(duì)平貝母的醇浸出物含量進(jìn)行檢測(cè)［1］。

2.4 平貝母中總生物堿含量的測(cè)定方法

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

參照2020版《中國(guó)藥典》，精確稱(chēng)定5.0 mg貝母素乙，用三氯甲烷溶解，定容至10 mL容量瓶。

2.4.2 待測(cè)樣溶液的制備

精確稱(chēng)取平貝母粉末（過(guò)0.25 mm孔徑篩）2.00 g，置于平底燒瓶?jī)?nèi)，經(jīng)3 mL濃氨水浸潤(rùn)1 h后，加入40 mL三氯甲烷-甲醇（4 ∶ 1）的混合溶液并稱(chēng)定重量。將平底燒瓶置于80 ℃水浴中加熱回流2 h，過(guò)濾，并清洗濾渣，合并濾液，定容至25 mL容量瓶。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 mL至25 mL錐形瓶中，用三氯甲烷補(bǔ)足至10 mL，各精密加入0.2 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5 mL和0.03%溴百里香酚藍(lán)緩沖液2 mL，用酶標(biāo)儀于412 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程Y=2.1365X- 0.0034，R2= 0.9922。

2.4.4 樣品測(cè)定

按照2.4.3中的檢測(cè)方法，測(cè)定樣品的紫外吸光度值，并根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出樣品中總生物堿的含量。

2.5 平貝母中貝母素甲與貝母素乙含量的測(cè)定方法

2.5.1 高效液相色譜條件

Tnature C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-二乙胺 = 70 ∶ 29.97 ∶ 0.03；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；ELSD參數(shù)：漂移管溫度為60 ℃，氣壓40 psi，噴霧器模式為加熱，動(dòng)力級(jí)別60%。以貝母素甲峰計(jì)，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2000，貝母素甲和貝母素乙與其他物質(zhì)的分離度應(yīng)大于1.5。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

用三氯甲烷配制0.2 mg/mL的貝母素甲和0.15 mg/mL的貝母素乙混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.5.3 待測(cè)樣溶液制備

精確稱(chēng)取平貝母粉末（過(guò)0.25 mm孔徑篩）2.00 g，置于平底燒瓶?jī)?nèi)，經(jīng)3 mL濃氨水浸潤(rùn)1 h后，加入40 mL三氯甲烷-甲醇（4 ∶ 1）的混合溶液并稱(chēng)定重量。將平底燒瓶置于80 ℃水浴中加熱回流2 h，待冷卻后稱(chēng)定重量，補(bǔ)足減失的重量，經(jīng)過(guò)濾后收集濾液。取濾液10 mL，置于蒸發(fā)皿中蒸干并用甲醇溶解，定容至2 mL容量瓶中，加甲醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，即得。

2.5.4 精密度試驗(yàn)

取2.5.2中貝母素甲和貝母素乙混標(biāo)的任一濃度，按照2.5.1中色譜條件吸取20 μL，進(jìn)行高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別記錄它們的峰面積變化情況，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。

2.5.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精確吸取2.5.2中任一濃度貝母素甲和貝母素乙的混標(biāo)溶液6份，根據(jù)2.5.1中色譜條件，進(jìn)行HPLC分析，記錄混標(biāo)中貝母素甲和貝母素乙的峰面積，并計(jì)算RSD值。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照2.5.1中方法，在混標(biāo)相同濃度情況下，分別在0、2、4、6、8、10、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄混標(biāo)中貝母素甲和貝母素乙的峰面積，并計(jì)算RSD值。

2.5.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精確吸取2.5.3中的任一平貝母樣品溶液，共6份，均分別加入一定量的上述貝母素甲和貝母素乙的混標(biāo)，按照2.5.1中色譜條件，利用HPLC分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加樣回收率及RSD值。

2.5.8 線性關(guān)系考察

按2.5.1中方法將貝母素甲和貝母素乙的混標(biāo)溶液注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量分別為5、10、15、20、25 μL，并記錄各峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 平貝母中水分檢測(cè)

測(cè)定了22份不同產(chǎn)地平貝母樣品的水分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定，平貝母中水分不得超過(guò)15.0%，實(shí)驗(yàn)中所有樣品的水分含量均在藥典要求范圍內(nèi)，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表2 不同產(chǎn)地平貝母樣品中水分、總灰分及醇浸出物的含量Tab.2 The content of the moisture， total ash and alcohol extract in F. ussuriensis samples from different origins

3.2 平貝母中總灰分檢測(cè)

測(cè)定了22份不同產(chǎn)地平貝母樣品的總灰分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定，平貝母中總灰分不得超過(guò)4.0%，實(shí)驗(yàn)中所有樣品的水分含量均在藥典要求范圍內(nèi)，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 平貝母中醇浸出物含量檢測(cè)

測(cè)定了22份不同產(chǎn)地平貝母樣品的醇浸出物含量，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定，醇浸出物不得少于8.0%，實(shí)驗(yàn)中所有樣品的醇浸出物含量均在藥典要求范圍內(nèi)，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。不同地區(qū)平貝母的醇浸出物含量存在一定的差異，含量在9.5% ～ 28.0%之間，部分產(chǎn)地平貝母的醇浸出物含量高于藥典要求2倍以上。大部分吉林省產(chǎn)平貝母醇浸出物含量高于遼寧省和黑龍江省產(chǎn)平貝母醇浸出物含量。

3.4 平貝母中總生物堿含量檢測(cè)

共測(cè)定22份不同產(chǎn)地的平貝母樣品中總生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定，總生物堿含量以貝母素乙（C27H43NO3）計(jì)，不得少于0.050%。檢測(cè)的所有樣品均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，其中2號(hào)樣品、6號(hào)樣品、11號(hào)樣品、16號(hào)樣品總生物堿含量高于0.100%，以6號(hào)樣品總生物堿含量最高，達(dá)到0.159%。與HPLC-ELSD檢測(cè)的貝母素甲和貝母素乙含量結(jié)果大致類(lèi)似，3號(hào)、6號(hào)、10號(hào)、22號(hào)產(chǎn)地平貝母的總生物堿含量較高，4號(hào)、21號(hào)產(chǎn)地平貝母的總生物堿含量較低。但是也存在貝母素甲和貝母素乙含量與總生物堿含量趨勢(shì)不一致的情況，如13號(hào)和16號(hào)產(chǎn)地平貝母。

圖1 不同產(chǎn)地22份平貝母樣品中總生物堿的含量Fig.1 The content of total alkaloids in 22 samples of F. ussuriensis from different origins

3.5 貝母素甲與貝母素乙含量檢測(cè)

貝母素甲的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 239124X- 722579，R2= 0.991，貝母素乙的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 167161X-524813，R2= 0.990。其重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中RSD值分別為0.48%、0.32%和0.41%，貝母素甲和貝母素乙的對(duì)照品加樣回收率分別為98.3%和99.1%，其RSD值分別為1.60%和1.30%。說(shuō)明該方法可用于平貝母中貝母素甲和貝母素乙的含量檢測(cè)，其穩(wěn)定性良好。

平貝母中貝母素甲與貝母素乙含量檢測(cè)結(jié)果如圖2和表3所示。22份平貝母樣品中，大部分產(chǎn)地樣品中貝母素甲的含量高于貝母素乙，且兩者的含量均較低。各樣品之間的含量差異較大，3號(hào)樣品、6號(hào)樣品、13號(hào)樣品的貝母素甲和貝母素乙總量較高，均在0.005%以上，其中6號(hào)樣品的貝母素甲和貝母素乙總量最高，達(dá)到0.011%。1號(hào)樣品、2號(hào)樣品、14號(hào)樣品的貝母素甲和貝母素乙總量較低，其中1號(hào)樣品貝母素甲和貝母素乙總量最低，只有0.0018%。

圖2 HPLC檢測(cè)平貝母樣品中貝母素甲與貝母素乙Fig.2 Determination of peimine and peiminine in a sample of Fritillaria Ussuriensis Maxim. by HPLC

表3 不同產(chǎn)地平貝母中貝母素甲和貝母素乙的含量Tab.3 The content of peimine and peiminine in F. ussuriensis from different origins

3.6 聚類(lèi)分析

為了進(jìn)一步分析22份平貝母樣品之間的成分差異，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同產(chǎn)地平貝母樣品的聚類(lèi)分析Fig.3 Cluster analysis of F. ussuriensis samples from different origins

以貝母素甲、貝母素乙和總生物堿含量為變量。當(dāng)分類(lèi)距離為10時(shí)，2批平貝母樣品大致分為3類(lèi)，當(dāng)分類(lèi)距離為5時(shí)，2批平貝母樣品大致分為4類(lèi)。說(shuō)明東北三省樣品具有一定的相似性，各地之間存在一定的差異。

4 討論

貝母素甲和貝母素乙作為平貝母的次生代謝產(chǎn)物，可以很好地反映平貝母的質(zhì)量［13］。藥材的含水量過(guò)多，會(huì)影響藥材的品質(zhì)，導(dǎo)致蟲(chóng)蛀、霉變、潮解、走味等問(wèn)題［14］?？偦曳执硭幉闹械臒o(wú)機(jī)鹽及泥沙含量。醇浸出物能夠反映藥材的內(nèi)在物質(zhì)含量。總生物堿為平貝母發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［15］。

本文建立了HPLC-ELSD檢測(cè)貝母素甲和貝母素乙的方法，并對(duì)東北三省不同產(chǎn)地平貝母中貝母素甲和貝母素乙進(jìn)行含量檢測(cè)。在基于《中國(guó)藥典》規(guī)定的要求范圍內(nèi)，對(duì)平貝母樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析比較，可以更明確東北三省平貝母的質(zhì)量及其差異［16］。

根據(jù)含量檢測(cè)結(jié)果表明，東北三省平貝母以吉林省產(chǎn)平貝母質(zhì)量最佳。通過(guò)聚類(lèi)分析，表明東北三省各產(chǎn)地之間的平貝母存在一定的質(zhì)量差異，但是地域的差異對(duì)質(zhì)量影響不太大，質(zhì)量之間的差異可能為生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)年限因素的影響。

此次采集的樣品中以吉林省平貝母居多，其他兩省采集數(shù)量較少。同一年生不同品種的平貝母大小存在差異，在5～25 cm之間不等，在很大程度上影響平貝母的質(zhì)量。不同年生的藥材，其主要成分的積累可能存在不同的差異［17-18］。下一步會(huì)加大樣品采樣量，采集同一品種、同一年生的平貝母，繼續(xù)對(duì)東北三省的平貝母進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

不同的采收時(shí)間及加工方式會(huì)對(duì)藥材的品質(zhì)造成影響［19-20］。選擇最佳的平貝母采收時(shí)間，優(yōu)化平貝母的干燥方式，加強(qiáng)平貝母的產(chǎn)地初加工對(duì)平貝母質(zhì)量的提升有重要意義。