聶新，楊展，宗曉婕，劉凱龍，姚國強

（內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業(yè)農村部奶制品加工重點實驗室，內蒙古自治區(qū)乳品生物技術與工程重點實驗室，乳酸菌與發(fā)酵乳制品省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，內蒙古 呼和浩特 010018）

蜂巢營養(yǎng)成分豐富且對人體無毒無害[1-2]，研究發(fā)現蜂巢制品不僅可以改善人體免疫功能[3]，還對人體內的一些病原菌有顯著抑制作用[4-5]。有研究發(fā)現，蜂巢對肝炎表面抗原具有滅活作用[6]，對某些癌癥也有一定的療效[7]。此外，相關研究表明蜂巢的提取物有抗炎、抗菌和抗氧化作用[8]，蜂巢的抗氧化作用的主要機理是由于其含有的抗氧化活性物質可以與金屬離子螯合，是天然抗氧化劑[9]，在食品、醫(yī)藥、化妝品等各行業(yè)被廣泛應用。

關于蜂巢樣本中主要成分及含量的測定，徐歡等[10]采用香草醛-冰醋酸顯色法測定蜂巢中甾萜類物質的含量，結果表明無刺蜂蜂巢甾萜類乙醇提取物在體外具有較好的抗氧化活性。李超[11]采用高效液相色譜法對蜂巢黃酮化合物進行定性定量分析，發(fā)現蜂巢中含有黃酮類、糖類、氨基酸類、有機酸等化合物。范家佑等[12]提取了露蜂巢的揮發(fā)性物質，通過檢測最終得到68 種揮發(fā)性物質，其主要成分中高級脂肪酸和酯類含量較少，而烴類化合物含量多，研究中對其物質活性成分功能分析較少。

近幾年對于蜂巢生物活性物質功能的研究十分鮮見，蜂巢生物活性成分沒有得到充分的研究利用，造成資源的浪費。本研究以不同蜜源的蜂巢為研究對象，采用液相色譜-四極桿飛行時間質譜（liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，LC-Q-TOF/MS）技術[13]，探究不同蜜源蜂巢的活性物質差異以及特有活性物質的功能，以期為蜂巢的綜合利用和進一步的開發(fā)提供一定依據，為后續(xù)研究提供理論與方法的支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蜂巢來源

樣品均來自云南，樣本分組信息如表1 所示。

表1 樣本分組信息Table 1 Sample grouping information

1.1.2 試劑與儀器

乙腈、乙醇、甲醇（均為色譜級）：德國默克集團；醋酸銨、甲酸銨（均為色譜級）：上海創(chuàng)賽科技有限公司；甘油、4-（2-羥乙基）-哌嗪-1-乙磺酸（均為色譜級）：美國西格瑪奧德里奇公司。

QTOF/MS-65454 質譜儀、1290 Infinity LC 超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；MIX-200 渦旋混合器：上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；5427R 臺式高速冷凍離心機：德國艾本德公司；Milli-Q 水凈化系統(tǒng)制備：法國莫爾謝姆集團。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理方法

分別稱取適當的樣品加入離心管，控制樣品的質量在（50.0±0.1）mg，加入預冷過的甲醇水（500 μL 70%，含1 mg/L 的2-氯苯丙氨酸）。對其進行勻漿操作（30 s，30 Hz），振蕩充分混勻，靜置冷卻15 min 后進行離心（12 000 r/min，10 min，4 ℃），取上清液400 μL 置于樣品管中，沉淀部分加入500 μL 乙酸乙酯/甲醇（體積比1∶3），充分混合均勻后再次離心（12 000 r/min，10 min，4 ℃），取二次離心后的上清液400 μL 與一次離心上清液混合，沉淀部分加入100 μL 70%甲醇水，超聲破碎3 min 后離心（12 000 r/min，3 min，4 ℃），取60 μL 上清液注入玻璃內襯管中待用。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱采用Waters BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），色譜分離溫度為35 ℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為5 μL。

正離子模式的流動相：含0.1%甲酸的乙腈為A相、含0.1%甲酸的超純水為B 相，按照體積比進行梯度洗脫：0～2 min，90%A；2～6 min，70%A；6～7 min，50%A；7～8 min，35%A；8～9 min，30%A；9～10 min，20%A；10～15 min，10%A；15～16 min，90%A。

負離子模式的流動相：0.1%甲酸銨溶液為A 相、乙腈溶液為B 相；按照體積比進行梯度洗脫：0～2 min，90%A；2～6 min，70%A；6～10 min，35%A；10～15 min，10%A；15～16 min，90%A。

1.2.3 質譜條件

質譜條件使用正負離子兩種模式對數據進行采集，霧化氣體為氮氣。一級質荷比掃描范圍為50～1 200，選擇20～40 eV 的能量對其中的母離子進行破碎，對其碎片的數據信息進行采集。正離子模式下鎖定質量數為556.277 1，負離子模式下鎖定質量數為554.261 5，掃描時間0.2 s，采集間隔20 s，使用質量濃度為2 mg/mL亮氨酸腦啡肽作為校正液進行實時質量校正。質譜條件中流量為10 μL/min；毛細管電壓為3 kV；錐孔電壓為40 kV；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流速為800 L/h；錐孔氣流量為50 L/h；掃描時間為0.2 s。1.3 數據處理

LC-Q-TOF/MS 技術獲得的原始數據經MassLynx 4.1 工作站、Progenesis QI 軟件完成預處理，對其中的數據進行峰提取、峰對齊以及保留時間的校正。對缺失率大于50%的峰進行過濾，然后數據對比數據庫。使用EZinf 軟件對其代謝產物進行統(tǒng)計學分析，主要包括主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘（orthogonal projections to latent structures，OPLS）法等，根據統(tǒng)計學分析，結合T 檢驗和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonalpartialleast squares-discriminantanalysis，OPLS-DA）以及分析的變量對模型的重要性值（variable importance in the projection，VIP），進行差異代謝物的篩選工作，將VIP＞1，且P＜0.05 的代謝物定義為顯著差異代謝物。隨后對于檢索出來的差異代謝物進行匹配及分析，通過關聯(lián)分析、聚類分析等手段，對比人類代謝組數據庫（human metabolome database，HMDB）信息，對差異代謝物的功能活性進行匹配，并最終確定差異代謝物成分和功能。

2 結果與分析

2.1 蜂巢活性物質探究

2.1.1 質控分析

質控分析（quality controlled，QC）是處理試驗過程中數據重復性是否良好的檢測手段[14]，在樣本數據上機之前，需要使用QC 樣本對儀器進行檢測，并在樣本上機過程中，不時使用QC 樣本進行標定，避免數據的漂移，保證樣本數據的準確性。通過總離子流圖（total ion chromatogram，TIC），對其進行分析，可以得知儀器的準確性和可靠性是否良好。正、負離子兩種模式下的TIC 重疊圖如圖1 所示。

圖1 正、負離子兩種模式下的TIC 重疊圖Fig.1 TIC overlay picture in cation and anion conditions

由圖1 可知，正負離子模式下QC 樣本都能較好地聚集在一起，重疊程度越高，表明本研究的質譜分析儀器運行情況越優(yōu)良，穩(wěn)定性越好。

2.1.2 蜂巢活性物質分析

兩種蜂巢共檢索出26 235 個物質，以物質峰強度，P＜0.01、兩組數據之間的差異倍數≤0.5 或≥2 和VIP＞1 作為篩選標準[15]，HMDB 數據庫中所篩選出克巢活性物質情況如表2 所示。

表2 克巢中的活性物質Table 2 Active substances in gram nests

由表2 可知，克巢中篩選出22 個與人體密切相關的化合物，代謝物分別歸類到氨基酸及其衍生物（6個）、糖類（3 個）、生物堿（1 個）、黃酮類化合物（5 個）、吲哚及其衍生物（2 個）、有機酸及其衍生物（2 個）、酚酸類物質（3 個）共7 個分類。

以物質峰強度，P＜0.01、0.5≤兩組數據之間的差異倍數≥2 和VIP＞1 作為篩選標準，HMDB 數據庫中所篩選出崖黑巢活性物質情況如表3 所示。

表3 崖黑巢中的活性物質Table 3 Active substances in the cliff black nest

由表3 可知，崖黑巢中篩選出23 個與人體密切相關的化合物，代謝物分別歸類到氨基酸及其衍生物（7個）、糖類（1 個）、生物堿（2 個）、黃酮類化合物（2 個）、吲哚及其衍生物（2 個）、輔酶和維生素類（4 個）、有機酸及其衍生物（4 個）、酚酸類物質（1 個）共8 個分類。

克巢中黃酮類主要有4＇，6，7-三羥基異黃酮具有抗氧化性和抗癌活性[16]；甘草素具有抗癌、抗炎和治療神經疾病活性[17]；山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷具有抗肥胖活性；槲皮萬壽菊素-3，6-二甲醚具有抗炎活性[18]；黃豆黃素可以影響細胞凋亡和抗氧化活性。酚酸類物質主要有D（-）-水楊苷，具有抗癌抗炎活性[19]；4-羥基肉桂酸，具有抗腫瘤和抗誘變活性[20]；4-甲基兒茶酚具有抗氧化活性。

崖黒巢中黃酮類化合物主要有3，7-二-O-甲基槲皮素可增加血管舒張的活性功能；水仙苷具有抗氧化活性。酚酸類物質中含有的水楊酸具有抗炎活性和治療免疫疾病活性[21]。有機酸及其衍生物主要有葉酸、衣康酸、丁二酸、3-甲基己二酸，是人體在利用糖分和氨基酸時的必要物質，是機體細胞生長和繁殖所必需的物質。生物堿主要有5-羥基色醇、哈爾酚。輔酶和維生素類：煙酰胺可調節(jié)食欲、睡眠、情緒[22]；泛酸可抑制惡性瘧原蟲泛酸激酶活性并抑制瘧原蟲的增殖；D-生物素、維生素B1可促進胃腸道蠕動和增加食欲[23]。

2.2 差異代謝物分析

2.2.1 主成分分析

PCA 是一種常用的無監(jiān)督模式識別方法，反映了樣本代謝物的相似程度，即在樣品分組情況未明的前提下對數據進行分析，直接反映不同化學級別之間的差異，并找出異常值的分析方法[24]，樣本之間重合距離越小，表示差異越小，反之差異越大[25]，通過對得到的PCA 模型圖進行分析，從而得到不同蜜源的蜂巢中各類代謝物的簡單分組分布情況。本研究PCA 得分情況如圖2 所示。

圖2 正、負離子模式下的主成分分析Fig.2 Principal component analysis in cation and anion conditions

由圖2 可知，圖中所有點均分布于95%置信區(qū)間內，根據PCA 圖可知，組內差異不明顯，組間差異明顯。表明樣品組內代謝物差異小，組間代謝物差異明顯[26]。此外PC1 為39.27%，PC2 為14.85%。結果表明該PCA 模型穩(wěn)定可靠，可用于后續(xù)分析。

2.2.2 OPLS-DA 分析

OPLS-DA 是一種有監(jiān)督模式識別方法，可以去除部分無關信息，保證模型的預測能力在保持不下降的前提之下，有效地減少模型的結構復雜性，放大各組之間的差異性[27]。通過使用有監(jiān)督的OPLS-DA 分析，結合VIP 值，可以對代謝物進行篩選，控制適當的因素條件，檢索不同蜂巢樣品當中的差異代謝物。本研究的OPLS-DA 分析情況如圖3 所示。

圖3 OPLS-DA 得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot of different honey combs

由圖3a 可知，草藥和米團花蜜源崖黑巢和百花蜜源崖黑巢樣品OPLS-DA 模型中共有兩個主成分，第一個主成分的貢獻值為52.2%，第二個主成分的貢獻值為11.4%；由圖3b 可知，草藥和米團花蜜源克巢和百花蜜源克巢樣品OPLS-DA 模型中共有兩個主成分，第一個主成分的貢獻值為37.6%，第二個主成分的貢獻值為29%，各組樣品之間區(qū)分效果非常明顯，所建立的模型當中的Q2＞0.9，表明該模型數據穩(wěn)定性和可靠性良好[28]。

2.2.3 不同蜜源蜂巢的差異代謝物

經數據質量控制步驟后，草藥和米團花蜜源崖黑巢、百花蜜源崖黑巢、草藥和米團花蜜源克巢、百花蜜源克巢的差異代謝物情況如圖4 所示。

圖4 正負離子模式下分組韋恩圖Fig.4 Venn in cation and anion conditions

由圖4 可知，數據集中分別保留了1 790、1 779、1 865、1 867 種差異代謝物，4 組樣品共有1 268 種共有差異代謝物。兩組崖黑巢有1 658 種共有差異代謝物，兩組克巢有1 456 種共有差異代謝物，兩組以草藥和米團花為蜜源的蜂巢有1 433 種共有差異代謝物，兩組百花蜜源蜂巢有1 673 種共有差異代謝物。

用T 檢驗和變異倍數可以對代謝物進行篩選。以P＜0.05，兩組數據之間的差異倍數≥2 或兩組數據之間的差異倍數≤0.5 為標準，進行差異代謝產物篩選工序，將數據進行可視化處理，繪制火山圖，結果如圖5所示。

圖5 正、負離子合并差異代謝物火山圖Fig.5 Volcano map of differential metabolites in cation and anion conditions

由圖5A 可知，不同蜜源崖黒巢共檢索到的蜂巢差異代謝物總數為1 239 種，其中上調代謝物為327種，下調代謝物為125 種。由圖5B 可知，不同蜜源克巢共檢索到的蜂巢差異代謝物總數為1 456 種，其中上調代謝物為153 種，下調代謝物為139 種。由圖5C可知，兩組草藥和米團花蜜源樣品共檢索到的蜂巢差異代謝物總數為1 433 種，其中上調代謝物為672 種，下調代謝物為724 種。由圖5D 可知，兩組百花蜜源共檢索到的蜂巢差異代謝物總數為1 673 種，其中上調代謝物為672 種，下調代謝物為724 種。

對不同蜜源蜂巢的差異代謝物進行聚類分析，每行各代表一種差異代謝物，列代表一個蜂巢樣本。結果如圖6 所示。

由圖6 可知，不同研究組中平行樣本都聚在同一簇內，表明聚類結果可信度較高，聚類熱圖分析的結果可靠[29]。共鑒定出75 種具有顯著差異的代謝物，崖黑巢中有39 種成分相對含量高于克巢，36 種成分相對含量低于克巢。

崖黑巢中兩種不同蜜源的代謝物如表4 所示。

表4 兩種蜜源崖黑巢差異代謝物鑒定結果Table 4 Identification results of differential metabolites in the black nest of two nectar cliffs

由表4 可知，兩種蜜源崖黑巢差異代謝物鑒定結果為顯著上調差異代謝物有阿魏酸、煙酰胺、次黃嘌呤、紫杉醇、氨磺丁脲、松柏醇、3-（甲硫基）丙酸、2＇-甲氧基腺苷（8 個），即以百花為蜜源的崖黒巢中上述化合物的含量顯著高于以草藥和米團花為蜜源的崖黒巢。下調物質有2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3，7-二-O-甲基槲皮（2 個）。即以草藥和米團花為蜜源的崖黒巢中上述化合物的含量顯著高于以百花為蜜源的崖黒巢。

克巢不同蜜源的差異代謝物如表5 所示。

表5 兩種蜜源克巢差異代謝物鑒定結果Table 5 Identification results of differential metabolites between two nectar sources of gram nest

由表5 可知，兩種蜜源克巢差異代謝物鑒定結果為顯著上調差異代謝物有槲皮素、4＇，6，7-三羥基異黃酮、穗花杉雙黃酮、奧昔嘌醇、4＇-O-甲基-d3 槲皮素、羥基芫花素、桑色素（7 個），即以百花為蜜源的克巢中上述化合物的含量顯著高于以草藥和米團花為蜜源的克巢。下調物質有假荊芥屬苷、萘啶酮酸（2 個）。即以草藥和米團花為蜜源的克巢中上述化合物的含量顯著高于以百花為蜜源的克巢。可以看出在崖黑巢和克巢中，以草藥和米團花為蜜源的樣本比以百花為蜜源的樣本中對人體有益的活性物質更豐富。

3 結論

近年來，蜂巢因其具有對人體有益的生物活性和廣泛的入藥案例而備受關注。本試驗使用液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術可以有效地區(qū)分不同蜜源崖黑巢和克巢，不僅表現出了蜂巢的化學多樣性，還豐富了蜂巢溯源識別的標志化合物群，其中黃酮與酚酸類化合物不僅是蜂巢中的活性組分群，還可作為蜂巢蜜源判別的差異標志物。本試驗可以初步鑒定蜂巢中存在的對人體有益的活性物質，還可以為不同蜜源的蜂巢的質量評價建立有效方法，為蜂巢的品質分析與規(guī)范蜂產品市場作參考。