潘俊坤，焦中高，張 強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州 450009）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）廣泛存在于茶葉中，是一種兒茶素類物質(zhì)，占茶多酚含量的30%～50%[1]。EGCG 結(jié)構(gòu)富含多個羥基基團(tuán)，具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎、降血糖等功能活性[2-4]。異鼠李素（isorhamnetin）廣泛存在于銀杏、沙棘等植物中，是一種黃酮醇類化合物[5-6]。異鼠李素結(jié)構(gòu)也富含多個羥基基團(tuán)，具有抗炎、抗氧化、抗癌、降血脂等生物活性[7-10]。

在探尋天然高效抗氧化活性資源的過程中，單一活性成分的抗氧化活性研究備受關(guān)注，而復(fù)配組分研究尚有不足。有研究發(fā)現(xiàn)，單一天然活性成分的抗氧化效果有弱于復(fù)配組分的現(xiàn)象發(fā)生[11-13]。王娜等[14]利用中效定理分析發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇與維生素E 在體積比為1:1～7:1 之間具有良好的協(xié)同效果（聯(lián)合作用指數(shù)（Combination Idex，CI）<0.95），且當(dāng)體積比為3:1 時，CI 值最小，其清除DPPH·的半抑制濃度IC50值為0.011 mg/mL，因此當(dāng)體積比為3:1 時該復(fù)配組分具有最佳的協(xié)同抗氧化作用。

近年來，已有報道化合物組合對細(xì)胞模型相關(guān)活性影響的研究。Liu 等[15]研究槲皮素（5 μmol/L）和EGCG（5 μmol/L）聯(lián)合處理對HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗模型糖代謝的影響，首次報道m(xù)iR-27a-3p 和miR-96-5p 通過抑制FOXO1 表達(dá)參與槲皮素和EGCG聯(lián)合作用棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗的協(xié)同保護(hù)作用。Pan 等[16]研究酚酸和胡蘿卜素對H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞的協(xié)同抗氧化作用發(fā)現(xiàn)，酚酸增加了細(xì)胞對胡蘿卜素的攝取及其膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。酚酸含量較高的組合具有協(xié)同作用，其中β-胡蘿卜素:咖啡酸=1:2 時，顯著抑制了細(xì)胞內(nèi)ROS，Synergistic rate（SR）>1 表現(xiàn)出協(xié)同作用，并增加了細(xì)胞核Nrf2 的表達(dá)。關(guān)惠[17]的研究發(fā)現(xiàn)槲皮素和兒茶素（12.5+12.5 μmol/L）通過靶向FOXO3協(xié)同抑制CHUK基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的分子機(jī)制可能是：槲皮素和兒茶素通過共同作用于CHUK轉(zhuǎn)錄因子FOXO3的DNA 結(jié)合域，干擾靶基因DNA 的結(jié)合，并破壞蛋白-DNA 復(fù)合物的穩(wěn)定性，進(jìn)而協(xié)同抑制FOXO3與CHUK啟動子序列的結(jié)合，抑制CHUK的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，影響CHUK下游基因表達(dá)，從而協(xié)同增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激作用。因此研究具有協(xié)同增效的細(xì)胞抗氧化活性植物天然成分，為食源性類黃酮功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

本研究通過2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽[2,2-Azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride solution，AAPH]誘導(dǎo)構(gòu)建了HepG2 細(xì)胞抗氧化模型，設(shè)置EGCG 和異鼠李素組合質(zhì)量濃度比為7:4、6:4 和6:5，通過此模型驗(yàn)證了不同比例EGCG 和異鼠李素組合對HepG2 細(xì)胞抗氧化作用，采用Chou-Talalay中效分析法評價不同比例的EGCG 和異鼠李素細(xì)胞抗氧化協(xié)同效應(yīng)，并進(jìn)一步探究聯(lián)合指數(shù)（Combinaion Index，CI）最優(yōu)組合對HepG2 細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)酶的影響。研究結(jié)果為揭示EGCG 和異鼠李素抗氧化應(yīng)激的協(xié)同增效機(jī)制提供了理論依據(jù)，同時為明確膳食中抗氧化成分的生物學(xué)功能提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EGCG 標(biāo)準(zhǔn)品（98%）、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品（98%）、最小必需培養(yǎng)基（Minimum Essential Medium，MEM）、PBS 緩沖液（phosphate buffer solution）、胰蛋白酶、CCK-8 試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽[2,2-Azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride solution，AAPH]、2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（2',7'-Dichlorfluorescin diacetate，DCFH-DA）、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）Gibco 公司；Western、IP 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒 碧云天科技公司；總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒、總谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；HepG2細(xì)胞 中科院昆明動物所。

CO2培養(yǎng)箱 Thermo Fisher 公司；SpectraMax i3X 酶標(biāo)儀 Molecular Devices 公司；XDS-1 系列倒置生物顯微鏡 重慶重光實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Centrifuge 5427R 離心機(jī) 德國Eppendorf 公司；-80 ℃冰箱 青島海爾特種電冰柜有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；GL224i-1SCN 分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聯(lián)合指數(shù)法 采用CompuSyn 分析軟件計算EGCG 和異鼠李素組合細(xì)胞抗氧化活性的聯(lián)合指數(shù)CI[18]。聯(lián)合指數(shù)公式為：CI=（D）1/（DX）1+（D）2/（DX）2，其中（D）1、（D）2分別為復(fù)配處理時，活性達(dá)到x%，兩種植物化學(xué)各自濃度，DX 為單一物質(zhì)活性達(dá)到x%所需的物質(zhì)濃度[19]。當(dāng)CI<1 時，表示協(xié)同作用；CI=1 時，表示相加作用；CI>1 時，表示拮抗作用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞為貼壁細(xì)胞生長，該細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、1%雙抗（100×）的MEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中孵育，每1～2 d 更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長到80%～90%后，移除培養(yǎng)基，常溫下PBS 清洗1～2 次，加入1～2 mL 含EDTA 的胰蛋白酶消化液于25 cm2培養(yǎng)瓶中，消化2～3 min，待細(xì)胞消化完成后加入2 mL完全培養(yǎng)基，1000 r/min 下離心5 min，棄去上清液后用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行傳代。

1.2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8 法檢測細(xì)胞毒性活性，參照Liang 等[18]方法，將密度為5.0×104個/孔的HepG2 細(xì)胞接種于96 孔板各孔中，每孔接種100 μL，每組設(shè)置6 個重復(fù)，培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μL MEM 培養(yǎng)基（包含不同濃度比的EGCG+異鼠李素組合，EGCG 或異鼠李素），并設(shè)置6 個重復(fù)，正常對照組加入相同體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液培養(yǎng)1～2 h 后，96 孔板放于酶標(biāo)儀450 nm 處測定OD 值，計算細(xì)胞存活率。

1.2.4 細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)（CAA）參照Tu 等[20]方法取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，在96 孔板中加入100 μL培養(yǎng)基其細(xì)胞密度達(dá)到5×104個/孔；培養(yǎng)24 h 后除去培養(yǎng)基，并用PBS 清洗1～2 次；分別加入包含EGCG、異鼠李素，不同質(zhì)量濃度比的EGCG+異鼠李素組合的DCFH-DA 探針培養(yǎng)基，其中DCFH-DA探針終濃度為25 μmol/mL，繼續(xù)孵育1 h；1 h 后，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 的PBS 清洗3 次；然后加入100 μL 的濃度為600 μmol/mL 的AAPH（Hanks溶液稀釋），將96 孔板放入多功能酶標(biāo)儀檢測，恒溫37 ℃。酶標(biāo)儀測定條件為：激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm，振蕩5 s，然后每5 min 測定一次，測定60 min。計算公式如下：CAA（unit）=1-（∫SA/∫CA），∫SA：樣品時間-熒光值曲線下的積分面積；∫CA：對照時間-熒光值曲線下的積分面積；EC50根據(jù)lg（fa/fu）/lg（dose）的中效原理計算；fa：CAA unit；fu：1-CAA unit。實(shí)驗(yàn)中每個樣品做四個重復(fù)，實(shí)驗(yàn)空白組即加入探針DCFH-DA 但不加AAPH 及抗氧化劑的熒光衰減組；實(shí)驗(yàn)陽性對照為加自由基激發(fā)劑AAPH 和探針DCFH-DA 的熒光衰減組，樣品實(shí)驗(yàn)劑量對細(xì)胞生長的抑制率在10%以下進(jìn)行。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性實(shí)驗(yàn) 參照Zhang 等[21]和Shi 等[22]取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞濃度為106個/mL，均勻鋪于6 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后待其貼壁生長后清除培養(yǎng)基；加入含EGCG+異鼠李素組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1 h 后，用PBS 清洗1～2 次；加入1.5 mL 600 μmol/mL AAPH 在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱里孵育1.5～2 h；陽性對照組加入AAPH 不加抗氧化劑（NC），陰性對照組不加AAPH 和抗氧化劑（PC）；然后用PBS 清洗一次，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，1000 r/min離心10 min 后收集細(xì)胞，棄上清；再加1 mL PBS 離心10 min，棄上清；加入IP 裂解液（加PMSF，100:1，v/v）30～40 min（冰上操作），4 ℃下18495 r/min離心10 min，取上清分裝，-80 ℃下保存。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，取適量先進(jìn)行蛋白含量測定，然后檢測總SOD、CAT 和GSH-Px 的活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。通過SPSS 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用ANOVA 單因素進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并采用Duncan模塊結(jié)合事后多重比較進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異，采用Sigmaplot 10.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG、異鼠李素以及EGCG 和異鼠李素組合的細(xì)胞抗氧化活性

CAA 法是一種從細(xì)胞水平反映抗氧化劑的吸收和代謝的變化情況，更真實(shí)地模擬機(jī)體的正常生理狀態(tài)[23]。CAA 法中熒光探針DCFH-DA 本身沒有熒光，但可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后會被細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的蛋白酯酶水解生成DCFH，此時細(xì)胞內(nèi)的活性氧通過氧化無熒光的DCFH 從而能變成有熒光的DCF，因此檢測熒光值就能反映細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平[24-25]。

采用HepG2 細(xì)胞抗氧化評價模型評價不同濃度梯度下樣品的細(xì)胞抗氧化活性。如圖1 所示，EGCG 和異鼠李素的EC50值分別為6.2±0.2 和3.8±0.1 μg/mL，兩者細(xì)胞抗氧化活性具有顯著性差異（P<0.05）。在聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)中，為了每個單體化合物具有相似的活性，確定每個單體化合物的（EC50）1/（EC50）2為組合物的質(zhì)量濃度比。并以（EC50）1/（EC50）2比例為參照，調(diào)整各個單體化合物質(zhì)量濃度比例，確定組合物的質(zhì)量濃度比分別為6:4、6:5、7:4。因此，以EGCG 組（7 μg/mL）、異鼠李素組（5 μg/mL）、組合1（6+4 μg/mL）、組合2（6+5 μg/mL）和組合3（7+4 μg/mL）為各樣品細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)作用濃度。結(jié)果顯示，EGCG 和異鼠李素組合的EC50值分別為5.0±0.2、5.25±0.2 和5.50±0.2 μg/mL，組合1 的活性優(yōu)于其他組合活性。EGCG+異鼠李素組合的EC50值分別是EGCG 組的0.81 倍、0.85 倍和0.89 倍，表明EGCG+異鼠李素組合抗氧化活性顯著高于EGCG 組（P<0.05）。然而，EGCG+異鼠李素組合的EC50值均高于異鼠李素組，表明組合物的抗氧化活性顯著弱于異鼠李素組（P<0.05）。

圖1 EGCG 組、異鼠李素組、EGCG+異鼠李素組合的EC50 值Fig.1 EC50 of EGCG,isorhamnetin,and EGCG+isorhamnetin combinations

綜上所述，EGCG 和異鼠李素組合可保護(hù)HepG2細(xì)胞免受AAPH 誘導(dǎo)的氧化損傷。其中，組合1 的細(xì)胞抗氧化活性較強(qiáng)。目前，依據(jù)不同活性成分相互作用效果的不同將其相互作用關(guān)系分為：協(xié)同增效作用、拮抗作用和簡單加和作用。從生物學(xué)角度來看，細(xì)胞攝取量對活性成分的生物可及性和生物利用度造成一定影響，并影響其最終在體內(nèi)抗氧化作用的發(fā)揮。Chen 等[26]研究表明，黃酮類化合物（槲皮素、木犀草素）和類胡蘿卜素（番茄紅素、葉黃素）在總濃度為8 μmol/mL 的不同比例下結(jié)合，番茄紅素:槲皮素=1:5 復(fù)配組作用后，促進(jìn)了番茄紅素的細(xì)胞從而增強(qiáng)了其細(xì)胞抗氧化活性。Phan 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，花青素和β-類胡蘿卜素聯(lián)合作用Caco2 細(xì)胞時，增加了β-類胡蘿卜素的細(xì)胞吸收，但對其細(xì)胞抗氧化活性產(chǎn)生了拮抗作用，可能與β-類胡蘿卜素和花青素共同作用時，β-類胡蘿卜素細(xì)胞濃度達(dá)到一定水平時表現(xiàn)出促氧化作用有關(guān)。因此，活性成分的攝取量可能是影響其細(xì)胞抗氧化活性的關(guān)鍵因素，也是未來研究方向中需要特別關(guān)注的內(nèi)容。

2.2 EGCG 和異鼠李素組合對HepG2 細(xì)胞存活率的影響

利用CCK-8 法，對EGCG、異鼠李素以及EGCG和異鼠李素組合在不同濃度梯度處理HepG2 細(xì)胞24 h，進(jìn)行細(xì)胞毒性分析。由2.1 中可知EGCG 和異鼠李素的EC50分別為6.2±0.2 和3.8±0.1 μg/mL，在聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)中，以單體化合物的（EC50）1/（EC50）2為組合的質(zhì)量濃度比參照，并上下調(diào)整質(zhì)量濃度比例，確定組合物的質(zhì)量濃度比分別為6:4、6:4、7:4。因此，以EGCG 組（7 μg/mL）、異鼠李素組（5 μg/mL）、組合1（6+4 μg/mL）、組合2（6+5 μg/mL）和組合3（7+4 μg/mL）為各樣品CCK-8 實(shí)驗(yàn)作用濃度。結(jié)果如圖2 所示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的EGCG、異鼠李素以及不同質(zhì)量濃度比的EGCG 和異鼠李素組合處理24 h 后，細(xì)胞存活率均在90%以上，該濃度下各樣品符合后續(xù)細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒性要求。EGCG和異鼠李素在不同濃度下，其細(xì)胞存活率存在顯著性差異（P<0.05）；而EGCG 和異鼠李素組合（6:4，6:5，7:4，c/c）三者之間的細(xì)胞存活率無明顯差異（P>0.05）。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中各處理組所使用樣品濃度，對HepG2 細(xì)胞無明顯毒副作用。

圖2 EGCG 組、異鼠李素組、EGCG+異鼠李素組合對HepG2 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of EGCG group,isorhamnetin group,and EGCG+isorhamnetin groups on the surviral rates of HepG2 cells

2.3 EGCG 和異鼠李素組合聯(lián)合指數(shù)CI

Chou 和Talalay 引入了聯(lián)合指數(shù)（CI）方法，將藥物聯(lián)合效應(yīng)定量描述為協(xié)同效應(yīng)（CI<1）、加和效應(yīng)（CI=1）或拮抗效應(yīng)（CI>1）。隨著Chou-Talalay 理論的發(fā)展，CompuSyn 軟件被開發(fā)出來，用于劑量效應(yīng)分析、CI 計算和Fa-CI 圖模擬[28]。本研究采用Chou-Talalay 聯(lián)合指數(shù)法，考察EGCG 與異鼠李素聯(lián)合作用是否具有協(xié)同作用。在聯(lián)合作用試驗(yàn)中，以EGCG 和異鼠李素的EC50值為指導(dǎo)選擇單個濃度。CI 值由CompuSyn 軟件計算。EGCG 和異鼠李素在50%、75%和90%抗氧化效果下（GI50、GI75和GI90）的CI 值見表1。

表1 EGCG 和異鼠李素組合的CI 值Table 1 CI value of EGCG+isorhamnetin

如圖3 所示，隨著濃度的增加各單體及EGCG和異鼠李素組合細(xì)胞抗氧化活性也隨之增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。圖3A～圖3C 中，濃度在0～5 μg/mL時，異鼠李素組的CAA 值最高，為53.5%±2.7%，與EGCG 組和組合的CAA 值具有顯著性差異（P<0.05）；濃度在10 μg/mL 時，組合的CAA 值此時最高，分別為65.6%±2.3%、70.1±2.5%和68.2±2.2%，且與濃度為5 μg/mL 時的EGCG 組（51.6%±1.7%）和異鼠李素組（53.5%±2.7%）的活性存在顯著性差異（P<0.05）。結(jié)果表明，EGCG+異鼠李素組合可能具有協(xié)同作用。

圖3 EGCG（7 μg/mL）、異鼠李素（5 μg/mL）、EGCG+異鼠李素組合的CAA 值Fig.3 CAA of EGCG (7 μg/mL),isorhamnetin (5 μg/mL)and EGCG+isorhamnetin

依據(jù)圖3 中各單體及組合在相應(yīng)濃度下的CAA值，經(jīng)過CompuSyn 軟件計算，得到EGCG 和異鼠李素組合的CI 值，結(jié)果如表1 所示。表1 是利用聯(lián)合指數(shù)法計算出各不同濃度EGCG 和異鼠李素組合聯(lián)用時的平均CI 值，從表1 可以看出EGCG 和異鼠李素聯(lián)合作用時，在濃度比為6:4 和6:5 時，具有協(xié)同作用。EGCG 和異鼠李素的聯(lián)合使用，在兩者的濃度為7:4 時，其聯(lián)合用藥系數(shù)CI 約為1，聯(lián)合用藥指數(shù)均值（CIavg）為1.00，表現(xiàn)出了疊加作用。在兩者的濃度比為6:4 時，其中，GI75和GI90均小于0.80，說明兩者在濃度為6:4 時表現(xiàn)出了較強(qiáng)的協(xié)同作用，聯(lián)合用藥指數(shù)均值（CIavg）為0.76。在兩者的濃度比為6:5 時，GI50約為1，GI75和GI90小于1，說明兩者在濃度為6:5 時表現(xiàn)出了較弱的協(xié)同作用，聯(lián)合用藥指數(shù)均值（CIavg）為0.95。圖4 為EGCG和異鼠李素組合（6:4）在CIavg最小時的Fa-CI 趨勢圖，隨著Fa 值的增加，CI 值呈降低趨勢，即表明隨著細(xì)胞抗氧化活性的增加，EGCG 和異鼠李素組合的協(xié)同增效作用更佳。結(jié)果表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，EGCG 和異鼠李素組合對HepG2 細(xì)胞具有協(xié)同抗氧化保護(hù)作用。EGCG+異鼠李素（6:4）的CI 值為最佳組合，因此選用EGCG+異鼠李素（6:4）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

于佳成[29]發(fā)現(xiàn)，槲皮素與兒茶素（12.5 μmol/L+12.5 μmol/L）的濃度組合對H2O2誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞氧化損傷具有協(xié)同保護(hù)作用，其聯(lián)合指數(shù)CI 值為0.374，表明組合協(xié)同效果較好；進(jìn)一步細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)合處理后，SOD、CAT、GPx 活性和MDA 含量比單藥處理顯著性降低，說明槲皮素和兒茶素組合在消除ABAP 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激酶活方面具有一定的協(xié)同增效作用。Saw等[30]也研究發(fā)現(xiàn)，低濃度下的槲皮素和山奈酚，槲皮素和紫檀芪以及山奈酚和紫檀芪組合通過上調(diào)Nrf2通路上的mRNA 和蛋白的表達(dá)，增加了其清除自由基（ROS）等能力，對H2O2誘導(dǎo)HepG2-C8 細(xì)胞氧化損傷達(dá)到協(xié)同抗氧化保護(hù)效果。研究結(jié)果與本文結(jié)果趨勢一致，組合物對細(xì)胞都起到了協(xié)同保護(hù)作用。然而，這些結(jié)果表明，每個組合的協(xié)同作用水平與單個化合物的抗氧化作用無關(guān)，劑量效應(yīng)關(guān)系并不能說明其機(jī)制，它只顯示了質(zhì)量作用律參數(shù)[31]。基于以上結(jié)果，EGCG 與異鼠李素聯(lián)用潛在的協(xié)同作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

2.4 細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)酶活性

ROS 的過量產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激失衡，從而可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，是導(dǎo)致慢性疾病的主要因素，包括衰老、心血管病、高血壓和神經(jīng)退行性疾病[32]。AAPH 誘導(dǎo)ROS 生成可引起細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)失衡，SOD、CAT 和GSH-Px 是清除自由基的主要酶?？寡趸赶到y(tǒng)對氧化應(yīng)激損傷起著重要的防御作用。為了評估抗氧化酶系統(tǒng)是否在HepG2 細(xì)胞中發(fā)揮作用，檢測了抗氧化酶（SOD、CAT 和GSH-Px）的活性，這些酶在人體氧化應(yīng)激平衡中起著重要作用[33]。因此，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的變化可以反映HepG2 細(xì)胞抑制活性氧（ROS）的能力。

為了進(jìn)一步闡明EGCG 與異鼠李素（6:4）聯(lián)合抗氧化的作用機(jī)制，對SOD、GSH-Px 和CAT 的活性進(jìn)行了測定。結(jié)果如表2 所示，與PC 細(xì)胞相比，NC 細(xì)胞在600 μmol/mL AAPH 作用1 h 后，SOD、CAT 和GSH-Px 活性分別顯著降低51.2%、53.5%和57.1%，表明AAPH 對HepG2 細(xì)胞產(chǎn)生了氧化損傷。而當(dāng)EGCG 和異鼠李素組合提前孵育1 h 后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2 細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT 和GSH-Px 相比于NC 均有上升且隨劑量增加而增強(qiáng)加。如表2結(jié)果，與NC 細(xì)胞相比，EGCG 和異鼠李素組合在濃度1.5+1 μg/mL 作用細(xì)胞時，SOD 無顯著性差異（P>0.05），然而在3+2 μg/mL 和6+4 μg/mL 時，具有顯著性差異（P<0.05），且CAT 和GSH-Px 的活性與SOD 相似。相比于NC 細(xì)胞，EGCG 和異鼠李素組合作用與HepG2 細(xì)胞，其SOD 活性分別增加了5.2%、21.1%和49.1%；GSH-Px 的活性分別增加了7.6%、27.8%和57.6%；CAT 活性分別增加了5.6%、24.6%和42.1%。結(jié)果與CAA 測定結(jié)果一致。組合具有較好的細(xì)胞抗氧化活性，抗氧化酶活性也較高。

表2 EGCG 和異鼠李素組合（6:4）對HepG2 細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶的活性的影響Table 2 Effects of EGCG+isorhamnetin (6:4) on activities of antioxidant enzymes in HepG2 cells

綜上所述，EGCG 與異鼠李素（6:4）組合可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性抑制AAPH 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激。同時，高濃度組合在樣品組中SOD、CAT 和GSH-Px 的活性最好。結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的組合表現(xiàn)出更好的抗氧化酶活性，說明較高的酶活性是細(xì)胞抗氧化協(xié)同作用的機(jī)制。Wen 等[34]發(fā)現(xiàn)荔枝葉肉桂素B1 通過上調(diào)SOD、CAT 和GSH-Px 活性，可抑制較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性。Jiang 等[35]報道Jiupei 肽具有良好的細(xì)胞抗氧化活性，SOD、CAT和GSH-Px 活性呈劑量依賴性增加。Zhou 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，馬氏螯蝦肉中的抗氧化肽可顯著提高HepG2細(xì)胞谷胱甘肽（GSH）和過氧化氫酶（CAT）的產(chǎn)生，以及Nrf2 信號通路相關(guān)基因的表達(dá)。同樣，Huo 等[37]也報道了白酒中的抗氧化肽通過清除活性氧（ROS）和上調(diào)細(xì)胞抗氧化酶（SOD、CAT 和GSH-Px）活性發(fā)揮保護(hù)作用。如圖5 所示，EGCG 和異鼠李素組合可以穿過細(xì)胞膜，增加SOD、CAT 和GSH-Px 的活性，共同清除活性氧（reactive oxidative species，ROS）。結(jié)果表明，EGCG 和異鼠李素聯(lián)合作用主要提高了HepG2 細(xì)胞的抗氧化酶活性。因此，EGCG與異鼠李素聯(lián)用的協(xié)同機(jī)制為：上調(diào)較高的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，來抑制ROS 的產(chǎn)生，從而達(dá)到平衡機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的效果，為食源性類黃酮功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

圖5 EGCG 和異鼠李素組合在HepG2 細(xì)胞內(nèi)協(xié)同抗氧化作用機(jī)制示意圖Fig.5 Possible mechanisms of EGCG+isorhamnetin combination antioxidant activities in HepG2 cells

3 結(jié)論

綜上所述，EGCG 和異鼠李素組合聯(lián)合應(yīng)用對HepG2 細(xì)胞的協(xié)同增效保護(hù)作用，與單獨(dú)使用EGCG或異鼠李素相比，聯(lián)合作用通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)酶活性更大程度地清除HepG2 細(xì)胞內(nèi)的ROS。但本研究仍有許多不足之處：本研究僅限于體外單一細(xì)胞系，在后續(xù)的研究中可在多種細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證，在條件允許下可進(jìn)一步在動物實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)踐中進(jìn)一步驗(yàn)證；EGCG 和異鼠李素聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)的毒性研究需要進(jìn)一步驗(yàn)證；后續(xù)研究中可在分子水平上進(jìn)一步闡釋EGCG 和異鼠李素的細(xì)胞抗氧化協(xié)同作用的分子機(jī)制。本研究雖存在這些局限，但初步結(jié)果表明，EGCG 和異鼠李素聯(lián)合應(yīng)用可能是一種潛在的抗氧化劑的候選組合，并為其后續(xù)功能性產(chǎn)品的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。