劉艷紅，侯敏娜，彭修娟，王 珊，王 青，許海燕

陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046

秦艽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為龍膽科植物秦艽（Gentiana macrophyllaPall.）、麻花秦艽（Gentiana stramineaMaxim.）、粗莖秦艽（Gentiana crassicaulis Duthie exBurk.）或小秦艽（Gentiana dahuricaFisch.）的根，為陜西道地藥材，其味辛、苦，性平，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、清濕熱、退虛熱的功效［1］。環(huán)烯醚萜苷類和黃酮類化合物是秦艽標(biāo)志性化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理研究表明，秦艽抗炎鎮(zhèn)痛［2］、保肝［3］、抗病毒［4］、抗腫瘤［5］等作用的發(fā)揮均與以上兩類成分有關(guān)。

目前，黃酮類化合物提取方法主要包括熱水提取法［6］、有機溶劑提取法［7］、堿溶酸沉法［8］、微波提取法［9-12］、超聲提取法［13-14］等，環(huán)烯醚萜苷類化合物提取方法主要包括溶劑提取法［15-16］、微波提取法［17］、超聲提取法［18］等，超聲提取法因其提取效率高、簡單快速、成本低等優(yōu)點，在中藥材有效成分提取方法中占重要地位。本研究首次采用超聲提取秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)，并探討其共提取最佳工藝條件，為秦艽藥材利用最大化提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥材秦艽（采摘于陜西省太白縣，經(jīng)生藥教研室雷國蓮教授鑒定為龍膽科植物秦艽的根），蘆丁對照品（20170221）購于上海源葉生物科技有限公司，龍膽苦苷對照品（PY20150908AT）購于南京普怡生物科技有限公司。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇均為分析純。

1.2 實驗儀器與設(shè)備AUY220 電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；TU-1810 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KW600DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 秦艽黃酮及環(huán)烯醚萜苷提取精密稱取秦艽粉末1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，以一定料液比加入50%乙醇溶液。在一定溫度、功率下超聲處理一定時間，取出后，放冷至室溫，稱重，加50%乙醇溶液，補足減失重量，過濾，收集續(xù)濾液。

2.2 單因素試驗根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、40%、60%、80%、100%）、提取時間（20、25、30、35、40、45 min）、液料比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL）和提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）4個單因素，固定超聲功率100W、提取時間20 min、料液比1∶15及提取溫度 30 ℃，分別考察以上因素對秦艽黃酮及環(huán)烯醚萜苷提取率的影響，確定各因素影響和適宜參數(shù)范圍。

2.3 正交－滿意度優(yōu)化設(shè)計依據(jù)單因素試驗數(shù)據(jù)，分析選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4 個因素。采用4 因素3水平分析，以黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率為響應(yīng)值，優(yōu)選最佳提取工藝，正交試驗因素與水平編碼設(shè)計見表1。

表1 因素水平

以秦艽黃酮和環(huán)烯醚萜苷的提取率為目標(biāo)響應(yīng)值，通過對多個單因素的優(yōu)化獲得總體最優(yōu)者。利用滿意度函數(shù)將每個響應(yīng)值按公式（1）轉(zhuǎn)換為無量綱期望值di（0≤di≤1），d=0時說明滿意度不符合預(yù)期值；d=1 時說明滿意度達預(yù)期值；總體滿意度值取多個響應(yīng)值的幾何平均值，即符合公式（2）。

公式（1）中，Yi（x）指第i 個指標(biāo)的響應(yīng)值，Ymin，i 指實驗數(shù)據(jù)中第i 個指標(biāo)的最低響應(yīng)值，Ymax，i 指實驗數(shù)據(jù)中第i 個指標(biāo)的最高響應(yīng)值；公式（2）中，Wi指第i個因子的權(quán)重，Wi滿足0＜Wi＜1，且，設(shè)秦艽總黃酮的提取率為Y1，總環(huán)烯醚萜苷的最大提取率為Y2；設(shè)定總黃酮最大提取率為2.57%，最小提取率為0，設(shè)定總環(huán)烯醚萜苷的最大提取率為9.51%，最小提取率為0?？傸S酮和總環(huán)烯醚萜苷的權(quán)重均為0.5，即W1=0.5和W2=0.5。把響應(yīng)值Y1和Y2轉(zhuǎn)變?yōu)榭傮w滿意度值，利用正交設(shè)計助手軟件進行方差分析，通過響應(yīng)值選出最大滿意度值所對應(yīng)的反應(yīng)條件即為共提取最佳條件。

2.4 工作曲線繪制

2.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取蘆丁對照品5.19 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容至刻度，即制得濃度為0.104 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。精密移取蘆丁對照品溶液1、3、5、7、9 mL，分別置于25 mL容量瓶中，依次編號為1、2、3、4、5，加入50%乙醇3 mL，加入5%亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻靜置6 min，加入10%硝酸鋁0.6 mL，搖勻靜置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉4 mL，搖勻，加蒸餾水溶解并定容至刻度。以不加蘆丁的試劑溶液為空白，用紫外-可見分光光度計在504 nm處測定吸光度值（A），以濃度（C）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)（x），吸光度（A）為標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到線性回歸方程y=0.0182x+0.0055，相關(guān)系數(shù)R2=0.99909。見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取龍膽苦苷對照品5.09 mg，置于25 mL 容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，即制得濃度為0.204 mg/mL的龍膽苦苷對照品溶液。精密移取龍膽苦苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，依次編號為1、2、3、4、5，加無水乙醇溶解并定容至刻度。以不加龍膽苦苷的試劑溶液為空白，用紫外-可見分光光度計，在272 nm 處測定吸光度值（A），以濃度（C）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)（x），吸光度（A）為標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到線性回歸方程y=0.0345x-0.0182，相關(guān)系數(shù)R2=0.99868。見圖2。

圖2 龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 單因素實驗結(jié)果及分析

2.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末5 份，每份1.0 g，根據(jù)“2.1”方法進行提取。設(shè)定料液比為1∶15 g/mL，提取時間20 min，提取溫度30 ℃，超聲功率100 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%，探究乙醇體積分?jǐn)?shù)不同水平下黃酮及環(huán)烯醚萜苷提取率。

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于60%時，黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率呈上升趨勢；乙醇體積分?jǐn)?shù)達60%時，秦艽提取率達峰值；但乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～100%時提取率呈下降趨勢。原因可能與秦艽中黃酮或環(huán)烯醚萜苷的化合物相對極性有關(guān)，因乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，秦艽中黃酮或環(huán)烯醚萜苷類化合物溶出度降低，因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響

2.5.2 料液比對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末6 份，每份1.0 g，根據(jù)“2.1”方法進行提取。設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時間20 min，提取溫度30 ℃，超聲功率100 W，料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL，考察在料液比為自變量情況下，秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率。

黃酮提取率料液比為1∶25 g/mL時達峰值；環(huán)烯醚萜苷提取率料液比小于1∶25 g/mL 時，隨料液比的增大而增高，料液比為1∶30 g/mL和1∶25 g/mL時提取率相差不大，料液比大于1∶30 g/mL 提取率降低，考慮到料液比的增加會造成提取劑的浪費，故選擇料液比為1∶25 g/mL。見圖4。

圖4 料液比對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響

2.5.3 提取時間對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末6份，每份1.0 g，按照“2.1”方法進行提取。設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶25 g/mL，提取溫度30 ℃，超聲功率100 W，提取時間為20、25、30、35、40、45 min，探究在提取時間不同水平下，黃酮及環(huán)烯醚萜苷的提取率。

當(dāng)提取時間為35 min 時，秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷的提取率達峰值。原因可能是時間的延長有利于溶劑與溶質(zhì)反應(yīng)，若過久則會損壞物質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)，從而影響黃酮和環(huán)烯醚萜苷的提取率，所以最佳提取時間為35 min。見圖5。

圖5 提取時間對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響

2.5.4 提取溫度對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末5 份，每份1.0 g，按照“2.1”方法進行提取。設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶25 g/mL，提取時間35 min，超聲功率100 W，提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，考察在提取溫度為自變量情況下，秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率。

提取溫度為30～60 ℃時，秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷的提取率呈上升趨勢，當(dāng)達到60 ℃時出現(xiàn)最大值，這可能是溫度的升高有助于提取劑對溶質(zhì)的作用，60 ℃后呈下降趨勢，可能是因為生物活性被破壞，降低提取率，綜合考慮最適宜的提取溫度為60 ℃。見圖6。

圖6 提取溫度對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響

2.5.5 超聲功率對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響 精密稱取秦艽粉末5份，每份1.0 g，按照“2.1”方法進行提取。設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶25 g/mL，提取時間35 min，提取溫度60 ℃，超聲功率為100、200、300、400、500 W，探究在超聲功率為自變量情況下，秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率。

當(dāng)超聲功率低于300 W 時提取率呈上升趨勢，300 W 之后呈下降趨勢，可能是超聲功率過高產(chǎn)生熱效應(yīng)，導(dǎo)致黃酮和環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，降低提取率，故應(yīng)選擇超聲功率為300W。見圖7。

圖7 超聲功率對秦艽中黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響

2.6 正交-滿意度函數(shù)法優(yōu)化運用正交-滿意度函數(shù)法對秦艽黃酮和環(huán)烯醚萜苷的提取工藝進行分析，秦艽提取工藝影響因素大小順序為：乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比，最佳工藝組合為A2B3C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶30 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時間40 min。見表2—3。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析

2.7 驗證試驗按照上述最佳提取工藝，取秦艽藥材平行提取3 份。測定藥材中黃酮和環(huán)烯醚萜苷的含量，計算滿意度值。見表4。

表4 驗證試驗

3 討論

本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交-滿意度函數(shù)設(shè)計，優(yōu)化秦艽黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取工藝，考察乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時間對提取率的影響。結(jié)果顯示，乙醇濃度對秦艽黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取率的影響具有顯著性，提取溫度、料液比、提取時間也對提取率具有影響，通過正交-滿意度函數(shù)優(yōu)化得到的最佳工藝條件為乙醇濃度60%，料液比1∶30 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時間40 min。在此條件下，秦艽黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取的平均滿意度值為0.997。選用滿意度值作為評價指標(biāo)進行秦艽黃酮和環(huán)烯醚萜苷提取工藝優(yōu)選，可部分消除各因素間的交互影響，所得提取工藝參數(shù)更加可靠。