羅玉清，梁文菲，張 熙，譚梅鑫，劉錦清，夏藝菲，朱芙蓉，熊 武△

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007； 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院，廣東 東莞 523000；3 湖南省腦科醫(yī)院，湖南 長沙 410007； 4 湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410007；5 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208

糖尿病是一類由多種因素引起的以長期血糖濃度升高為主要特征的慢性代謝性疾病，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人民生活水平不斷提高，糖尿病發(fā)病率逐年升高，且趨于年輕化［1］。目前研究表明高糖能誘發(fā)一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對(duì)機(jī)體細(xì)胞造成損傷。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有高度增殖能力。有研究表明MSCs可在特定條件下誘導(dǎo)定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞并參與血管損傷部位的修復(fù)和再生，且能通過分泌肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)合成［2-3］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下MSCs 增殖、黏附、遷移和分泌等功能受損。黃芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）是中藥黃芪的主要活性成分，具有抗炎、促生長和抗應(yīng)激等功效［4-5］。劉海萌等［6］研究發(fā)現(xiàn)AS-IV可增強(qiáng)骨髓來源MSCs，修復(fù)大鼠腦缺血再灌注損傷功能。然而AS-IV 能否改善高糖受損MSCs 功能，目前尚不確定。本研究旨在探討AS-IV對(duì)高糖受損人臍帶血MSCs生物學(xué)功能及其分泌HGF的影響，為AS-IV用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品試劑黃芪甲苷（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S31401）；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：KGY002）；PBS 緩沖液、DMEM/F12 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司，批號(hào)：SH30256.01B、SH30023.01B）；胎牛血清、胰酶（美國GIBCO 公司，批號(hào)：10270-106、15050-057）；成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（美國Cyagen公司，批號(hào)：RASMD-90031、HUXMA-90021、HUXUB-90042）；茜素紅染液、油紅O 溶液（美國Sigma 公司，批號(hào)：130-22-3RT、O1391-250ML）；阿利新藍(lán)染液（中國MesGen 公司，批號(hào)：MAS0981）；Cell Counting Kit-8（日本同仁公司，批號(hào)：CK04）；HGF ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：JL10756）。

1.2 主要儀器XD-101 型CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）；5111918 型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國Thermo Fisher 公司）；BX51 型生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；5804 型臺(tái)式低速離心機(jī)、5415R型4 ℃離心機(jī)（德國Eppendorf Centrifuge公司）；WH-2型振蕩器（中國上海滬西分析儀器廠）；YXQ-LS-50 型立式壓力鍋（中國上海博訊公司）；101AS-3 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（中國上海圣欣公司）。

1.3 方法

1.3.1 hUCBMSCs 培養(yǎng) 無菌條件下取足月健康新生兒胎盤臍帶血10 mL（標(biāo)本采集獲產(chǎn)婦和家屬同意并簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：HN-LL-GZR-201902），加入肝素抗凝，室溫下靜置30～60 min，取1.077 g/mL淋巴細(xì)胞分離液5 mL加入15 mL離心管中，將10 mL細(xì)胞懸液（臍帶血與PBS 液1∶1 混合稀釋）緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液中。經(jīng)密度梯度離心后取單個(gè)核細(xì)胞，移入含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 天后傳代到第3 代凍存。將凍存的P3 代人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇后，移入培養(yǎng)皿中，標(biāo)明細(xì)胞名稱hUCBMSCs P4代，放入37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 hUCBMSCs 鑒定 將P4 代hUCBMSCs 凍存細(xì)胞復(fù)蘇，當(dāng)細(xì)胞融合到80%左右時(shí)，使用胰酶消化，接種到明膠包被的24 孔板，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合到60%～70%時(shí)，分別按照人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成軟骨、成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒說明書要求，將細(xì)胞移入相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長情況，分別用茜素紅、阿爾新藍(lán)及油紅O 染色以確定細(xì)胞成骨、成軟骨、成脂肪染色效果。在熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.3.3 高糖受損hUCBMSCs 模型建立 將鑒定成功的hUCBMSCs用30 mmo1/L的葡萄糖在DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)120 h，建立高糖受損hUCBMSCs 細(xì)胞模型。

1.3.4 黃芪甲苷最適濃度確定 將高糖受損hUCBMSCs 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞胰酶消化，離心收集制成細(xì)胞懸液并鋪在24 孔板上，分別加入濃度為0、50、100、200、300、400 mg/L 的AS-IV 進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)48 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，4 h 后參照CCK-8試劑盒說明書用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，并繪制增殖曲線圖以確定AS-IV 促hUCBMSCs增殖的最適濃度。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將高糖受損hUCBMSCs隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和模型組，實(shí)驗(yàn)組用最適濃度AS-IV干預(yù)，模型組用等體積PBS液處理。并設(shè)置正常組，即正常hUCBMSCs（將鑒定成功的hUCBMSCs在5.5 mmo1/L 葡萄糖DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h）用等體積PBS液處理。

1.4 高糖受損hUCBMSCs 增殖能力參照CCK-8試劑盒說明書，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，使用胰酶消化后，離心收集制成細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)組加入最適濃度AS-IV，模型組和正常組用等量PBS 液處理，48 h后各組均加入10 μL CCK-8溶液，4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在450 nm 處的吸光度。

1.5 高糖受損hUCBMSCs 黏附能力將各組hUCBMSCs 細(xì)胞懸液鋪在24 孔板上，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1 h，實(shí)驗(yàn)組加入最適濃度AS-IV干預(yù)，模型組和正常組用等量PBS液處理，培養(yǎng)8 h后將各組hUCBMSCs 接種在含有大鼠纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，37 ℃下靜置30 min，隨機(jī)取2 個(gè)200倍視野計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)目。

1.6 高糖受損hUCBMSCs 遷移能力實(shí)驗(yàn)器械消毒滅菌后，用馬克筆在6 孔板背后每隔1 cm 劃橫線一道，橫線需橫穿過孔，同時(shí)每孔至少穿過5 條橫線。取對(duì)數(shù)生長期的hUCBMSCs 置于孔中，每孔約加入5×105個(gè)hUCBMSCs細(xì)胞，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，再用無菌200 μL 槍頭在培養(yǎng)孔底部正中央劃一道痕跡，PBS液沖洗3次后去除脫落細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組加入最適濃度AS-IV，模型組和正常組用等量PBS 液處理，培養(yǎng)48 h 后在生物倒置顯微鏡（200 倍）下測(cè)量0 h 和48 h 的劃痕面愈合情況。用遷移寬度表示細(xì)胞遷移能力。

1.7 高糖受損hUCBMSCs 分泌HGF 含量參照ELISA試劑盒說明書，實(shí)驗(yàn)組加入最適濃度AS-IV，模型組和正常組用等量PBS液處理，48 h后取各組細(xì)胞上清液，在15 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的OD值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以xˉ±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hUCBMSCs 培養(yǎng)光學(xué)顯微鏡下P3 代細(xì)胞邊緣清晰，形態(tài)均一，排列整齊，呈典型的長梭狀結(jié)構(gòu)，排列呈漩渦狀。見圖1。

2.2 hUCBMSCs鑒定P4代hUCBMSCs成骨誘導(dǎo)分化后經(jīng)茜素紅染液染色呈紅色結(jié)節(jié)沉積，經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)分化后阿利新藍(lán)染液染色呈藍(lán)色，經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后油紅O 染液染色呈紅色，三者共同鑒定細(xì)胞為正常間充質(zhì)干細(xì)胞。見圖2。

圖2 hUCBMSCs成骨、成軟骨和成脂肪誘導(dǎo)分化情況（熒光鏡，×400）

2.3 不同濃度AS-IV 對(duì)高糖受損hUCBMSCs 增殖的影響當(dāng)AS-IV濃度在0～300 mg/L之間時(shí)，隨著AS-IV 濃度的增加，高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs 增殖OD 值逐漸增大，當(dāng)AS-IV 濃度為300 mg/L 時(shí)，OD 值最大。當(dāng)AS-IV 濃度為400 mg/L 時(shí)OD 值下降，隨后隨著AS-IV 濃度的增加增殖OD 值下降。因此，AS-IV 促高糖受損hUCBMSCs 增殖的最適合濃度是300 mg/L。見圖3。

2.4 最適濃度AS-IV 對(duì)高糖受損hUCBMSCs 生物學(xué)功能及分泌HGF 的影響與正常組相比，模型組高糖受損hUCBMSCs 增殖（OD 值）、細(xì)胞黏附數(shù)、細(xì)胞實(shí)際遷移寬度、分泌HGF 均下降（P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖（OD 值）、細(xì)胞黏附數(shù)、細(xì)胞實(shí)際遷移寬度、分泌HGF增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附數(shù)、細(xì)胞實(shí)際遷移寬度與HGF比較

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，存在于骨髓和其他組織器官中，可通過自我更新保持其細(xì)胞干性，因其具有高度增殖能力和多向分化潛能，是臨床干細(xì)胞療法中重要的細(xì)胞來源。目前研究表明在創(chuàng)傷修復(fù)方面，間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能向病變部位遷移并增殖分化成為成骨的種子細(xì)胞，直接參與損傷組織重建，而且能以旁分泌形式分泌大量生物活性因子間接參與修復(fù)［7］。有研究證實(shí)MSCs 可在體內(nèi)或體外，經(jīng)特定條件下誘導(dǎo)分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，從而參與血管損傷部位的修復(fù)和再生重建，并能通過分泌HGF 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移［8］。HGF 在1984 年由Nakanura 等學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)提出，它是一種多功能細(xì)胞因子，在全身各器官內(nèi)均有表達(dá)［9］。間充質(zhì)干細(xì)胞可通過旁分泌HGF 發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和抗凋亡等作用［10-12］。齊文文等研究表明，人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的HGF 可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡和損傷，從而起保護(hù)足細(xì)胞作用［13］。然而在高糖環(huán)境下，MSCs 的生物學(xué)功能和分泌功能受到不同程度抑制［14］。畢見海［15］報(bào)道經(jīng)高糖誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs 后，MSCs 的增殖、遷移、分化功能下降，細(xì)胞凋亡率上升。這與趙同平等［16］研究發(fā)現(xiàn)的高糖對(duì)MSCs 的增殖產(chǎn)生明顯抑制作用相吻合?？梢娙绾伪Ｗo(hù)高糖受損間充質(zhì)干細(xì)胞，恢復(fù)其生物學(xué)功能和分泌功能，是MSCs 對(duì)創(chuàng)傷組織發(fā)揮修復(fù)和再生重建作用的關(guān)鍵。

AS-IV 是黃芪中最主要的活性成分，具有抗炎［17］、抗氧化［18］、抗細(xì)胞凋亡［19］及促生長［20］等功能。而AS-IV具有誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化、促進(jìn)MSCs 增殖以及抑制其凋亡的作用。趙靜苗等［21］證實(shí)AS-IV 體外可誘導(dǎo)大鼠骨髓來源的MSCs 分化為心肌樣細(xì)胞。李鵬濤等［22］證實(shí)AS-IV可體外誘導(dǎo)小鼠骨髓來源的MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞，其機(jī)制可能與提高β-catenin 蛋白及其mRNA 的表達(dá)以及抑制Notch1 蛋白及其mRNA 表達(dá)有關(guān)。此外，何文涓等［23］證實(shí)一定濃度的AS-IV可使兔脂肪來源的MSCs 處于增殖期的細(xì)胞比例增加，處于靜止期的細(xì)胞比例減少。彭小娟等［24］證實(shí)一定濃度AS-IV 可以促進(jìn)人骨髓來源的MSCs增殖，其作用機(jī)制可能與AS-IV 促進(jìn)MSCs 對(duì)干細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子的mRNA 表達(dá)有關(guān)。黃燦等［25］證實(shí)AS-IV 可抑制無血清及缺氧誘導(dǎo)的MSCs 凋亡，其機(jī)制可能與抑制線粒體膜電位降低有關(guān)。然而，AS-IV 能否恢復(fù)高糖誘導(dǎo)損傷MSCs功能，目前尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究通過設(shè)計(jì)不同濃度梯度的AS-IV，干預(yù)高糖誘導(dǎo)損傷的人臍血MSCs，發(fā)現(xiàn)用300 mg/L AS-IV 處理高糖受損hUCBMSCs 促進(jìn)體外增殖效果最強(qiáng)。用300mg/L AS-IV干預(yù)高糖受損hUCBMSCs，發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境可導(dǎo)致hUCBMSCs 增殖、黏附、遷移和分泌HGF 功能下降，而AS-IV 對(duì)高糖受損hUCBMSCs 具有保護(hù)作用，即AS-IV 干預(yù)下高糖受損hUCBMSCs 增殖、黏附、遷移和分泌HGF 功能恢復(fù)，其生物學(xué)功能和分泌HGF 功能甚至可以超過正常水平，這與中藥活性成分AS-IV 具有的“促生長”作用相關(guān)?？梢夾S-IV 具有保護(hù)高糖誘導(dǎo)損傷的hUCBMSCs 的作用，然其具體作用機(jī)制不明，有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)為體外實(shí)驗(yàn)，仍存在一定局限性，需通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。