羅業(yè)浩，唐秀松，許棟涵，龐宇舟，李仁鋒

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)/壯醫(yī)方藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200；

2 澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，澳門特別行政區(qū) 999078；

3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)/壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200；

4 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種難治性免疫性疾病，臨床主要表現(xiàn)為侵蝕性、對稱性多關(guān)節(jié)炎損害［1-2］。流行病學(xué)資料顯示，RA的發(fā)病率女性和男性分別在70～74 歲和75～79歲年齡組最高，男女比例為1∶4，我國患病率為0.32%～0.36%［3］。RA 發(fā)生發(fā)展的生物過程復(fù)雜，確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為主要與遺傳因素、生活環(huán)境、細(xì)菌及病毒感染有關(guān)［4］。西醫(yī)針對RA的治療主要包括非甾體類抗炎藥、生物制劑及糖皮質(zhì)激素等。中醫(yī)近年來在RA 的治療中發(fā)揮了重要作用，中醫(yī)認(rèn)為RA 屬“痹癥”范疇，其主要病機(jī)是“外邪侵襲肢體，經(jīng)絡(luò)閉阻，不通則痛”，治療以“驅(qū)邪通絡(luò)”為主［5］，多使用具有祛風(fēng)除濕功效的藥物，這些藥物對緩解患者疼痛、改善患者生活質(zhì)量、延緩病情進(jìn)展等有重要作用，但具體作用機(jī)制尚不明確，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為分析藥物與疾病關(guān)聯(lián)性的有效工具，故本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索藥物與疾病之間的相互作用機(jī)制，有助于更好地了解藥物發(fā)揮治療作用的機(jī)理。

海桐皮Aralia chinensisL.又名鵲不踏、鳥不宿等，為豆科植物刺桐的干皮，為常用的中草藥，性溫，味微咸，入肝、心、腎3 經(jīng)，具有鎮(zhèn)痛消炎、祛風(fēng)行氣、祛濕活血之效，是治療風(fēng)濕痹痛的關(guān)鍵藥物之一，為臨床常用藥物［6］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［7-8］是一門新興學(xué)科，其原理是基于系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡闡釋疾病發(fā)生發(fā)展過程、從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認(rèn)識藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)新藥。本研究基于大數(shù)據(jù)平臺及計算機(jī)技術(shù)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理，探討海桐皮治療RA 的可能作用靶點(diǎn)及通路，為中藥挖掘提供思路。

1 研究方法

1.1 海桐皮藥物有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)收集以“海桐皮”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform ，TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中進(jìn)行檢索，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 進(jìn)行篩選，最終得到海桐皮的有效成分。導(dǎo)出海桐皮藥物相關(guān)靶點(diǎn)，最終得到海桐皮相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.2 RA 疾病數(shù)據(jù)收集以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞分別在人類基因數(shù)據(jù)庫（the human gene database，GeneCards）、Disgenet 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查找，物種來源選擇“Homo sapiens”，下載保存合并數(shù)據(jù)后去除重復(fù)基因，最終獲得RA 的相關(guān)疾病基因。

1.3 海桐皮相關(guān)靶點(diǎn)基因注釋運(yùn)用Perl腳本，以uniprot 蛋白數(shù)據(jù)庫為參照進(jìn)行海桐皮藥物相關(guān)靶點(diǎn)基因注釋，得到海桐皮相關(guān)藥物靶點(diǎn)基因。

1.4 海桐皮- RA 交集基因運(yùn)用R 軟件中的Venn Diagrams 程序包取RA 疾病基因和海桐皮藥物相關(guān)靶點(diǎn)基因的交集基因，繪制韋恩圖。

1.5 藥物-疾病作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將藥物-疾病交集基因運(yùn)用perl腳本進(jìn)行映射，獲得藥物-疾病之間相互作用的有效成分及相關(guān)基因靶點(diǎn)，隨后將所得有效成分及相關(guān)基因靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，展現(xiàn)藥物-有效成分-基因靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.6 海桐皮- RA 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用在線String網(wǎng)站（https：//string-db.org/）對藥物-疾病交集基因進(jìn)行藥物-疾病之間蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，篩選標(biāo)準(zhǔn)：檢測物種選擇人（Homo sapiens），置信值（medium confidence）取0.04，去除網(wǎng)絡(luò)中離散或無關(guān)聯(lián)的蛋白，最終得出海桐皮-RA 相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）利用R 軟件中的RSQLite、BiocManager、org.Hs.eg.db程序包處理所得交集基因，獲得交集基因的ID，將獲得的基因ID 再運(yùn)用R 軟件中的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview 程序包進(jìn)行GO 生物過程富集分析及KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 海桐皮有效成分最終獲得海桐皮有效成分6個，見表1。

2.2 海桐皮相關(guān)靶點(diǎn)基因注釋結(jié)果將海桐皮225 個相關(guān)靶點(diǎn)以Uniprot 數(shù)據(jù)庫作為篩選庫，對海桐皮相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行注釋，最終得到46 個藥物相關(guān)靶點(diǎn)基因，主要包括PTGS1、NOS2、MAPK14、GSK3B、SLC6A3等。

2.3 RA 疾病基因在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中找到RA 基因253 個，在Disgenet 數(shù)據(jù)庫找到RA 基因430個，去除重復(fù)基因，最后得到RA基因450個，這些基因主要有IL-6、HLA-DRB1、TNF、PTPN22、IL-10、STAT4、MIF、IL-2RA、IRF5、IL-1B、HLA-B等。

2.4 海桐皮藥物靶點(diǎn)基因與RA 疾病基因交集結(jié)果對“2.2”項所得46 個有關(guān)海桐皮藥物靶點(diǎn)基因與“2.3”項所得450 個RA 疾病基因運(yùn)用R×64 3.5.3 軟件進(jìn)行計算分析，結(jié)果得到14 個交集基因，分別為ADRA2B、ADRA1B、ADRB2、ADRA1D、NOS2、NR3C2、ADRA2A、SLC6A2、ADRB1、ADRA1A、ADRA2C、SLC6A4、DRD2、PPARG，繪制Venny圖，結(jié)果見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)基因Venny圖

2.5 藥物-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)將獲得的14 個交集基因運(yùn)用Perl 腳本處理后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，展現(xiàn)藥物、疾病、基因、分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 海桐皮主要活性成分-靶點(diǎn)-藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.6 海桐皮-RA蛋白互作網(wǎng)絡(luò)最終得出的相應(yīng)PPI網(wǎng)絡(luò)有13個節(jié)點(diǎn)，32條邊，平均每個節(jié)點(diǎn)的度為4.57，平均局部聚類系數(shù)為0.61，PPI enrichmentP＜1.0e-16，見圖3。

圖3 交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 海桐皮-RA 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心蛋白在海桐皮-RA 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，下載其string_interactions文件，并以tsv格式保存，運(yùn)用R×64 3.5.3 軟件繪制海桐皮在該網(wǎng)絡(luò)中核心蛋白條形圖，結(jié)果顯示ALB、IL-6、NOS3、VEGFA、FOS 等在該網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，見圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白條形圖

2.8 GO與KEGG將所得14個交集基因?qū)隦×64 3.5.3 軟件進(jìn)行GO 生物過程富集分析和KEGG 通路分析，結(jié)果顯示海桐皮治療RA 的主要生物過程包括了腎上腺素受體活性、G 蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、腎上腺素受體結(jié)合等過程，KEGG信號通路富集分析顯示主要涉及的信號通路包括了cGMP-PKG信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路及cAMP等信號通路等。GO分析結(jié)果見圖5，KEGG通路富集分析見圖6—8及表2。

圖5 GO富集分析條形圖

圖6 KEGG富集分析條形圖

圖7 cGMP-PKG信號通路圖

3 討論

RA 是一種慢性自身免疫性疾病，其特征性表現(xiàn)主要是進(jìn)行性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［9］。對于RA 的發(fā)病機(jī)制，目前研究認(rèn)為其主要與免疫紊亂、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)、遺傳因素及環(huán)境因素等有關(guān)［10-14］。在分子機(jī)制方面，認(rèn)為多種細(xì)胞因子如IL-B12、微小RNA（microRNAs，miRNA）、基因多態(tài)性及信號傳導(dǎo)通路在RA 的滑膜和骨質(zhì)破壞過程中發(fā)揮作用［15-21］。近年來，中醫(yī)藥在治療RA 中發(fā)揮重要作用，中藥對降低促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生及減輕患者疼痛與炎癥反應(yīng)有重要作用，對RA 具有治療作用［22-24］。海桐皮是臨床常用于治療風(fēng)濕痹痛的有效藥物，海桐皮中含有刺桐靈堿、氨基酸和有機(jī)酸等，由海桐皮組成的海桐皮湯化裁常用于治療骨關(guān)節(jié)炎、骨折等，對骨關(guān)節(jié)修復(fù)具有重要作用［25-27］。

本研究通過TCMSP 篩選得到海桐皮有效成分6 個，分別為赤蘚堿（Erythraline）、異巴巴膽（isobavachin）、豆甾醇（Stigmasterol）、赤蘚堿（Erysotrine）、菜豆蛋白（Phaseolin）、菜豆素（Phaseollidin）。其中赤蘚堿（Erythrina）屬的第一種化學(xué)物質(zhì)在1930 年被報道，其中分離出類胡蘿卜素，一種螺環(huán)狀生物堿，顯示出咖喱樣活性［28］，赤蘚堿生物堿通過調(diào)節(jié)煙堿樣受體對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要生物活性，其對疼痛、焦慮、失眠有良好調(diào)控作用［29-30］，雖然目前未見其治療RA的報道，但其治療疼痛的特性可能緩解RA 疼痛。豆甾醇又名豆固醇、甾醇屬植物甾醇，具有較強(qiáng)的生理活性和表面活性，可抗炎、抗氧化、抗癌、降膽固醇等［31］，CHEN等［32］研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，抑制軟骨降解。Erysotrine屬赤蘚堿類，赤蘚堿的mulungu 提取物能降低IL-4 和IL-5 水平，提高IL-13和干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）水平，表明其對炎癥治療有一定潛在價值。異巴巴膽、菜豆蛋白、菜豆素目前尚未見相關(guān)報道，可為進(jìn)一步研究海桐皮治療RA提供新方向。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)了14個海桐皮與RA的交集基因，通過STRING數(shù)據(jù)庫得出海桐皮治療RA的核心蛋白包括ALB、IL-6、NOS3、VEGFA、FOS、PPARG、NR3C1、CRP 等20 個核心基因，其中ALB 基因編碼是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)。該蛋白在調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓中起作用，并充當(dāng)多種內(nèi)源性分子（包括激素、脂肪酸和代謝產(chǎn)物）以及外源性藥物的載體蛋白。該蛋白還表現(xiàn)出廣泛底物特異性的酯酶樣活性。IL-6為在炎癥和B細(xì)胞成熟中起作用的細(xì)胞因子。另外，已證明編碼蛋白質(zhì)是患有自身免疫性疾病或感染者發(fā)燒的內(nèi)源熱原，該蛋白主要在急性和慢性炎癥部位產(chǎn)生，并通過IL-6受體α誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄炎癥反應(yīng)。有研究表明，IL-6 與RA有密切關(guān)系，參與了RA 骨破環(huán)、炎癥反應(yīng)等［33-34］。一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase，NOS3）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，在多種過程中充當(dāng)生物介質(zhì)，包括神經(jīng)傳遞以及抗微生物和抗腫瘤活性。NOS3 基因參與了抑制血管內(nèi)皮表面血小板和白細(xì)胞的黏附、聚集及血管平滑肌細(xì)胞增生［35］。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素受體活性、G 蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、兒茶酚胺結(jié)合等均參與了海桐皮治療RA 的過程，其中腎上腺受體作為聯(lián)系神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的重要受體，可能參與了對RA 的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)，介導(dǎo)了RA 的炎癥反應(yīng)過程及細(xì)胞凋亡過程［36-38］，G 蛋白偶聯(lián)的胺受體（G proteincoupled receptors，GPCRs）在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起重要作用，GPCRs家族包括β2腎上腺素受體、趨化因子受體，其中趨化因子在RA 致炎機(jī)制中一方面通過迅速刺激依賴凝集素的T淋巴細(xì)胞黏附，趨化特定的細(xì)胞到炎癥部位，導(dǎo)致免疫細(xì)胞穿過血管到達(dá)關(guān)節(jié)，另一方面通過其他生物功能調(diào)節(jié)因子，包括淋巴細(xì)胞活化、分化以及酶和細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞毒作用及其他起作用［39-41］。兒茶酚胺被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞或內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的神經(jīng)遞質(zhì)或激素，有研究表明，RA的炎癥機(jī)制與免疫細(xì)胞中內(nèi)源性兒茶酚胺的活性增強(qiáng)相關(guān)，并通過兒茶酚胺調(diào)控促炎性細(xì)胞或炎癥抑制細(xì)胞增殖與功能實(shí)現(xiàn)［42］。

cGMP-PKG 信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP 信號通路等同樣參與了海桐皮治療RA等生物過程，其中cGMP-PKG信號通路是指環(huán)鳥苷酸/蛋白激酶G 信號通路［43］，其主要功能與平滑肌松弛，抑制非選擇性離子通道的Ca2+電導(dǎo)率有關(guān)。神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號通路相關(guān)的受體和配體，與環(huán)境信息處理、信號分子與相互作用有關(guān)［44］，鈣信號通路在細(xì)胞存活、增殖、代謝中發(fā)揮重要作用，其作用機(jī)理為Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活各種Ca2+替代酶而產(chǎn)生作用［45-46］。研究發(fā)現(xiàn)，多種鈣通道對于破骨細(xì)胞的分化和功能必不可少，破骨細(xì)胞分化和功能的阻斷對抑制RA 骨破壞有效［47］。cAMP 信號通路又稱環(huán)磷酸腺苷信號通路，典型的cAMP 信號通路是由細(xì)胞外激動劑結(jié)合特異G 蛋白偶聯(lián)受體導(dǎo)致G 蛋白三聚體分解為G 蛋白α 亞單位和G 蛋白βγ亞單位，cAMP 與其調(diào)控亞單位結(jié)合釋放催化亞單位，催化亞單位進(jìn)一步磷酸化位于胞質(zhì)或胞核中的底物，包括酶、離子通道、染色體蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等［48］。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對海桐皮進(jìn)行化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫構(gòu)建、靶點(diǎn)預(yù)測、藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析GO生物過程和KEGG 通路富集分析，初步闡述了海桐皮治療RA的作用機(jī)制，但具體療效尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。