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        IL-15 轉(zhuǎn)染人CIK 細(xì)胞對(duì)HT-29 的殺瘤效果探究

        2023-11-18 16:16:32王柏濤梁宇堃王丙萍楊超旗高艷偉b
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞株細(xì)胞因子差異

        王柏濤,梁宇堃,王丙萍,楊超旗,高艷偉b

        作為較為多見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤, 結(jié)腸癌(colorectal cancer,CRC)的致死率已躍居癌癥死亡率前列[1],中國(guó)新近CRC 發(fā)病人數(shù)顯現(xiàn)迅速上漲態(tài)勢(shì)。當(dāng)前雖已對(duì)CRC 的發(fā)生發(fā)展及其浸潤(rùn)、 轉(zhuǎn)移機(jī)制有了一定認(rèn)知,但由于早期癥狀多不典型,大多發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期[2]。 手術(shù)、化學(xué)治療和放射治療為CRC 主要治療方式,但此類療法復(fù)發(fā)率及病死率較高,且預(yù)后差。 作為腫瘤治療的第4 種模式,免疫治療現(xiàn)已成為多數(shù)惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)療法[3],且過繼性細(xì)胞免疫療法已在治療某些血液系統(tǒng)疾病中獲得較好療效[4]。

        具備自然殺傷T 細(xì)胞表型特性,同時(shí)多細(xì)胞因子參與調(diào)控所致的細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷(cytokine-induced killer,CIK)細(xì)胞,多數(shù)學(xué)者基于其增殖速度、抗瘤殺瘤等方面的優(yōu)越性[5],CIK 療法已然變成腫瘤免疫學(xué)研究的關(guān)鍵所在。 白細(xì)胞介素(interleukin,IL)15(IL-15)已被證實(shí)可顯著增強(qiáng)CIK 細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性[6]。筆者實(shí)驗(yàn)對(duì)IL-15 基因(IL-15)轉(zhuǎn)染人CIK 細(xì)胞治療CRC 進(jìn)行初步探究,評(píng)估其對(duì)人CRC 細(xì)胞株HT-29細(xì)胞的殺傷效果。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)病毒、細(xì)胞與血液樣本

        攜帶IL-15的慢病毒上清液(GeneChem Company,中國(guó)上海)。

        人CRC 株HT-29 由內(nèi)蒙古自治區(qū)腫瘤研究所供給。

        靜脈采集健康成年人血液標(biāo)本15 mL。 取得患者知情同意并簽署知情同意書(編號(hào):20220709)。

        1.1.2 主要試劑

        達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)液 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)(Gibco, 美國(guó)); 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer,F(xiàn)ITC)-白細(xì)胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)3、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)-CD56、 鼠抗人FITC-IgG (BD, 美國(guó));GT-551(TaKaRa, 日本);KBM-551 培養(yǎng)液 (康寧生命,中國(guó));CD3 單抗(蘇州VANVO,中國(guó));干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)、IL-1α、IL-2(R & D,美國(guó)); CCK-8(北京沃比森,中國(guó));細(xì)胞因子IL-15、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IFN-γ 酶聯(lián)免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(BD,美國(guó))。

        1.1.3 儀器與設(shè)備

        離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿(Costar,美國(guó));FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD,美國(guó)) ;CO2培養(yǎng)箱(賽默飛,美國(guó));超凈臺(tái)(AIRTECH,中國(guó));熒光顯微鏡(徠卡,德國(guó));恒溫水浴鍋(RADOBIO,中國(guó));電子天平(METTLER TOLEDO,中國(guó));多量程移液器(Brand,德國(guó));-80 ℃超低溫冰箱(REVCO, 美國(guó)); 酶標(biāo)儀 (北京PERLONG,中國(guó))。

        1.2 方法

        1.2.1 CIK 細(xì)胞培養(yǎng)

        將血液標(biāo)本15 mL 用0.9%氯化鈉溶液(NaCl 溶液)稀釋至30 mL,與淋巴細(xì)胞分離液混合(混合比=1 ∶2.5)離心后制備成功外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。 培養(yǎng)液設(shè)為GT-551,濃度調(diào)至2 × 106/mL,依培養(yǎng)進(jìn)程,將IFN-γ、IL-1α、IL-2 等細(xì)胞因子及CD3 單抗加入后染色,觀察細(xì)胞形態(tài)。

        1.2.2IL-15轉(zhuǎn)染CIK 細(xì)胞

        取出購(gòu)買含IL-15的病毒上清液。將PBMC 制備的CIK 細(xì)胞培養(yǎng)5 d,細(xì)胞濃度更換為1×106/mL 后預(yù)備轉(zhuǎn)染。 CIK 細(xì)胞與含IL-15的慢病毒各1 mL 混合后重新懸浮。 在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育2 h。 之后按25 r/s 離心300 s。 后將上清液棄置,用KBM-551 重懸沉淀物。間隔1 d 用上述病毒的上清液,再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染。依據(jù)之前的步驟,將上清液按以往轉(zhuǎn)速再次離心300 s。 收集上清液置于-80 ℃冰箱備再次實(shí)驗(yàn)用。

        1.2.3 流式細(xì)胞檢測(cè)

        (1)CIK 細(xì)胞鑒定:培養(yǎng)3 ~4 d 后,CIK 細(xì)胞聚集成團(tuán)且集落形成;經(jīng)清洗、染色等步驟后,上機(jī)鑒定。

        (2)CIK 細(xì)胞感染效率鑒定:轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)2 d后,在光學(xué)顯微鏡下詳細(xì)觀察CIK 的感染效率。

        1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附分析

        分別提取IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞培養(yǎng)7、11、14 d 的上清液1 mL, 用ELISA 法檢測(cè)IL-15、IFN-γ 和TNF-α 的表達(dá)水平。 以未轉(zhuǎn)染的CIK 所培育出的上清液作參照。實(shí)驗(yàn)前將所有細(xì)胞的上清液冰上融化至液態(tài),同時(shí)將檢測(cè)試劑盒平衡至室溫,按照ELISA 細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒的說明進(jìn)行檢測(cè)操作。

        1.2.5 結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)

        將人CRC 細(xì)胞株HT-29 培養(yǎng)、傳代于DMEM 中(內(nèi)含10% FBS、100 μg/mL 青/鏈霉素)。

        1.2.6 CCK-8 法檢測(cè)IL-15-CIK 細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺瘤效果

        取培養(yǎng)24 h 的CRC 細(xì)胞作為靶細(xì)胞,取制備好的CIK 和IL-15-CIK 細(xì)胞用作測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞分為兩組,調(diào)整靶細(xì)胞濃度為5×103/孔,按效靶比(E∶T)5∶1、10∶1、20∶1、25∶1 混合后經(jīng)培養(yǎng)箱孵育1 d,每孔各添加15 μL 的CCK-8,酶標(biāo)儀測(cè)量出光密度(optical density,OD),并測(cè)算殺傷率。

        殺傷率(%)=[1-(研究組OD -效應(yīng)細(xì)胞OD)/靶細(xì)胞OD]×100%。

        1.2.7 殺瘤前后HT-29 細(xì)胞中細(xì)胞因子含量測(cè)定

        選連續(xù)培育14 d 效應(yīng)細(xì)胞。 收集E∶T 為25∶1時(shí)IL-15-CIK 及CIK 細(xì)胞對(duì)HT-29 細(xì)胞株作用前后的上清液各0.5 mL, 用ELISA 法檢測(cè)上清液內(nèi)IL-15、IFN-γ、TNF-α 含量變化。以未轉(zhuǎn)染的CIK 所培育出的上清液作參照。實(shí)驗(yàn)前將所有細(xì)胞的上清液冰上融化至液態(tài), 同時(shí)將檢測(cè)試劑盒平衡至室溫, 按照ELISA 法細(xì)胞因子(IL-15、IFN-γ、TNF-α)檢測(cè)試劑盒的說明進(jìn)行檢測(cè)操作。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析處理均選用SPSS 22.0 版本。 計(jì)數(shù)、計(jì)量資料分別以百分率(%)、均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示;組間比較依情況可選用F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 CIK 及轉(zhuǎn)基因CIK 細(xì)胞的鑒定

        取連續(xù)培養(yǎng)5 d 的CIK 細(xì)胞,在光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)觀察可見細(xì)胞增殖明顯,數(shù)目增多,胞體增大,形態(tài)漸趨飽滿,成團(tuán)簇狀分布,且形成集落(圖1);以鼠抗人IgG 為同型對(duì)照, 經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定為CIK 細(xì)胞(圖2);將培養(yǎng)5 d 的CIK 細(xì)胞,用含IL-15的慢病毒感染48 h 后, 倒置熒光顯微鏡鏡下觀察其明場(chǎng)圖和熒光圖,說明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型構(gòu)建成功(圖3)。

        圖1 培養(yǎng)第5 天CIK 細(xì)胞(200× )Fig.1 Image of CIK cells cultured for 5-day(200×)

        圖2 CIK 細(xì)胞鑒定流式圖Fig.2 Flow cytometry diagrams of CIK cell identification

        圖3 IL-15-CIK 細(xì)胞的明場(chǎng)圖(A)和熒光圖(B)(50×)Fig.3 Bright field diagram(A)and fluorescence image(B)of IL-15-CIK cells(50×)

        2.2 兩種效應(yīng)細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用比較

        CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示,E ∶T 為10 ∶1 時(shí),IL-15-CIK 細(xì)胞與CIK 細(xì)胞對(duì)CRC 靶細(xì)胞具有殺傷能力, 但殺傷活性相比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。隨著E ∶T 增加,殺傷活性逐漸增強(qiáng),CRC 細(xì)胞被IL-15-CIK 細(xì)胞及細(xì)胞CIK 細(xì)胞有效裂解。當(dāng)E ∶T 達(dá)到25 ∶1,IL-15-CIK 細(xì)胞與CIK 細(xì)胞對(duì)CRC 細(xì)胞的殺傷作用相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。 光學(xué)顯微鏡下對(duì)比觀察發(fā)現(xiàn),當(dāng)HT-29 被殺傷前,細(xì)胞呈良好貼壁狀態(tài)(圖4A);IL-15-CIK 細(xì)胞殺傷HT-29 細(xì)胞后,細(xì)胞貼壁狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為半貼壁,大量細(xì)胞死亡(圖4 B);CIK 細(xì)胞殺傷HT-29 細(xì)胞時(shí),細(xì)胞死亡數(shù)量明顯少于IL-15-CIK 細(xì)胞殺傷后 (圖4C)。 由此說明,IL-15-CIK 細(xì)胞對(duì)CRC 靶細(xì)胞的殺傷能力強(qiáng)于CIK 細(xì)胞。

        表1 不同E ∶T 下CRC 細(xì)胞的殺傷率比較Tab.1 Comparison of killing rate of CRC cells at different E ∶T

        圖4 HT-29 細(xì)胞殺瘤前后效果對(duì)比光學(xué)顯微鏡圖Fig.4 Image of optical microscopy of HT-29 cells before and after tumor-killing

        2.3 兩種細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌及其對(duì)HT-29 細(xì)胞株殺瘤時(shí)影響

        2.3.1 不同培養(yǎng)時(shí)間兩種細(xì)胞的細(xì)胞因子含量比較

        在IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞培養(yǎng)7 d、11 d、14 d中, 兩種細(xì)胞上清液中IL-15、IFN-γ 及TNF-α 的含量均隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而升高,并且可以觀察到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的3 種細(xì)胞因子含量顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,兩種細(xì)胞間差異明顯,兩種細(xì)胞間不同時(shí)間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 但在IL-15-CIK 細(xì)胞中觀察到,TNF-α含量在11 d 與14 d 內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余時(shí)間相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表2。

        表2 兩種細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間IL-15、IFN-γ、TNF-α 含量比較Tab.2 Comparison of IL-15,IFN-γ and TNF-α content at different culture time between 2 cell lines

        2.3.2 培養(yǎng)14 d 兩種細(xì)胞殺瘤前后細(xì)胞因子含量比較

        選體外培養(yǎng)14 d 的IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞以E ∶T=25 ∶1 對(duì)HT-29 細(xì)胞株作用后,檢測(cè)到兩種上清液中IL-15、IFN-γ、TNF-α 的含量較殺瘤前有所變化。在CIK 細(xì)胞中,IFN-γ 含量顯著變高,較殺瘤前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但I(xiàn)L-15、TNF-α 的含量雖有所增加, 但這種變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 在IL-15-CIK 細(xì)胞中,IL-15、IFN-γ、TNF-α含量均較殺瘤前明顯升高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 通過對(duì)比發(fā)現(xiàn),IL-15-CIK 細(xì)胞3 種細(xì)胞因子的含量與CIK 細(xì)胞相比,明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表3。

        表3 兩種細(xì)胞殺瘤前后細(xì)胞因子含量比較Tab.3 Comparison of cytokine content before and after tumor-killing between 2 cell line

        3 討論

        免疫治療是目前除傳統(tǒng)手術(shù)切除、放化療及靶向藥物外,最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤新興療法[7]。而從機(jī)體自身或其他機(jī)體提取出的免疫細(xì)胞,通過擴(kuò)增、基因工程改造等方式,重新返回機(jī)體,以期激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng),進(jìn)而發(fā)揮抗瘤作用的診療思路,意即過繼性細(xì)胞療法(adoptive cell therapy,ACT)。 此種療法已在臨床部分腫瘤中得到廣泛應(yīng)用[8]。 近年來發(fā)現(xiàn)CIK 細(xì)胞在增殖速度、抗瘤效果方面具備一定優(yōu)勢(shì),通過與相關(guān)細(xì)胞因子共同作用,從而提升其生物學(xué)屬性[9]。細(xì)胞因子參與調(diào)控免疫反應(yīng),扮演重要角色,對(duì)腫瘤的新興療法方面有遠(yuǎn)大前景。 IL 作為一組白細(xì)胞重點(diǎn)表達(dá)的細(xì)胞因子, 多數(shù)IL 家族因子關(guān)于抗瘤治療上凸顯關(guān)鍵[4]。 而經(jīng)基因工程改造的T 淋巴細(xì)胞,以IL-2 為節(jié)點(diǎn)。 近年來,因IL-15 對(duì)參與先天免疫和適應(yīng)性免疫的細(xì)胞具有廣泛的活性,被認(rèn)為是免疫基因治療的強(qiáng)有力的候選者[10]。 不僅與IL-2 的功能相似,且可抑制活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 (activation-induced cell death,AICD),減少細(xì)胞凋亡并增加T 細(xì)胞持久性,且毒性較小[11]。

        既往已證實(shí), 成功制備14 d 左右的CIK 細(xì)胞抗瘤效果達(dá)到頂峰。 該實(shí)驗(yàn)中, 筆者選用CIK 細(xì)胞和IL-15-CIK 細(xì)胞對(duì)CRC 細(xì)胞進(jìn)行殺傷活性檢測(cè),結(jié)果顯示當(dāng)效靶比為10 ∶1,IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞對(duì)CRC 細(xì)胞均具有殺傷能力, 表明IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞對(duì)CRC 均有一定的抑制能力。 但隨著E ∶T 比值的逐漸升高,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對(duì)CRC 的殺傷強(qiáng)度顯著強(qiáng)于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞, 同時(shí)也證明IL-15-CIK細(xì)胞擁有極為明顯的針對(duì)CRC 細(xì)胞株的殺傷特性。

        該實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明,TNF-α 等多種細(xì)胞因子可被效應(yīng)細(xì)胞自分泌生成。并且當(dāng)IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK細(xì)胞以E ∶T=25 ∶1 為限對(duì)HT-29 細(xì)胞進(jìn)行殺瘤實(shí)驗(yàn)后, 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-15、IFN-γ、TNF-α 較前均有所增加, 其中IL-15-CIK 細(xì)胞較CIK 細(xì)胞的細(xì)胞因子含量增加更明顯。 以上結(jié)果表示,當(dāng)CIK 細(xì)胞顯著增多后,不僅提升免疫屬性,更可分泌具備多種生物效能的細(xì)胞因子, 且IL-15-CIK 細(xì)胞較CIK 細(xì)胞在同等時(shí)間條件下的殺瘤作用更強(qiáng)。同時(shí)細(xì)胞因子參與抗瘤后各自發(fā)揮其功能。 而由CD4+、 CD8+生成的IFN-γ 可對(duì)同種生物進(jìn)行廣泛調(diào)節(jié)。它能使細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)的生物活性,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化和對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[12]。 作為細(xì)胞免疫的關(guān)鍵參與者,主要通過抑制腫瘤細(xì)胞的分裂、增殖,從而發(fā)揮抗瘤作用[13]。 多數(shù)通過調(diào)節(jié)引起相關(guān)細(xì)胞死亡的TNF-α[14],主要源于巨噬細(xì)胞。 可直接作用于腫瘤細(xì)胞,阻抑腫瘤的形成[15]。

        4 結(jié)論

        綜上所述, 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因CIK 細(xì)胞在體外展現(xiàn)了較好的腫瘤殺傷活性,然而其在動(dòng)物體內(nèi)或是腫瘤患者體內(nèi)是否能夠真正發(fā)揮出良好的抗腫瘤特性,有待動(dòng)物和臨床試驗(yàn)的再論證。

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