路 英，王 霞

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中國(guó)常見的肝臟惡性原發(fā)腫瘤，復(fù)發(fā)率高[1]。盡管近年來(lái)多種治療手段的提高在一定程度上提高了患者的預(yù)后，但疾病的死亡率仍然較高，因此如何評(píng)估患者預(yù)后至關(guān)重要。 肝臟超聲造影檢查具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，可用于評(píng)估肝癌診斷、進(jìn)展及治療效果等[2]。miR-30a 是與HCC 密切相關(guān)的microRNAs （mi RNAs），研究發(fā)現(xiàn)[3～5]，miR-30a 肝癌組織中低表達(dá)，可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，提示其在HCC 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 如何利用超聲造影方法間接分析HCC 的預(yù)后因子， 并尋找它們之間的相關(guān)性是研究的熱點(diǎn)。 筆者對(duì)HCC 患者進(jìn)行了超聲造影檢查及外周血miR-30a 水平檢測(cè)， 并探索兩者關(guān)系，希望為HCC 預(yù)后評(píng)估提供新方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

研究采用雙盲法。 選擇2019 年1 月至2021 年8月在新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)治療的100 例HCC 患者（HCC 組），其中男性74 例，女性26 例；年齡32 ～78 歲，平均年齡58.24 歲（標(biāo)準(zhǔn)差4.92 歲）；腫瘤數(shù)量，1 個(gè)67 例，≥2 個(gè)23 例；直徑3.1 cm（標(biāo)準(zhǔn)差0.23 cm）。

選擇標(biāo)準(zhǔn)： ①符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》[6]，病理、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等明確診斷；②均首次治療，術(shù)前無(wú)放化療；③臨床資料完整；④患者及家屬知情同意，醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝臟其他疾??；②合并其他組織器官腫瘤；③嚴(yán)重心肝腎功能不全者；④血液、免疫系統(tǒng)疾病。

選取同期50 例健康人群（對(duì)照組），其中男性35例，女性15 例；年齡30 ～71 歲，平均年齡56.24 歲（標(biāo)準(zhǔn)差12.32 歲）。

選擇標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎功能正常；②均獲得知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：組織器官腫瘤者。

兩組性別、 年齡比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查

采用美國(guó)Philips 公司EPIQ7 彩色多普勒超聲儀（中國(guó)江蘇）進(jìn)行檢查，探頭頻率3.5 ～5.0 MHz。 使用Bracco 公司研制的SonoVue 造影劑。 患者仰臥于檢查床，對(duì)肝臟常規(guī)檢查，包括腫瘤位置、大小、數(shù)量、邊界、內(nèi)部回聲、血流信號(hào)及周圍組織結(jié)構(gòu)。 用0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）溶解SonoVue，混勻后由肘部靜脈注入，再用0.9 %氯化鈉溶液（生理鹽水）沖管，記錄4 min 內(nèi)腫瘤內(nèi)部增強(qiáng)及消退特征。 將結(jié)果進(jìn)行時(shí)間-強(qiáng)度曲線分析，記錄始增時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、峰值加速時(shí)間、始增速度及增強(qiáng)速度。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)血漿miR-30a 表達(dá)

所有患者的血樣在入院后24 h 內(nèi)采集， 對(duì)照組血樣在登記時(shí)采集。 所有血樣在4 °C、1 600 g 條件下離心10 min。 隨后，將上清液轉(zhuǎn)移到Eppendorf 管中，于4°C、12 000 g 條件下離心10 min。 保留血漿并儲(chǔ)存在-80°C 冰箱中。 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測(cè)miR-30a 在血漿中的含量。 使用PureZOL RNA分離試劑（Bio-Rad）從血漿中提取總RNA。 使用RTPCR Quick Master Mix（Toyobo）進(jìn)行cDNA 的反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（Toyobo）進(jìn)行qPCR，miR-30a 的相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt表示，內(nèi)參為U6。

引物序列：miR-30a 上游序列，5′-ACACACTCCAGCTGGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，下游序列，5′-TGTCGTGGAGTCGGAATTC-3′；U6 上游序列，5′-CTCGCTTCGGAGCACATACTA-3′，下游序列，5′-ACGAATTTGTGTCATCCTGC-3′。

根據(jù)miR-30a 中位數(shù)將患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。

1.2.3 觀察指標(biāo)

HCC 病灶及癌旁組織超聲造影特征；HCC 組及對(duì)照組血漿miR-30a 水平；miR-30a 表達(dá)水平與超聲造影特征的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 24.0 軟件（IBM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用GraphPad Prism7.01 軟件繪制圖。 使用分位數(shù)圖（Q-Q 圖）檢查連續(xù)變量的正態(tài)性，正態(tài)或近似正態(tài)分布計(jì)量資料用均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間采用t檢驗(yàn)比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌與癌旁組織超聲造影特征比較

HCC 病灶的始增時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、峰值加速時(shí)間均低于癌旁組織，始增速度和增強(qiáng)速率均高于癌旁組織（均P＜0.05）。 見圖1、表1。

表1 HCC 與癌旁組織超聲造影指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of contrast-enhanced ultrasound indexes between HCC and adjacent tissues

圖1 HCC 典型超聲造影圖像Fig.1 Typical contrast-enhanced ultrasound images of HCC

2.2 肝細(xì)胞癌患者與健康人血漿miR-30a 水平比較

HCC 組患者血漿miR-30a 水平（0.12±0.03）低于對(duì)照組（0.28±0.04），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.945，P=0.000）。

2.3 不同miR-30a 表達(dá)水平患者超聲造影特征

根據(jù)miR-30a 中位數(shù)將患者分為低表達(dá)組（43例）和高表達(dá)組（57 例）。 低表達(dá)組患者始增時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、 峰值加速時(shí)間均低于高表達(dá)組， 始增速度和增強(qiáng)速率均高于高表達(dá)組（均P＜0.05）。 見表2。

表2 不同miR-30a 表達(dá)水平患者超聲造影特征比較Tab.2 Comparison of contrast-enhanced ultrasound features in patients with different miR-30a expression levels

3 討論

HCC 是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，預(yù)后差。 腫瘤組織內(nèi)大量新生血管為腫瘤的生長(zhǎng)供給了豐富營(yíng)養(yǎng)，因此全方位評(píng)估腫瘤內(nèi)部血液供應(yīng)情況及腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制， 不但可以用于評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度，還可以為其臨床治療提供新的方法和思路。

超聲造影檢查是近年來(lái)新型發(fā)展的超聲檢查技術(shù)，通過(guò)對(duì)患者的局部病灶部位血管造影，進(jìn)而對(duì)患者的血流情況進(jìn)行分析，為患者的病理狀態(tài)及惡性生物學(xué)能力進(jìn)行評(píng)估[7～9]。 原發(fā)性肝癌的生長(zhǎng)發(fā)育主要以浸潤(rùn)性生長(zhǎng)為主，所以在病理學(xué)中，生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要大量養(yǎng)分，血管較為豐富，容易對(duì)周邊組織造成壓迫。超聲造影通過(guò)將造影劑注射到病灶局部血管內(nèi)，分析病灶血流情況，從而對(duì)病灶病理狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。始增時(shí)間與病灶區(qū)域血管的通暢性及血管壓力有關(guān)，峰值時(shí)間與病灶區(qū)血管通暢性及側(cè)支循環(huán)能力有關(guān)。 有文獻(xiàn)報(bào)道[10]，HCC 分化程度越低，造影增強(qiáng)消退越快。 冉琪等研究同樣發(fā)現(xiàn)[11]，HCC 超聲造影參數(shù)與腫瘤病理特征、 患者預(yù)后有關(guān)。 筆者研究結(jié)果顯示，HCC 區(qū)域始增時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、峰值加速時(shí)間均低于正常肝組織， 始增速度和增強(qiáng)速率均高于癌旁組織，提示HCC 組織內(nèi)新生血管豐富，管徑粗、阻力小，造影劑進(jìn)入血管的速度更快，與劉軾初等[12]研究結(jié)果一致，如HCC 病灶的始增時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、峰值加速時(shí)間均小于病灶周圍背景肝組織，病灶始增速度和增強(qiáng)速率均大于病灶周圍背景肝組織。隨著腫瘤細(xì)胞增殖能力的增加，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求逐漸增加，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部新生血管數(shù)量增加，血管畸形率升高，在超聲造影特征上表現(xiàn)為腫瘤區(qū)域內(nèi)部血流量增加、流速升高。 此外，HCC 組織內(nèi)存在大量動(dòng)靜脈短路， 導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血流量增大，流速增快。

miRNAs 是一類長(zhǎng)度約為18 ～25 nt 的非編碼調(diào)控RNA， 在腫瘤惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。miR-30a 是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNAs， 在多種腫瘤組織中低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[13～15]。有文獻(xiàn)報(bào)道[16]，過(guò)表達(dá)miR-30a 可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力。 另外研究發(fā)現(xiàn)[17]，miR-30a 在肝癌組織中低表達(dá)，與腫瘤分期、分化程度及預(yù)后有關(guān)。筆者研究結(jié)果顯示，HCC 患者血漿miR-30a 水平低于健康人群，這與Yang X 等[17]研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步佐證了miR-30a 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用。 超聲造影可以對(duì)病灶內(nèi)部血流情況進(jìn)行定量分析，真實(shí)評(píng)估病灶血流狀態(tài)。腫瘤內(nèi)部豐富血流可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而腫瘤細(xì)胞增殖受miR-30a 調(diào)控。但HCC 超聲造影參數(shù)與miR-30a 表達(dá)水平的關(guān)系是否相關(guān)目前尚不清楚。筆者研究結(jié)果顯示，低表達(dá)組患者始增時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、峰值加速時(shí)間均低于高表達(dá)組，始增速度和增強(qiáng)速率均高于高表達(dá)組， 提示HCC 腫瘤組織的血流狀態(tài)與miR-30a 表達(dá)調(diào)控有關(guān)，隨著HCC 腫瘤組織內(nèi)血供增多， 流速增快，miR-30a 表達(dá)水平也增加，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性行為。

綜上所述， 超聲造影可以準(zhǔn)確評(píng)估HCC 腫瘤組織血流狀態(tài)， 其血流參數(shù)與miR-30a 表達(dá)水平有關(guān)，可為間接反映miR-30a 水平提供新思路。