陳 景，邱 敏，張海鵬，李慧麗，張夢珍，李曉紅

心肌梗死引起大量的心肌細胞死亡而導致的充血性心力衰竭是心血管疾病的主要死因。日新月異的臨床治療方案尚未能從根本上徹底解決心肌損傷后不能再生的難題。大量研究[1～3]表明，多種類型的干細胞均有心肌分化的潛力。干細胞向心肌分化取得了一定的成果， 但目前常用的分化試劑價格非常高昂，成分復雜，在一定限度上制約了心肌分化研究的臨床轉化。L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，VitC）是一種價格便宜且容易獲得的維生素， 筆者通過探討VitC 在人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，hESC）心肌分化中的作用，明確其達到最大分化效率時的最佳濃度，得到成分明確且高效心肌分化試劑， 以利于將來大規(guī)模臨床推廣運用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞

hESC 來源于北京賽貝公司。

1.1.2 主要試劑

人干細胞復蘇培養(yǎng)液、人干細胞培養(yǎng)液（E8）、消化液乙二胺四乙酸 （ethylenedinitrilotetraacetic acid，EDTA）（北京賽貝公司，中國）。

VitC、6-((2-((4-(2，4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)煙腈三鹽酸鹽（6-((2-((4-(2，4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1Himidazol-2-yl)pyrimidin-2-yl)amino)ethyl)amino)nicotinonitrile trihydrochloride，Chir99021）、 二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、含4，6-二氨基-2-苯基吲哚 （4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI） 封片劑（Sigma， 美國）；N-（6-甲基苯并[d] 噻唑-2-基）-2-（（4-氧代-3-苯基-3，4，6，7-四氫噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基）硫基）乙酰胺（N-（6-methyl-1，3-benzothiazol-2-yl）-2-（（4-oxo-3-phenyl-6，7-dihydrothieno[3，2 -d]pyrimidin -2 -yl）sulfanyl）acetamide，IWP -2）（Selleck，美國）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、RPMI 1640 培養(yǎng)液、B27（Gibco，美國）；低生長因子 （growth factor reduced，GFR） 基質膠（Corning， 美國）；RNA 提取試劑Trizol、Alexa Fluro 488 標記的山羊抗兔和Alexa Fluro 594 標記的山羊抗鼠熒光二抗（Invertogen，美國）；一抗Nanog、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin T，cTnT）和心臟特異性同源盒轉錄因子 （Nk2 homeobox 5，Nkx2.5）（1 ∶50） 抗體（Abcam， 美國）；PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time） 試劑與TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑（Takara，中國）。 引物合成由英濰捷基公司完成（序列見實驗方法）。

1.1.3 儀器設備

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo forma 3111，美國）；超凈工作臺（SW-CJ-1FD，中國）；倒置相差顯微鏡（Leica DMil，美國）；正置熒光顯微鏡（Nikon 88i，德國）；小型冷凍臺式離心機（Eppenddorf，德國）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應 （real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀（AppliedB-biosystems ViVA7，美國）；梯度PCR 儀（LIFE SimpliAmp，新加坡）；普通冰箱（海爾，中國）；超低溫冰箱（Thermo forma，美國）；液氮罐（Thermo Electron，美國）；多功能酶標儀（Multiskan GO，美國）；電子分析天平（電子JA 1003，中國）；制冰機（SIM-F104AY65，日本）；漩渦振蕩器（Thermo fisher Maxi MIX II，美國）；風熱式電熱干燥箱（GNP-9080，中國）；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3780 SANYO，日本）；電動移液槍（Brand，德國）；手持移液器（Eppenddorf，德國）

1.2 方法

1.2.1 干細胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出1 支凍存的hESC，在37 ℃水浴鍋內左右搖晃使其迅速融化； 加入到含有3 mL 人干細胞復蘇培養(yǎng)液的離心管中， 于200 g 條件下離心5 min，吸去上清液；加入5 mL 復蘇培養(yǎng)液，重懸后加到預先用GFR（1 ∶100）包被好的培養(yǎng)瓶中，48 h 后換E8 培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞密度為70%～80%時用EDTA 消化后以團塊傳代。

1.2.2 誘導與分化

待hESC 培養(yǎng)至90 %匯合度后， 分別在RPMI 1640 中加入0、10、20、30、40、50、60、70 μmol/L VitC的基礎培養(yǎng)液，用帶有聯(lián)合Chir99021（6 μmol/L）進行誘導分化，2 d 后將Chir99021 替換成Wnt 信號抑制劑IWP-2（5 μmol/L），與不同濃度的VitC 聯(lián)合進行誘導分化，2 d 后再更換為2 % B27 與不同濃度VitC 聯(lián)合誘導，并隔天換液維持。

1.2.3 光學顯微鏡觀察

hESC 加入誘導分化培養(yǎng)液后， 每天在光學顯微鏡下觀察細胞的分化狀態(tài)， 觀察不同濃度VitC 對分化效果的影響，并記錄下自發(fā)跳動心肌細胞出現(xiàn)的最早時間，對出現(xiàn)跳動的區(qū)域進行顯微錄像。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測各基因的表達

分別收集誘導分化后第0 天、第2 天、第4 天、第6 天、第8 天和第10 天的心肌細胞，用Trizol 裂解法提取總RNA。 用PrimeScriptTMRT reagent Kit 進行反轉錄， 得到cDNA 模板。 使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒在實時熒光定量PCR 儀ABI VIVA7進行，擴增基因：同源盒轉錄因子基因（homeobox protein gene，Nanog）， 性別決定因子同源盒2 基因（sex determining region Y-box2 gene，Sox2），心肌肌鈣蛋白T 基因（cardiac troponin T gene，cTnT），心臟特異性同源盒轉錄因子基因（Nk2 homeobox 5 jene，Nkx2.5），甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參。

相關基因引物序列：Nanog正向5′-CAATGGTGTGACGCAGAAGG-3′， 反向5′-GAAGGTTCCCAGT -CGGGTTC-3′；SOX2正向5′-AGAGAAAACCTGG -GAGGGT-3′，反向5′-GCAAAGCTCCTACCGTACCA-3′；cTnT正向5′-GACAGAGCGGAAAAGTGGGA-3′，反向5′-CTCCTTGGCCTTCTCCCTCA-3′；Nkx2.5正向5′-CAAGTGTGCGTCTGCCTTTC-3′， 反向5′-CG CACAGCTCTTTCTTTTCGG-3′；GAPDH正向5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2.5 免疫熒光

在鋪有蓋玻片的24 孔板中接種hESC，待其長至80%進行誘導分化。 在誘導分化后第0 天、第2 天、第4 天、第6 天、第8 天和第10 天收集細胞，用新鮮配制的4%多聚甲醛溶液固定細胞20 min，1 X PBS洗3 遍，每次5 min。 用0.2 % Triton X-100（PBS 配制）對細胞通透化處理20 min，1 X PBS 洗3 遍，每次5 min。 4%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA） 封閉45 min。 加入一抗Nanog、cTnT 和Nkx2.5（1 ∶50），4 ℃條件下孵育過夜，PBS 洗3 遍，每次5 min。加入Alexa Fluro 488 標記的山羊抗兔和Alexa Fluro 594 標記的山羊抗鼠熒光二抗，室溫避光孵育1 h，用PBS 洗3 遍，每次5 min。 加入含DAPI 封片劑，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

計量資料以均數(shù)± 標準差表示， 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行處理。多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）， 組間比較采用Dunnettt或LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人胚胎干細胞的細胞形態(tài)及鑒定

hESC 呈克隆樣生長，團塊邊緣整齊，胞核大，細胞間排列緊密，細胞間界限不清（圖1A）。免疫熒光染色鑒定干細胞標志物Nanog 為強陽性（圖1B。綠色為Nanog，藍色為細胞核）。

圖1 hESC 的形態(tài)和標志蛋白Nanog 的檢測Fig.1 Images of hESC morphology and marker protein Nanog dection

2.2 人胚胎干細胞在不同濃度VitC 誘導下的觀察

hESC 分化第3 天，在沒有VitC 的培養(yǎng)液中開始發(fā)生大面積的脫落死亡（圖2A）；隨著VitC 濃度的逐漸增加， 細胞貼壁的數(shù)量越來越多 （圖2B、2C），到VitC 濃度為30 μmol/L 時，細胞已可維持正常生長并開始出現(xiàn)小規(guī)?？寺F塊 （圖2D）； 這種現(xiàn)象隨著VitC 濃度的增加而增多（圖2E、F），并逐漸演變?yōu)榇竺娣e的克隆樣生長團塊（圖2G、H）。

圖2 hESC 向心肌分化第3 天不同濃度VitC 的影響光學顯微鏡觀察（標尺=200 μm）Fig.2 Images of different concentration of VitC on 3rd day of hESC differentiation into cardiomyocytes by optical microscope(scale bar =200 μm)

2.3 人胚胎干細胞在VitC 濃度為40 ～70 μmol/L誘導下的觀察

hESC 分化第8 天，出現(xiàn)自發(fā)跳動的細胞團。在VitC 40、50 μmol/L 濃度組可見某些細胞團連成片呈波浪樣跳動（圖3A、B），當VitC 濃度增加到60、70μmol/L 后，搏動的細胞團塊變少，搏動的頻率也越來越低（圖3C、D）。

圖3 不同濃度VitC 對第8 天心肌細胞搏動的影響（標尺=200 μm）Fig.3 Images of different VitC concentrations on cardiomyocytes beating at 8-day(scale bar=200 μm)

2.4 心肌細胞的鑒定

2.4.1 誘導后細胞的形態(tài)學變化

細胞出現(xiàn)明顯的肌絲，相鄰細胞互相融合成網狀結構（圖4A），細胞與細胞之間重疊融合形成“竹節(jié)狀”肌節(jié)（圖4B）。

圖4 光學顯微鏡下分化的心肌樣細胞形態(tài)（標尺=200 μm）Fig.4 Images of differentiated cardiomyocyte-like cells morphology by optical microscope(scale bar=200 μm)

2.4.2 誘導后細胞Nanog、Sox2、cTnT 和Nkx2.5 mRNA的表達

以VitC 40、50、60、70 μmol/L 濃度誘導hESC 進行分組，各組內參GAPDH為恒定的表達，Nanog、Sox2、cTnT 和Nkx2.5 mRNA 均呈現(xiàn)單一的溶解峰，說明各引物的特異性良好， 無非特異性擴增和引物二聚體干擾。VitC 誘導后，與不使用VitC 組相比，hESC 標志物Nanog mRNA 在第2 天出現(xiàn)短暫而輕微的升高，50 μmol/L 組與60 μmol/L 組、70 μmol/L 組差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009、0.017）；隨著分化時間的延長，Nanog mRNA 表達量逐漸下降，至分化第10 天時候，40μmol/L組與60 μmol/L 組和70 μmol/L 組相比， 差異具有統(tǒng)計學意義 （P= 0.013、0.027）；Sox2 mRNA 在各誘導組均表達下降， 而50 μmol/L 組在第6 天出現(xiàn)Sox2 mRNA 陡然升高，原因尚不清楚，其余時間點均呈下降趨勢；在分化第8 天時，40 μmol/L 組與60 μmol/L組相比有明顯變化（P=0.044）。相比對照組和VitC 其他濃度組，心肌標志物cTnT mRNA 在分化第8 天時40 μmol/L 組與其他3 組相比， 表達明顯升高 （P=0.047、0.023、0.024），至分化第10 天時，40 μmol/L 組與60 μmol/L 組和70 μmol/L 組差異依舊明顯（P=0.031、0.022）， 而40 μmol/L 組與50 μmol/L 組、 60 μmol/L組與70 μmol/L 組組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。心臟轉錄因子Nkx2.5 mRNA 在第10 天的表達，則表明40、50 μmol/L 組與60、70 μmol/L 組差異有顯著統(tǒng)計學意義（P=0.001、0.001），40 μmol/L 組與50 μmol/L組組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見圖5。

圖5 不同濃度組VitC 誘導hESC 分化為心肌細胞內Nanog、Sox2、CTnT 和Nkx2.5 mRNA 的表達柱狀圖Fig.5 Histograms of Nanog，Sox2，CTnT and Nkx2.5 mRNA expression in cardiomyocytes induced by different concentrations of VitC

2.4.3 免疫熒光鑒定

免疫熒光法檢測顯示VitC 濃度為40 μmol/L 組和50 μmol/L 組分化得到的心肌樣細胞與對照組（VitC 濃度0 μmol/L） 相比低表達干細胞的特異性標志物Nanog， 其熒光強度差異有顯著統(tǒng)計學意義（5.469 7 ± 0.466 1、10.161 3 ± 0.940 2vs12.816 3 ±0.489 3。P= 0.007、0.006）， 而40 μmol/L 組與50 μmol/L 組組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 心肌特異性標志物cTnT 表達的對照組與40 μmol/L 組相比，熒光強度差異有顯著統(tǒng)計學意義 （7.680 3±2.052 1vs20.543 0±2.052 4。P=0.004），而40 μmol/L 組與50 μmol/L 組組間差異也有統(tǒng)計學意義 （20.543 0 ±2.052 4vs10.472 0±0.577 4。P=0.02）。 Nkx2.5 的表達， 與對照組相比， 無論是40 μmol/L 組還是50 μmol/L 組，其熒光強度差異均有顯著統(tǒng)計學意義（24.529 3 ± 1.974 3、26.093 3 ± 2.078 2vs11.057 7 ±0.772 4。P=0.007、0.006），而40 μmol/L 組與50 μmol/L組組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見圖6 ～8。

圖6 免疫熒光檢測心肌樣細胞Nanog（標尺=100 μm）Fig.6 Immunofluorescence staining images of Nanog in cardiac-like cells(scale bar=100 μm)

圖7 免疫熒光檢測心肌樣細胞cTnT（標尺=100 μm）Fig.7 Immunofluorescence staining images of cTnT in cardiac-like cells(scale bar=100 μm)

圖8 免疫熒光檢測心肌樣細胞Nkx2.5（標尺=100 μm）Fig.8 Immunofluorescence staining images of Nkx2.5 in cardiac-like cells(scale bar=100 μm)

3 討論

迄今為止， 研究干細胞向心肌分化已發(fā)展將近20 年。 2001 年Kehat I 及其同事[4]首次報道一種通過擬胚體（embryoid body，EB）來分化心肌細胞的方法，但該方法心肌分化效率非常低，只有不到8.1%的細胞能成功轉化為跳動的心肌細胞。后來科學家們利用細胞因子激活素A（cytokine activin A，Activin A）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）對干細胞進行分化，相比EB 法，這種分化方式具有更高的效率，但該方法僅能在某些人類多能干細胞系中起作用[5]，且細胞因子高昂的價格也阻滯了它的發(fā)展運用。 后續(xù)有研究者發(fā)現(xiàn)Wnt/β-Catenin 信號傳導抑制劑能進一步更有效誘導胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）向心肌細胞分化[6～8]。 也有的研究采用病毒過表達轉錄因子、細胞因子或者microRNA 等進行心肌的誘導分化[9～11]。而從多種多樣的誘導方案中，積極尋找高效、簡便的誘導分化劑成為目前人們關注的焦點。

抗壞血酸也稱維生素C（VitC），是一種人類無法自身合成、只能通過食物攝取的必需營養(yǎng)素。 一方面VitC 是許多酶的重要輔助因子， 它能通過調節(jié)DNA的合成和組蛋白羥化酶的活性來修改干細胞的表觀遺傳學/基因表達譜， 從而影響細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的穩(wěn)態(tài)[12]，也能通過DNA 甲基化、轉錄譜和能量代謝影響ESC 的多能性[13]。 另一方面VitC 對干細胞增殖和分化也具有重要影響。 VitC 能通過增強γδ T 細胞的增殖和效應子功能影響T 細胞的分化[14]，也可刺激人牙髓干細胞（human deciduous pulp stem cell，HDPSC） 體外增殖及激活分化潛能[15]，還可促進精原干細胞增殖和降低其活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生[16]。 有研究發(fā)現(xiàn)，VitC 不僅能通過促進膠原蛋白合成，促使誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）/hESC 來源的神經上皮樣干細胞的生成和分化[17]，還能增加高表達蛋白TRF1 的誘導性多能干細胞 （induced pluripotent stem cells with high expression of the shelterin-complex protein TRF1，iPSChighT） 分化的心肌細胞數(shù)量[18]。Choi SC 等[19]利用成纖維細胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF4）和VitC 分化hESC 來源的心肌細胞成功建立一種體外缺氧應激模型。 而Perino MG等[20]則認為VitC 可能是通過激活母親DPP 同源物1（果蠅）[mothers against DPP homolog 1（Drosophila），SMAD1]通路促進ESC 向心肌細胞分化。

筆者的研究在已有的誘導分化方案上進行簡化，采用分化效果明確的化學小分子化合物Chir99021及IWP-2 聯(lián)合不同濃度的VitC，探索在ESC 的心肌誘導方案中VitC 是否必須及發(fā)揮作用最合適的濃度范圍。

筆者研究將hESC 培養(yǎng)到90%時，分別用含有不同濃度VitC 序貫聯(lián)合化學小分子Chir99021 及IWP-2 進行分化培養(yǎng)，在分化過程中發(fā)現(xiàn)不含VitC 的培養(yǎng)組細胞大面積死亡，隨著VitC 濃度逐漸增高，細胞死亡數(shù)量逐漸下降。這表明VitC 是這個誘導分化組合中不可或缺的因子。 研究結果顯示，隨著分化時間的延長， 干細胞標志物Nanog 的表達量逐漸下降，VitC 40 μmol/L 組比50、60、70 μmol/L 組Sox2 的表達更快降低。 心肌標志物Nkx2.5、cTnTmRNA 表達水平在VitC 40 μmol/L 組和50 μmol/L 組要遠遠高于60 μmol/L 組和70 μmol/L 組。 在免疫熒光檢測中也看到同樣的趨勢。筆者的結果進一步表明，Nanog 的表達量隨著分化天數(shù)逐漸下降，而Nkx2.5、cTnT 的表達量逐漸增加。

綜上所述，hESC 分化為心肌細胞過程中，可觀察到唯有濃度 40 μmol/L 和 50 μmol/L VitC 與Chir99021 及IWP-2 的組合分化方案才能成功且高效誘導hESC 向心肌細胞分化， 且VitC 工作濃度為40 μmol/L 時能獲得最佳分化效果，而VitC 在這個誘導分化組合中的具體作用機制尚需進一步的研究。