陳 景，邱 敏，張海鵬，李慧麗，張夢(mèng)珍，李曉紅

心肌梗死引起大量的心肌細(xì)胞死亡而導(dǎo)致的充血性心力衰竭是心血管疾病的主要死因。日新月異的臨床治療方案尚未能從根本上徹底解決心肌損傷后不能再生的難題。大量研究[1～3]表明，多種類型的干細(xì)胞均有心肌分化的潛力。干細(xì)胞向心肌分化取得了一定的成果， 但目前常用的分化試劑價(jià)格非常高昂，成分復(fù)雜，在一定限度上制約了心肌分化研究的臨床轉(zhuǎn)化。L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，VitC）是一種價(jià)格便宜且容易獲得的維生素， 筆者通過探討VitC 在人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hESC）心肌分化中的作用，明確其達(dá)到最大分化效率時(shí)的最佳濃度，得到成分明確且高效心肌分化試劑， 以利于將來大規(guī)模臨床推廣運(yùn)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

hESC 來源于北京賽貝公司。

1.1.2 主要試劑

人干細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)液、人干細(xì)胞培養(yǎng)液（E8）、消化液乙二胺四乙酸 （ethylenedinitrilotetraacetic acid，EDTA）（北京賽貝公司，中國）。

VitC、6-((2-((4-(2，4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)煙腈三鹽酸鹽（6-((2-((4-(2，4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1Himidazol-2-yl)pyrimidin-2-yl)amino)ethyl)amino)nicotinonitrile trihydrochloride，Chir99021）、 二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、含4，6-二氨基-2-苯基吲哚 （4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI） 封片劑（Sigma， 美國）；N-（6-甲基苯并[d] 噻唑-2-基）-2-（（4-氧代-3-苯基-3，4，6，7-四氫噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基）硫基）乙酰胺（N-（6-methyl-1，3-benzothiazol-2-yl）-2-（（4-oxo-3-phenyl-6，7-dihydrothieno[3，2 -d]pyrimidin -2 -yl）sulfanyl）acetamide，IWP -2）（Selleck，美國）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、RPMI 1640 培養(yǎng)液、B27（Gibco，美國）；低生長因子 （growth factor reduced，GFR） 基質(zhì)膠（Corning， 美國）；RNA 提取試劑Trizol、Alexa Fluro 488 標(biāo)記的山羊抗兔和Alexa Fluro 594 標(biāo)記的山羊抗鼠熒光二抗（Invertogen，美國）；一抗Nanog、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin T，cTnT）和心臟特異性同源盒轉(zhuǎn)錄因子 （Nk2 homeobox 5，Nkx2.5）（1 ∶50） 抗體（Abcam， 美國）；PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time） 試劑與TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑（Takara，中國）。 引物合成由英濰捷基公司完成（序列見實(shí)驗(yàn)方法）。

1.1.3 儀器設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo forma 3111，美國）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，中國）；倒置相差顯微鏡（Leica DMil，美國）；正置熒光顯微鏡（Nikon 88i，德國）；小型冷凍臺(tái)式離心機(jī)（Eppenddorf，德國）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀（AppliedB-biosystems ViVA7，美國）；梯度PCR 儀（LIFE SimpliAmp，新加坡）；普通冰箱（海爾，中國）；超低溫冰箱（Thermo forma，美國）；液氮罐（Thermo Electron，美國）；多功能酶標(biāo)儀（Multiskan GO，美國）；電子分析天平（電子JA 1003，中國）；制冰機(jī)（SIM-F104AY65，日本）；漩渦振蕩器（Thermo fisher Maxi MIX II，美國）；風(fēng)熱式電熱干燥箱（GNP-9080，中國）；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3780 SANYO，日本）；電動(dòng)移液槍（Brand，德國）；手持移液器（Eppenddorf，德國）

1.2 方法

1.2.1 干細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出1 支凍存的hESC，在37 ℃水浴鍋內(nèi)左右搖晃使其迅速融化； 加入到含有3 mL 人干細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)液的離心管中， 于200 g 條件下離心5 min，吸去上清液；加入5 mL 復(fù)蘇培養(yǎng)液，重懸后加到預(yù)先用GFR（1 ∶100）包被好的培養(yǎng)瓶中，48 h 后換E8 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)用EDTA 消化后以團(tuán)塊傳代。

1.2.2 誘導(dǎo)與分化

待hESC 培養(yǎng)至90 %匯合度后， 分別在RPMI 1640 中加入0、10、20、30、40、50、60、70 μmol/L VitC的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，用帶有聯(lián)合Chir99021（6 μmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)分化，2 d 后將Chir99021 替換成Wnt 信號(hào)抑制劑IWP-2（5 μmol/L），與不同濃度的VitC 聯(lián)合進(jìn)行誘導(dǎo)分化，2 d 后再更換為2 % B27 與不同濃度VitC 聯(lián)合誘導(dǎo)，并隔天換液維持。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡觀察

hESC 加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液后， 每天在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的分化狀態(tài)， 觀察不同濃度VitC 對(duì)分化效果的影響，并記錄下自發(fā)跳動(dòng)心肌細(xì)胞出現(xiàn)的最早時(shí)間，對(duì)出現(xiàn)跳動(dòng)的區(qū)域進(jìn)行顯微錄像。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)各基因的表達(dá)

分別收集誘導(dǎo)分化后第0 天、第2 天、第4 天、第6 天、第8 天和第10 天的心肌細(xì)胞，用Trizol 裂解法提取總RNA。 用PrimeScriptTMRT reagent Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 得到cDNA 模板。 使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀ABI VIVA7進(jìn)行，擴(kuò)增基因：同源盒轉(zhuǎn)錄因子基因（homeobox protein gene，Nanog）， 性別決定因子同源盒2 基因（sex determining region Y-box2 gene，Sox2），心肌肌鈣蛋白T 基因（cardiac troponin T gene，cTnT），心臟特異性同源盒轉(zhuǎn)錄因子基因（Nk2 homeobox 5 jene，Nkx2.5），甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參。

相關(guān)基因引物序列：Nanog正向5′-CAATGGTGTGACGCAGAAGG-3′， 反向5′-GAAGGTTCCCAGT -CGGGTTC-3′；SOX2正向5′-AGAGAAAACCTGG -GAGGGT-3′，反向5′-GCAAAGCTCCTACCGTACCA-3′；cTnT正向5′-GACAGAGCGGAAAAGTGGGA-3′，反向5′-CTCCTTGGCCTTCTCCCTCA-3′；Nkx2.5正向5′-CAAGTGTGCGTCTGCCTTTC-3′， 反向5′-CG CACAGCTCTTTCTTTTCGG-3′；GAPDH正向5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2.5 免疫熒光

在鋪有蓋玻片的24 孔板中接種hESC，待其長至80%進(jìn)行誘導(dǎo)分化。 在誘導(dǎo)分化后第0 天、第2 天、第4 天、第6 天、第8 天和第10 天收集細(xì)胞，用新鮮配制的4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min，1 X PBS洗3 遍，每次5 min。 用0.2 % Triton X-100（PBS 配制）對(duì)細(xì)胞通透化處理20 min，1 X PBS 洗3 遍，每次5 min。 4%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA） 封閉45 min。 加入一抗Nanog、cTnT 和Nkx2.5（1 ∶50），4 ℃條件下孵育過夜，PBS 洗3 遍，每次5 min。加入Alexa Fluro 488 標(biāo)記的山羊抗兔和Alexa Fluro 594 標(biāo)記的山羊抗鼠熒光二抗，室溫避光孵育1 h，用PBS 洗3 遍，每次5 min。 加入含DAPI 封片劑，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示， 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）， 組間比較采用Dunnettt或LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及鑒定

hESC 呈克隆樣生長，團(tuán)塊邊緣整齊，胞核大，細(xì)胞間排列緊密，細(xì)胞間界限不清（圖1A）。免疫熒光染色鑒定干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog 為強(qiáng)陽性（圖1B。綠色為Nanog，藍(lán)色為細(xì)胞核）。

圖1 hESC 的形態(tài)和標(biāo)志蛋白Nanog 的檢測(cè)Fig.1 Images of hESC morphology and marker protein Nanog dection

2.2 人胚胎干細(xì)胞在不同濃度VitC 誘導(dǎo)下的觀察

hESC 分化第3 天，在沒有VitC 的培養(yǎng)液中開始發(fā)生大面積的脫落死亡（圖2A）；隨著VitC 濃度的逐漸增加， 細(xì)胞貼壁的數(shù)量越來越多 （圖2B、2C），到VitC 濃度為30 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞已可維持正常生長并開始出現(xiàn)小規(guī)?？寺F(tuán)塊 （圖2D）； 這種現(xiàn)象隨著VitC 濃度的增加而增多（圖2E、F），并逐漸演變?yōu)榇竺娣e的克隆樣生長團(tuán)塊（圖2G、H）。

圖2 hESC 向心肌分化第3 天不同濃度VitC 的影響光學(xué)顯微鏡觀察（標(biāo)尺=200 μm）Fig.2 Images of different concentration of VitC on 3rd day of hESC differentiation into cardiomyocytes by optical microscope(scale bar =200 μm)

2.3 人胚胎干細(xì)胞在VitC 濃度為40 ～70 μmol/L誘導(dǎo)下的觀察

hESC 分化第8 天，出現(xiàn)自發(fā)跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)。在VitC 40、50 μmol/L 濃度組可見某些細(xì)胞團(tuán)連成片呈波浪樣跳動(dòng)（圖3A、B），當(dāng)VitC 濃度增加到60、70μmol/L 后，搏動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)塊變少，搏動(dòng)的頻率也越來越低（圖3C、D）。

圖3 不同濃度VitC 對(duì)第8 天心肌細(xì)胞搏動(dòng)的影響（標(biāo)尺=200 μm）Fig.3 Images of different VitC concentrations on cardiomyocytes beating at 8-day(scale bar=200 μm)

2.4 心肌細(xì)胞的鑒定

2.4.1 誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

細(xì)胞出現(xiàn)明顯的肌絲，相鄰細(xì)胞互相融合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖4A），細(xì)胞與細(xì)胞之間重疊融合形成“竹節(jié)狀”肌節(jié)（圖4B）。

圖4 光學(xué)顯微鏡下分化的心肌樣細(xì)胞形態(tài)（標(biāo)尺=200 μm）Fig.4 Images of differentiated cardiomyocyte-like cells morphology by optical microscope(scale bar=200 μm)

2.4.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞Nanog、Sox2、cTnT 和Nkx2.5 mRNA的表達(dá)

以VitC 40、50、60、70 μmol/L 濃度誘導(dǎo)hESC 進(jìn)行分組，各組內(nèi)參GAPDH為恒定的表達(dá)，Nanog、Sox2、cTnT 和Nkx2.5 mRNA 均呈現(xiàn)單一的溶解峰，說明各引物的特異性良好， 無非特異性擴(kuò)增和引物二聚體干擾。VitC 誘導(dǎo)后，與不使用VitC 組相比，hESC 標(biāo)志物Nanog mRNA 在第2 天出現(xiàn)短暫而輕微的升高，50 μmol/L 組與60 μmol/L 組、70 μmol/L 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009、0.017）；隨著分化時(shí)間的延長，Nanog mRNA 表達(dá)量逐漸下降，至分化第10 天時(shí)候，40μmol/L組與60 μmol/L 組和70 μmol/L 組相比， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P= 0.013、0.027）；Sox2 mRNA 在各誘導(dǎo)組均表達(dá)下降， 而50 μmol/L 組在第6 天出現(xiàn)Sox2 mRNA 陡然升高，原因尚不清楚，其余時(shí)間點(diǎn)均呈下降趨勢(shì)；在分化第8 天時(shí)，40 μmol/L 組與60 μmol/L組相比有明顯變化（P=0.044）。相比對(duì)照組和VitC 其他濃度組，心肌標(biāo)志物cTnT mRNA 在分化第8 天時(shí)40 μmol/L 組與其他3 組相比， 表達(dá)明顯升高 （P=0.047、0.023、0.024），至分化第10 天時(shí)，40 μmol/L 組與60 μmol/L 組和70 μmol/L 組差異依舊明顯（P=0.031、0.022）， 而40 μmol/L 組與50 μmol/L 組、 60 μmol/L組與70 μmol/L 組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。心臟轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5 mRNA 在第10 天的表達(dá)，則表明40、50 μmol/L 組與60、70 μmol/L 組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001、0.001），40 μmol/L 組與50 μmol/L組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖5。

圖5 不同濃度組VitC 誘導(dǎo)hESC 分化為心肌細(xì)胞內(nèi)Nanog、Sox2、CTnT 和Nkx2.5 mRNA 的表達(dá)柱狀圖Fig.5 Histograms of Nanog，Sox2，CTnT and Nkx2.5 mRNA expression in cardiomyocytes induced by different concentrations of VitC

2.4.3 免疫熒光鑒定

免疫熒光法檢測(cè)顯示VitC 濃度為40 μmol/L 組和50 μmol/L 組分化得到的心肌樣細(xì)胞與對(duì)照組（VitC 濃度0 μmol/L） 相比低表達(dá)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物Nanog， 其熒光強(qiáng)度差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5.469 7 ± 0.466 1、10.161 3 ± 0.940 2vs12.816 3 ±0.489 3。P= 0.007、0.006）， 而40 μmol/L 組與50 μmol/L 組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 心肌特異性標(biāo)志物cTnT 表達(dá)的對(duì)照組與40 μmol/L 組相比，熒光強(qiáng)度差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （7.680 3±2.052 1vs20.543 0±2.052 4。P=0.004），而40 μmol/L 組與50 μmol/L 組組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （20.543 0 ±2.052 4vs10.472 0±0.577 4。P=0.02）。 Nkx2.5 的表達(dá)， 與對(duì)照組相比， 無論是40 μmol/L 組還是50 μmol/L 組，其熒光強(qiáng)度差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24.529 3 ± 1.974 3、26.093 3 ± 2.078 2vs11.057 7 ±0.772 4。P=0.007、0.006），而40 μmol/L 組與50 μmol/L組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖6 ～8。

圖6 免疫熒光檢測(cè)心肌樣細(xì)胞Nanog（標(biāo)尺=100 μm）Fig.6 Immunofluorescence staining images of Nanog in cardiac-like cells(scale bar=100 μm)

圖7 免疫熒光檢測(cè)心肌樣細(xì)胞cTnT（標(biāo)尺=100 μm）Fig.7 Immunofluorescence staining images of cTnT in cardiac-like cells(scale bar=100 μm)

圖8 免疫熒光檢測(cè)心肌樣細(xì)胞Nkx2.5（標(biāo)尺=100 μm）Fig.8 Immunofluorescence staining images of Nkx2.5 in cardiac-like cells(scale bar=100 μm)

3 討論

迄今為止， 研究干細(xì)胞向心肌分化已發(fā)展將近20 年。 2001 年Kehat I 及其同事[4]首次報(bào)道一種通過擬胚體（embryoid body，EB）來分化心肌細(xì)胞的方法，但該方法心肌分化效率非常低，只有不到8.1%的細(xì)胞能成功轉(zhuǎn)化為跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。后來科學(xué)家們利用細(xì)胞因子激活素A（cytokine activin A，Activin A）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行分化，相比EB 法，這種分化方式具有更高的效率，但該方法僅能在某些人類多能干細(xì)胞系中起作用[5]，且細(xì)胞因子高昂的價(jià)格也阻滯了它的發(fā)展運(yùn)用。 后續(xù)有研究者發(fā)現(xiàn)Wnt/β-Catenin 信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑能進(jìn)一步更有效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）向心肌細(xì)胞分化[6～8]。 也有的研究采用病毒過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子或者microRNA 等進(jìn)行心肌的誘導(dǎo)分化[9～11]。而從多種多樣的誘導(dǎo)方案中，積極尋找高效、簡(jiǎn)便的誘導(dǎo)分化劑成為目前人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

抗壞血酸也稱維生素C（VitC），是一種人類無法自身合成、只能通過食物攝取的必需營養(yǎng)素。 一方面VitC 是許多酶的重要輔助因子， 它能通過調(diào)節(jié)DNA的合成和組蛋白羥化酶的活性來修改干細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)/基因表達(dá)譜， 從而影響細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的穩(wěn)態(tài)[12]，也能通過DNA 甲基化、轉(zhuǎn)錄譜和能量代謝影響ESC 的多能性[13]。 另一方面VitC 對(duì)干細(xì)胞增殖和分化也具有重要影響。 VitC 能通過增強(qiáng)γδ T 細(xì)胞的增殖和效應(yīng)子功能影響T 細(xì)胞的分化[14]，也可刺激人牙髓干細(xì)胞（human deciduous pulp stem cell，HDPSC） 體外增殖及激活分化潛能[15]，還可促進(jìn)精原干細(xì)胞增殖和降低其活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生[16]。 有研究發(fā)現(xiàn)，VitC 不僅能通過促進(jìn)膠原蛋白合成，促使誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）/hESC 來源的神經(jīng)上皮樣干細(xì)胞的生成和分化[17]，還能增加高表達(dá)蛋白TRF1 的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 （induced pluripotent stem cells with high expression of the shelterin-complex protein TRF1，iPSChighT） 分化的心肌細(xì)胞數(shù)量[18]。Choi SC 等[19]利用成纖維細(xì)胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF4）和VitC 分化hESC 來源的心肌細(xì)胞成功建立一種體外缺氧應(yīng)激模型。 而Perino MG等[20]則認(rèn)為VitC 可能是通過激活母親DPP 同源物1（果蠅）[mothers against DPP homolog 1（Drosophila），SMAD1]通路促進(jìn)ESC 向心肌細(xì)胞分化。

筆者的研究在已有的誘導(dǎo)分化方案上進(jìn)行簡(jiǎn)化，采用分化效果明確的化學(xué)小分子化合物Chir99021及IWP-2 聯(lián)合不同濃度的VitC，探索在ESC 的心肌誘導(dǎo)方案中VitC 是否必須及發(fā)揮作用最合適的濃度范圍。

筆者研究將hESC 培養(yǎng)到90%時(shí)，分別用含有不同濃度VitC 序貫聯(lián)合化學(xué)小分子Chir99021 及IWP-2 進(jìn)行分化培養(yǎng)，在分化過程中發(fā)現(xiàn)不含VitC 的培養(yǎng)組細(xì)胞大面積死亡，隨著VitC 濃度逐漸增高，細(xì)胞死亡數(shù)量逐漸下降。這表明VitC 是這個(gè)誘導(dǎo)分化組合中不可或缺的因子。 研究結(jié)果顯示，隨著分化時(shí)間的延長， 干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog 的表達(dá)量逐漸下降，VitC 40 μmol/L 組比50、60、70 μmol/L 組Sox2 的表達(dá)更快降低。 心肌標(biāo)志物Nkx2.5、cTnTmRNA 表達(dá)水平在VitC 40 μmol/L 組和50 μmol/L 組要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于60 μmol/L 組和70 μmol/L 組。 在免疫熒光檢測(cè)中也看到同樣的趨勢(shì)。筆者的結(jié)果進(jìn)一步表明，Nanog 的表達(dá)量隨著分化天數(shù)逐漸下降，而Nkx2.5、cTnT 的表達(dá)量逐漸增加。

綜上所述，hESC 分化為心肌細(xì)胞過程中，可觀察到唯有濃度 40 μmol/L 和 50 μmol/L VitC 與Chir99021 及IWP-2 的組合分化方案才能成功且高效誘導(dǎo)hESC 向心肌細(xì)胞分化， 且VitC 工作濃度為40 μmol/L 時(shí)能獲得最佳分化效果，而VitC 在這個(gè)誘導(dǎo)分化組合中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。