黃家宇,王銘菊,劉星村,胡濱,吳軍,湯磊**,李莉**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽 550025;2.貴州遠(yuǎn)程制藥有限責(zé)任公司 質(zhì)量部,貴州 貴陽 550018)

抗婦炎膠囊是一種源于苗族驗(yàn)方的貴州名優(yōu)苗族藥制劑,全方由杠板歸、苦參、連翹、黃柏、當(dāng)歸、益母草、烏藥、赤小豆及艾葉組成,用于治療濕熱下注型盆腔炎、慢性宮頸炎、陰道炎、陰癢、出血、赤白帶下及痛經(jīng)等婦科炎癥類疾病,療效顯著[1-3]?？箣D炎膠囊已納入《國家基本用藥目錄》,為獨(dú)家專利苗藥制劑。目前,有關(guān)抗婦炎膠囊的質(zhì)量[4-6]和藥效作用研究較多[7-10],尚未見其體內(nèi)作用成分與代謝過程的研究報(bào)道,且藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。中藥口服后藥物成分經(jīng)消化道吸收入血,或經(jīng)消化酶等作用分解成次生代謝產(chǎn)物被吸收入血;或經(jīng)肝微粒體酶代謝成有活性的代謝產(chǎn)物,這些成分在血中轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)作用部位后發(fā)揮藥效,中藥的血清“移行成分”與藥物在體內(nèi)直接作用的物質(zhì)密切相關(guān)。以藥物化學(xué)研究方法為基礎(chǔ)的中藥血清藥物化學(xué)是運(yùn)用現(xiàn)代分離技術(shù)及多維聯(lián)用技術(shù),該方法通過分析口服中藥后血中移行成分,闡明其與藥效相關(guān)性,探索中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ),研究其體內(nèi)過程[11-12]。本研究擬采用超高效液相色譜(ultra high performance liquid chromatography,UPLC)與離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(ion trap time of flight mass spectrometry,IT-TOF-MS)技術(shù)聯(lián)用的方法分析口服抗婦炎膠囊后大鼠血漿中的移行成分,鑒定含藥血漿中吸收原型成分和代謝產(chǎn)物,以便為抗婦炎膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的確定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 6～7周齡無特異病原體(specific pathogen free,SPF)雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠12只,體質(zhì)量200±20 g,購自學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(湘)2019-0014],置于室溫23±2 ℃,濕度(55±10)%,12 h晝夜交替環(huán)境中,自由飲食,飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2主要藥品及試劑 槐定堿對照品(批號wkq21030106)、鹽酸小檗堿對照品(批號wkq21022004)及苦參堿對照品(批號wkq21060212)均購于四川省維克奇生物科技有限公司,抗婦炎膠囊(批號20220106,貴州遠(yuǎn)程制藥公司),甲醇、乙腈(德國Merck公司),甲酸(美國Fisher公司)均為色譜純,水為純凈水。

1.1.3主要儀器 LCMS-IT-TOF液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司),微量移液槍(德國Eppendorf公司),MS105DU電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司),H1-16KR冷凍離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備公司),KQ250DA型超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司),QQMD200-1氮吹儀(上海啟前電子科技公司)。

1.2 研究方法

1.2.1色譜和質(zhì)譜條件 (1)色譜條件:色譜柱為Shim-pack XR-ODSⅢ(50 mm×2.0 mm,1.6 μm);柱溫30 ℃、進(jìn)樣量2 μL、流速0.3 mL/min;流動相為乙腈(B)-0.1%甲酸溶液(A),洗脫程序?yàn)?.01～20 min、5%～100% B,20～30 min、100% B。(2)質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI),檢測器電壓為0.15 kV;霧化氣體積流量1.5 L/min;正負(fù)離子模式下同時(shí)采集,掃描范圍80～1 200 m/z;曲型脫溶劑裝置(curved solvent removal device,CDL)溫度30 ℃,加熱塊溫度30 ℃;質(zhì)譜設(shè)為自動多級MS1、MS2全掃描模式,誘導(dǎo)碰撞解離能量50%,離子累積時(shí)間20 ms,LCMS solution工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析。

1.2.2對照品溶液的制備 精密稱取苦參堿、槐定堿、鹽酸小檗堿對照品適量,置于容量瓶中,加甲醇制成各成分質(zhì)量濃度分別為5.70、6.39、6.00 mg/L混合對照品溶液。

1.2.3抗婦炎膠囊給藥樣品溶液的制備 取抗婦炎膠囊內(nèi)容物4.4 g,溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液40 mL,配制成質(zhì)量濃度為110 g/L的抗婦炎膠囊灌胃藥液,儲存至4 ℃冰箱中備用。

1.2.4抗婦炎膠囊體外樣品溶液的配制 取抗婦炎膠囊內(nèi)容物0.5 g,置具塞錐形瓶中,加70%甲醇10 mL,稱定質(zhì)量;超聲30 min,放冷,70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,0.22 μm濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得抗婦炎膠囊體外樣品溶液。

1.2.5血漿樣品的制備 實(shí)驗(yàn)前12 h內(nèi)雌鼠禁食不禁水,給藥后2 h恢復(fù)自由進(jìn)食,隨機(jī)均分為給藥組和空白組,給藥組雌鼠按照0.02 mL/g灌胃抗婦炎膠囊藥液、2次/d、連續(xù)3 d,空白組雌鼠灌服同等體積的生理鹽水;末次給藥1 h后10%水合氯醛(3 μL/g)麻醉各組雌鼠,肝門靜脈采血,置于含肝素鈉采血管中,4 ℃條件下5 000 r/min離心10 min;取上清液,-20 ℃保存,即得含藥血漿樣品和空白血漿樣品。

1.2.6血漿樣品的前處理 取“1.2.5”項(xiàng)下各組雌鼠血漿樣品,按1∶3的比例加乙腈,渦旋混勻3 min,5 000 r/min離心10 min;沉淀蛋白,取上清液;氮?dú)獯蹈珊蠹?50%甲醇200 μL,超聲10 min,12 000 r/min離心10 min,取上清液,供UPLC-IT-TOF-MS監(jiān)測分析。

1.2.7樣品測定 采用“1.2.1”項(xiàng)下分析條件,對抗婦炎膠囊體外樣品、空白血漿及給藥血漿樣品進(jìn)行檢測分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用LCMS solution工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,分析色譜圖和色譜峰的質(zhì)譜信息,對抗婦炎膠囊體外樣品、空白血漿及給藥血漿樣品進(jìn)行原型成分和代謝物的檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-IT-TOF-MS色譜圖的采集

采用經(jīng)優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件分析樣本,對樣品進(jìn)樣正負(fù)離子模式下同時(shí)掃描,所得的空白組、給藥組、混合對照品溶液以及抗婦炎膠囊體外提取液的色譜圖見圖1和圖2所示,提示抗婦炎膠囊體外樣品化學(xué)成分在此條件下分離良好。

注：A為空白血漿,B為含藥血漿,C為對照品溶液,D為體外樣品溶液;1為苦參堿,2為槐定堿,3為萊曼堿,4為5,6-去氫羽扇豆堿,5為7,11-去氫苦參堿,6為12α-/5a-/9a-羥基槐果堿或氧化槐果堿或黃葉槐堿,7為去氫12α-羥基槐果堿,8為9α-羥基槐胺堿還原化,9為小檗堿。

注：A為空白血漿,B為含藥血漿,C為對照品溶液,D為體外樣品溶液;1為番石榴酸,2為高麗槐素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

2.2 移行成分

本研究參照對照品二級質(zhì)譜,鑒定了大鼠口服抗婦炎膠囊后血漿中的11個(gè)移行成分,其中原型成分8個(gè)、代謝產(chǎn)物3個(gè),抗婦炎膠囊吸收原型成分和代謝產(chǎn)物的液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1;鑒定出的8個(gè)原型成分為來源于苦參的苦參堿、槐定堿、萊曼堿、12α-/5a-/9a-羥基槐果堿或氧化槐果堿或黃葉槐堿、5,6-去氫羽扇豆堿、7,11-去氫苦參堿、番石榴酸和來源于黃柏的小檗堿,3個(gè)代謝產(chǎn)物分別是12α-羥基槐果堿、9α-羥基槐胺堿及高麗槐素的體內(nèi)代謝物,其裂解、代謝途徑見圖3～7。

表1 抗婦炎膠囊吸收原型成分和相關(guān)代謝產(chǎn)物的液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)

注：A為苦參堿裂解途徑,B為苦參堿一級質(zhì)譜圖,C為苦參堿二級質(zhì)譜圖。

2.3 主要色譜峰的質(zhì)譜分析

2.3.1化合物1正離子模式下,化合物1在含藥血漿總離子圖與抗婦炎膠囊總離子圖中保留時(shí)間基本一致,二級質(zhì)譜碎片一致,準(zhǔn)分子離子峰m/z249[M+H]+相對豐度較強(qiáng),擁有共同二級碎片m/z176、148等,參考對照苦參堿對照品的二級質(zhì)譜圖,推測其結(jié)構(gòu)為苦參堿,可能的裂解途徑見圖3。

2.3.2化合物7化合物7經(jīng)計(jì)算得到精確分子式為C15H20N2O2,正離子模式下一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z261[M+H]+,分子量比12α-羥基槐果堿少2 Da(-2H),二級質(zhì)譜中存在m/z243[M+H-H2O]+等特征碎片離子,結(jié)合文獻(xiàn),推測結(jié)構(gòu)為去氫12α-羥基槐果堿,體內(nèi)可能的代謝途徑見圖4。

圖4 12α-羥基槐果堿的代謝途徑

2.3.3化合物8化合物8經(jīng)計(jì)算得到精確分子式為C15H22N2O2,正離子模式下一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z263[M+H]+,分子量比9α-羥基槐胺堿多2 Da(+2H),二級質(zhì)譜中存在m/z245[M+H-H2O]+等特征碎片離子,結(jié)合文獻(xiàn),推測結(jié)構(gòu)為9α-羥基槐胺堿還原化產(chǎn)物,體內(nèi)可能的代謝途徑見圖5。

圖5 9α-羥基槐胺堿還原化

2.3.4化合物9正離子模式下,化合物9與抗婦炎膠囊總離子圖中小檗堿的保留時(shí)間基本一致,二級質(zhì)譜碎片一致,準(zhǔn)分子離子峰m/z336[M+H]+相對豐度最強(qiáng),擁有共同二級碎片m/z321、292等,參考其它研究,對照小檗堿對照品的一、二級質(zhì)譜圖,推測其結(jié)構(gòu)為小檗堿,可能的裂解途徑見圖6。

2.3.5化合物11化合物11保留時(shí)間8.393 min,經(jīng)計(jì)算得到精確分子式C22H20O11,負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 459[M-H]-,分子量比高麗槐素多176 Da(+C6H8O6),二級質(zhì)譜中存在m/z283[M-H-C6H8O6]-碎片離子,結(jié)合文獻(xiàn),推測結(jié)構(gòu)為高麗槐素的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物,體內(nèi)可能的代謝途徑見圖7。

圖7 高麗槐素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物

3 討論

課題組前期已對抗婦炎膠囊體外樣品溶液正負(fù)離子模式下進(jìn)樣檢測分析。經(jīng)過分析比較精確質(zhì)荷比及其質(zhì)譜裂解規(guī)律、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)等信息,從抗婦炎膠囊70%甲醇提取液中共推斷了80個(gè)化合物,包括生物堿類37個(gè),黃酮及其苷類27個(gè),有機(jī)酸類7個(gè),苯丙素及其苷類3個(gè),苯乙醇苷類3個(gè),其他類化合物3個(gè)。本研究分別對單次給藥和連續(xù)多次給藥兩種給藥方案所得血中移行成分結(jié)果進(jìn)行對比分析,結(jié)果表明兩種方法下均測得了原型移行成分8個(gè),單次給藥僅測得代謝產(chǎn)物1個(gè)(去氫 12α-羥基槐果堿);連續(xù)多次給藥方法下測得代謝產(chǎn)物3個(gè)(去氫12α-羥基槐果堿、9α-羥基槐胺堿還原化及高麗槐素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物),分析代謝產(chǎn)物有差異的原因可能是多次給藥,有利于藥物轉(zhuǎn)化吸收,代謝產(chǎn)物易達(dá)到較高的濃度而被測出[20]。在樣品處理方法上,考察了乙腈、乙酸乙酯和甲醇的去蛋白效果,確定使用乙腈作為處理溶劑。

大鼠口服抗婦炎膠囊后的含藥血漿中共鑒定出入血成分11個(gè),其中來自苦參的多為生物堿類成分,苦參中的苦參堿等生物堿類成分,具有廣泛的生物活性,其中苦參堿具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲及抗炎等藥理作用[21-22]。在婦科疾病的治療領(lǐng)域中,苦參堿還具有抗婦科腫瘤作用,具有保護(hù)乳腺、子宮內(nèi)膜及陰道上皮細(xì)胞的功能,還能對抗各種致病因子引起的上皮細(xì)胞炎性病變[23]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,槐定堿和槐胺堿具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤及抗心律失常等藥理活性[24];來自黃柏的小檗堿,具有抗炎、抗菌、抗病毒、降脂、降壓、抗氧化的作用[25],對乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等婦科腫瘤具有抑制作用。本研究檢出的移行成分與抗婦炎膠囊臨床上主要用于治療盆腔炎、陰道炎、慢性宮頸炎等疾病的功效相符。按照藥物代謝途徑分析,代謝產(chǎn)物去氫12α-羥基槐果堿和9α-羥基槐胺堿還原產(chǎn)物為抗婦炎膠囊的Ⅰ相代謝產(chǎn)物,高麗槐素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物為該制劑的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。這些原型成分和代謝產(chǎn)物,可能是抗婦炎膠囊潛在的活性成分。目前臨床上已將抗婦炎膠囊用于治療各類宮頸炎、陰道炎,也被試用于治療乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌等疾病[26]。

本研究通過UPLC與高分辨IT-TOF-MS技術(shù)聯(lián)用檢測含藥血漿中的代謝產(chǎn)物及原型成分,在正負(fù)離子檢測模式下鑒定的藥源性成分,多為制劑處方中苦參或黃柏的成分或代謝產(chǎn)物,其他藥味可能是給藥后被快速代謝或入血含量低無法檢測而未被檢出。本研究初步探究了抗婦炎膠囊在血中的移行成分,為該制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。