牛廣旭,賈如江,宋曉明,鄭神英,王朝輝

(1.邯鄲市中心醫(yī)院 病理科,056001; 2.邯鄲市中心醫(yī)院 普外一科,056001)

原發(fā)性肝癌以原發(fā)性肝細胞癌為主,多表現(xiàn)出肝區(qū)疼痛及乏力、消瘦、消化道癥狀等,但缺乏特異性表現(xiàn),發(fā)現(xiàn)時多為中晚期[1]。原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)病可能與飲酒、黃曲霉素、遺傳、肝硬化或病毒性肝炎有關(guān),手術(shù)為其常用治療手段,但療效不甚理想[2-3]。隨分子腫瘤學(xué)研究的深入,探究疾病發(fā)生的分子機制可為肝細胞癌診斷及靶向治療提供更多參考[4]。微染色體維持蛋白7(minichro-mosome maintenance protein7,MCM7)在甲狀腺癌等癌癥中表達較高[5],細胞分裂周期蛋白6(cell division cyclin 6,CDC6)則在結(jié)直腸癌中表達較高[6]。肝細胞癌基因通路復(fù)雜,為揭示MCM7、CDC6在其中的影響,本研究分別對原發(fā)性肝細胞癌患者癌組織及癌旁組織(與癌組織距離>5 cm)內(nèi)MCM7、CDC6表達加以觀察,分析這兩項指標在原發(fā)性肝細胞癌診斷及預(yù)后預(yù)測中的應(yīng)用價值,為原發(fā)性肝細胞癌的診治及生存預(yù)測提供參考依據(jù),現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2019年1月收治的68例原發(fā)性肝細胞癌患者,所有患者均行手術(shù)治療。68例患者中男45例、女23例,年齡40～69歲、平均(55.13±2.88)歲,腫瘤直徑<5 cm 20例、≥5 cm 48例,腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tumor node metastasis,TNM)分期Ⅰ～Ⅱ期41例、Ⅲ～Ⅳ期27例,分化程度低分化39例、中高分化29例,乙肝表面抗原(hepatits B surface antigen,HBsAg)陽性52例、陰性16例,血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)<400 μg/L 24例、≥400 μg/L 44例,衛(wèi)星結(jié)節(jié)35例。納入標準:(1)患者入院后均診斷為原發(fā)性肝細胞癌[7],術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實;(2)均行常規(guī)手術(shù)治療;(3)均為首次診治,且術(shù)前未接受過放化療治療;(4)病歷資料完整;(5)患者均自愿參與本研究,并簽署知情同意書。排除標準:(1)預(yù)計存活時間≤3個月;(2)圍術(shù)期死亡;(3)隨訪失訪;(4)合并其他惡性腫瘤;(5)重要臟器損傷;(6)合并急慢性感染。

1.2 研究方法

1.2.1MCM7及CDC6檢測 68例患者根治性手術(shù)治療后迅速多點取材,分別取癌組織、癌旁組織各2塊,多聚甲醛固定、石蠟包埋處理,將標本切成3～4 μm厚切片后脫蠟至水,免疫組織化學(xué)染色方法(immunohistochemical sp method,SP)染色,以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)代替一抗作為陰性對照,MCM7抗體購自Neomarker公司,CDC6購自美國Abcam公司,SP試劑盒、DBA試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2.2MCM7及CDC6判定標準 依據(jù)細胞染色程度與陽性細胞占比評分的乘積判定[8],陽性細胞染色程度:不著色記0分,淡黃色記1分,棕黃色記2分,棕褐色記3分。(1)MCM7陽性細胞比例評分為≥10%即記為陽性,計2分,<10%為陰性,計1分;染色陽性采用染色強度分數(shù)與陽性細胞比例分數(shù)的乘積[(染色程度評分+陽性細胞比例評分)/2]表示,>2分為陽性。(2)CDC6陽性細胞占比評分分別給予0分(<5%),1分(5%～25%),2分(26%～50%),3分(51%～75%),4分(>75%),兩項評分之積≥3分為CDC6高表達,<3分為CDC6低表達。

1.3 觀察指標

比較癌組織及癌旁組織中MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比;分析不同臨床病理特征的肝細胞癌患者MCM7陽性占比及CDC6高表達占比,并采取多因素logistics回歸分析MCM7陽性、CDC6高表達的危險因素;3年院外隨訪,記錄癌組織MCM7陽性及CDC6高表達患者術(shù)后3年存活率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 癌組織及癌旁組織內(nèi)MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比

MCM7及CDC6陽性均主要定位于細胞質(zhì)或細胞核(圖1),癌組織內(nèi)MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織內(nèi)MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比[n(%)]

2.2 不同臨床病理特征肝細胞癌患者MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比

結(jié)果顯示,不同性別、年齡及HBsAg陽性患者的MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低分化、血清AFP≥400 μg/L、有衛(wèi)星結(jié)節(jié)患者的MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征肝細胞癌患者MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比[n(%)]

2.3 MCM7陽性、CDC6高表達的多因素logistics回歸分析

將臨床病理特征存在差異的項目行量化賦值,腫瘤直徑≥5 cm為1分,<5 cm為0分;TNM分期Ⅲ-Ⅳ期為1分,Ⅰ～Ⅱ期為0分;分化程度低分化為1分,中、高分化為0分;HBsAg陽性為1分,陰性為0分;血清AFP≥400 μg/L為1分,<400 μg/L為0分;有衛(wèi)星結(jié)節(jié)為1分,無為0分。結(jié)果顯示腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、HBsAg陽性、血清AFP≥400 μg/L、有衛(wèi)星結(jié)節(jié)是MCM7陽性、CDC6高表達的危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 MCM7陽性、CDC6高表達的多因素logistics回歸分析

2.4 癌組織MCM7陽性、CDC6高表達肝細胞癌患者術(shù)后3年存活率

68例行根治性手術(shù)的肝細胞癌患者均獲得3年院外隨訪,3年死亡率38.24%(26/68),存活率61.76%(42/68);50例癌組織MCM7陽性患者中死亡率44.00%(22/50)、存活率56.00%(28/50),18例癌組織MCM7陰性患者中死亡率22.22%(4/18)、存活率83.05%(14/18),Kaplan-Meier生存分析顯示癌組織MCM7陽性檢出率越高患者存活率越低(Log-Rank=15.025,P<0.05);40例癌組織CDC6高表達患者中死亡率50.00%(20/40)、存活率50.00%(20/40),28例癌組織CDC6低表達患者中死亡率21.43%(6/28)、存活率78.57%(22/28),Kaplan-Meier生存分析顯示癌組織CDC6表達越高患者存活率越低(Log-Rank=8.890,P<0.05)。

3 討論

肝細胞癌及其他癌癥的發(fā)病均與分子機制調(diào)控及基因有關(guān),深入研究影響該病發(fā)生、發(fā)展的分子機制對提高療效、改善預(yù)后有重要意義[9-10]。MCM為蛋白家族,其中MCM7復(fù)合物與真核細胞復(fù)制有關(guān),MCM7在與DNA復(fù)制起始點結(jié)合后,染色質(zhì)開始復(fù)制,且MCM7二聚體復(fù)合體具有解螺旋酶活性與ATP水解活性,可雙鏈DNA解鏈[11-12]。王東星等[13]可證實MCM7對肝細胞癌的作用。細胞周期紊亂直接關(guān)系到腫瘤的發(fā)生,CDC6為ATP結(jié)合蛋白和復(fù)制前復(fù)合體一份子,具有ATP酶活性,多定位于人體17q21.3染色體[14-15],同樣在起始DNA復(fù)制中有重要地位,還通過抑制CDK1蛋白活性而參與細胞的惡性轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo)腫瘤細胞增殖,連旭等[16]也佐證了這一點。癌細胞通過糖酵解獲取能量,ATP則伴隨糖酵解產(chǎn)生[17-19]。

本研究結(jié)果顯示癌組織內(nèi)MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比高于癌旁組織,提示肝細胞癌患者癌組織內(nèi)MCM7、CDC6呈現(xiàn)高表達。腫瘤直徑、TNM分期、分化程度、血清AFP水平及衛(wèi)星結(jié)節(jié)均為評估肝細胞癌病情及預(yù)后的參照。賈清馨等[20]發(fā)現(xiàn)腫瘤執(zhí)行與肝細胞癌術(shù)后生存率直接關(guān)聯(lián);AFP被視為肝細胞癌的特異性血清標志物,如萬波等[21]也發(fā)現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)患者血清AFP水平顯著高于未復(fù)發(fā)組,且AFP高水平患者3年無瘤生存率顯著較低,預(yù)后不佳;微血管侵犯與肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,而衛(wèi)星結(jié)節(jié)不僅與微血管侵犯檢出率有關(guān),更與肝癌總生存率有關(guān),丁凌等[22]研究也針對這一點進行了論證。本研究顯示腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、分化程度低分化、血清AFP≥400 μg/L、有衛(wèi)星結(jié)節(jié)患者的MCM7陽性檢出率及CDC6高表達占比較高,并顯示腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化、HBsAg陽性、血清AFP≥400、有衛(wèi)星結(jié)節(jié)是MCM7陽性、CDC6高表達的危險因素,提示MCM7、CDC6不僅參與肝細胞癌的發(fā)病,還與病情進展有關(guān),可能是肝細胞癌發(fā)展的關(guān)鍵靶點。牛廣旭等[23]也表明MCM7陽性檢出率會隨病情嚴重程度加深而升高。

最后,通過對68例肝細胞癌患者3年院外隨訪結(jié)果的觀察,發(fā)現(xiàn)肝細胞癌患者3年死亡率為38.24%,存活率為61.76%,50例癌組織MCM7陽性患者死亡率44.00%,存活率56.00%,18例癌組織MCM7陰性患者中死亡率22.22%,存活率83.05%;40例癌組織CDC6高表達患者中死亡率50.00%,存活率50.00%,Kaplan-Meier生存分析顯示癌組織MCM7陽性檢出率越高、CDC6表達越高患者存活率越低。提示癌組織MCM7陽性及CDC6高表達均會影響肝細胞癌患者生存質(zhì)量。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝細胞癌患者癌組織內(nèi)MCM7和CDC6與疾病的進展有關(guān),且癌組織MCM7陽性及CDC6高表達均會影響肝細胞癌患者存活率。在肝細胞癌的后續(xù)診斷及治療中,或可將MCM7及CDC6作為分子靶向治療新思路,或根據(jù)患者MCM7及CDC6表達建立相應(yīng)預(yù)后評估模型,對患者存活率加以預(yù)測[24-25]。本研究僅對MCM7及CDC6與肝細胞癌患者生存質(zhì)量的獨立影響加以觀察,但能否將MCM7及CDC6聯(lián)合應(yīng)用進行肝細胞癌患者的預(yù)后預(yù)測尚不清楚,且對MCM7、CDC6與血清AFP的關(guān)系尚不明確,仍需多中心的深入研究。