周琴,蔣紅梅,孫廣,張海龍,席敏,張?jiān)茤|*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.安順市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,貴州 安順 561000)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性、全身性自身免疫性疾病,其主要特征是關(guān)節(jié)滑膜增生、炎性細(xì)胞募集、血管翳形成、軟骨破壞和骨侵蝕等,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。目前RA的診斷依據(jù)2010年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(american college of rheumatology,ACR)和歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟(european league for rheumatism,EULAR)提出的RA評(píng)分系統(tǒng)和分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[2],存在一定的誤診和漏診率,尤其對(duì)臨床癥狀不典型的RA患者更為不利。白細(xì)胞介素-38(interleukin-38,IL-38)是IL家族中的一種受體拮抗劑細(xì)胞因子[3],有研究表明IL-38與炎癥性自身免疫性疾病存在相關(guān)性,例如銀屑病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及RA等[4]。T細(xì)胞受體CD3ζ鏈(cluster of differentiation 247,CD247)是T細(xì)胞表面受體-CD3復(fù)合物(T cell receptor-cluster of differentiation 3 complex,TCR-CD3)中的zeta鏈,參與TCR-CD3復(fù)合物的組裝[5],對(duì)T細(xì)胞的激活起重要作用;CD247的表達(dá)已被證實(shí)與多種自身免疫性疾病相關(guān)[6],基因芯片篩選結(jié)果表明,CD247 mRNA與RA存在相關(guān)性[7-8]。有關(guān)RA患者外周血IL-38、CD247表達(dá)的相關(guān)研究較少,因此,本研究擬檢測(cè)RA患者外周血中IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA表達(dá),并與實(shí)驗(yàn)室特征進(jìn)行相關(guān)性分析,評(píng)估IL-38、CD247在RA疾病中的診斷性能。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2021年12月—2022年5月就診的RA患者56例,要求符合ACR和EULAR提出2010年RA評(píng)分系統(tǒng)和分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[9],排除伴有嚴(yán)重感染和惡性腫瘤疾病的患者、不能配合研究完成相關(guān)評(píng)分量表者及妊娠期婦女。同時(shí)收集其他風(fēng)濕免疫性疾病[痛風(fēng)8例、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)5例、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)3例、干燥綜合征(sicca syndrome,SS)2例及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)5例]患者23例作為非RA組和健康體檢者12例作為健康對(duì)照(healthy control,HC)組。3組研究對(duì)象均知情同意,本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(〔2023〕安市醫(yī)倫理專(zhuān)1號(hào))。

1.2 研究方法

1.2.1一般臨床資料 收集3組受檢者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI),記錄RA組患者病程,檢測(cè)RA組和HC組受檢者C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

1.2.228個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)性評(píng)分(disease activity score-28,DAS28)[10]評(píng)估RA疾病活動(dòng)度 采用DAS28評(píng)分評(píng)估RA組患者治療前的疾病活動(dòng)度,評(píng)分越高表示病情越嚴(yán)重。根據(jù)DAS28評(píng)分將RA疾病活動(dòng)度分為緩解期(DAS28<2.6)和活動(dòng)期(2.6≤DAS28),其中活動(dòng)期包括低(2.6≤DAS28<3.2)、中(3.2≤DAS28≤5.1)及高疾病活動(dòng)度(DAS28>5.1)。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清IL-38、CD247的表達(dá) 抽取HC組、RA組與非RA組治療前及RA組患者治療后空腹外周血4 mL,4 000 r/min離心10 min,分離血清備用;用ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)檢測(cè)IL-38、CD247的表達(dá)。

1.2.4RT-qPCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CD247 mRNA的表達(dá) 抽取RA組患者治療前與HC組檢測(cè)日的EDTA-K2抗凝空腹全血3 mL,用全血單個(gè)核細(xì)胞分離液(北京索萊寶公司)分離全血中的PBMC,置于EP管內(nèi),按照TriQuick總RNA提取試劑盒(北京索萊寶公司)提取PBMC中的RNA,標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱中備用;提前取上述RNA提取液恢復(fù)至室溫,按照TaKaRa PrimeScript TM RT試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)純化RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TIi RNaseH Plus)試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)于羅氏4800擴(kuò)增儀(上海羅氏診斷有限公司)上檢測(cè)CD247 mRNA的相對(duì)表達(dá),檢測(cè)結(jié)果用2-ΔΔCt表示,引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

RA組患者DAS28評(píng)分平均3.89±1.58分,病程為3.25(1.13,8.00)年。如表2所示,3組受檢者性別比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);3組受檢者年齡、BMI比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);RA組與HC組受檢者CRP、ESR比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 RA組、對(duì)照組和非RA組被檢者的一般資料

2.2 外周血IL-38、CD247蛋白及mRNA表達(dá)

如圖1所示,RA組患者IL-38表達(dá)高于HC組、非RA組(P<0.05),RA組患者CD247蛋白表達(dá)低于HC組(P<0.05),與非RA組比較、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);RA組患者CD247 mRNA表達(dá)低于HC組(P<0.05)。

注：(1)與HC組比較,P<0.05;(2)與RA組比較,P<0.05。

2.3 RA活動(dòng)度程度與IL-38、CD247蛋白及mRNA表達(dá)

結(jié)果顯示(圖2),隨著疾病活動(dòng)度的升高,RA組患者IL-38表達(dá)逐漸升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與RA中低疾病活動(dòng)度組、HC組及緩解RA組比較,RA高疾病活動(dòng)度組患者外周血CD247蛋白和 mRNA表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：(1)與HC組比較,P<0.05;(2)與RA低疾病活動(dòng)度組比較,P<0.05;(3)與RA中疾病活動(dòng)度組比較,P<0.05;(4)與RA高疾病活動(dòng)度組比較,P<0.05。

2.4 IL-38、CD247蛋白及mRNA與RA患者疾病活動(dòng)度、CRP及ESR的相關(guān)性

RA患者外周血IL-38 mRNA表達(dá)與疾病活動(dòng)度程度呈正相關(guān)(r=0.716,P<0.001),CD247蛋白及mRNA與疾病活動(dòng)度程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.512,P<0.001;r=-0.362,P=0.006);RA患者外周血IL-38 mRNA表達(dá)與CRP及ESR mRNA呈正相關(guān)(P<0.05),CD247 mRNA表達(dá)與CRP mRNA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.5 活動(dòng)期 RA患者治療前后外周血中IL-38及CD247蛋白表達(dá)

活動(dòng)期RA患者治療前外周血IL-38蛋白表達(dá)較治療后下降(P<0.001),CD247蛋白表達(dá)較治療后升高(P=0.007,表4)

表4 活動(dòng)期RA患者治療前后外周血IL-38和CD24蛋白的表達(dá)

2.6 IL-38、CD247蛋白及mRNA診斷RA的效能

ROC分析結(jié)果顯示,RA患者IL-38、CD247蛋白及mRNA的ROC曲線下面積分別為0.841、0.702及0.758(P<0.05),IL-38診斷效能優(yōu)于CD247蛋白及CD247 mRNA;聯(lián)合檢測(cè)分析顯示,IL-38+CD247 mRNA聯(lián)合診斷效能最佳,曲線下面積(AUC)為0.882,檢測(cè)敏感性為66.1%,特異性為100%。見(jiàn)表5及圖3。

注：A、B及C分別IL-38、CD247及CD247 mRNA單獨(dú)診斷結(jié)果,D為IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA聯(lián)合診斷結(jié)果。

表5 IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA對(duì)RA的診斷效能評(píng)價(jià)

3 討論

RA是一種全身性自身免疫性疾病,除了導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失外,還會(huì)帶來(lái)一系列的關(guān)節(jié)外的表現(xiàn),包括類(lèi)風(fēng)濕結(jié)節(jié)、肺部血管受累以及全身合并癥等[11]。研究表明,IL-38、CD247在RA患者中的表達(dá)異常[12-13],故本研究旨在驗(yàn)證RA患者外周血中IL-38、CD247的表達(dá)及其與臨床特征、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性,并評(píng)估其作為RA潛在生物診斷標(biāo)志物的潛力。

有學(xué)者認(rèn)為,由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及其產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子是RA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[14],而T細(xì)胞功能的激活依賴(lài)其表面的T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)-CD3復(fù)合物,CD247作為T(mén)CR-CD3復(fù)合體組裝、表面表達(dá)和信號(hào)級(jí)聯(lián)所必需的蛋白[15],很大可能參與了RA疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。本研究結(jié)果表明,RA患者CD247、蛋白及mRNA的表達(dá)低于健康人群,并在低、中、高疾病活動(dòng)度人群中呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。其可能機(jī)制為:RA中抗炎因子即Treg細(xì)胞可減少T細(xì)胞的激活,從而抑制CD247的表達(dá)水平有關(guān)[16]。進(jìn)一步分析CD247與不同疾病活動(dòng)度的相關(guān)性表明,CD247與RA疾病活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.512,P<0.001),提示CD247可用于評(píng)估RA患者的病情嚴(yán)重程度。同時(shí),治療后CD247表達(dá)升高,緩解期RA患者表達(dá)可基本恢復(fù)至健康人群水平,表明CD247可用于評(píng)估治療效果。

與CD247結(jié)果相反,本研究結(jié)果顯示,IL-38在RA組外周血中的表達(dá)水平高于HC組及非RA組,在高活動(dòng)期病人中呈現(xiàn)高表達(dá),經(jīng)治療后降低,其表達(dá)增高可能為RA發(fā)生后刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的保護(hù)效應(yīng)。多項(xiàng)研究表明,IL-38是一種抑制炎癥的細(xì)胞因子,在RA中起到保護(hù)骨關(guān)節(jié)、抑制滑膜細(xì)胞增生的作用[17]。IL-38可能通過(guò)核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號(hào)通路抑制脂多糖/Toll樣受體4(Lipopolysaccharide/Toll-like receptor 4,LPS/TLR4)誘導(dǎo)的炎癥,減輕RA的炎癥反應(yīng);還可通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen ativated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路,減輕RA的炎癥反應(yīng)[18]。裴冰等[19]對(duì)RA試驗(yàn)動(dòng)物模型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠注射IL-38干預(yù)后,降低了輔助性T細(xì)胞17(T helper 17,Th17)細(xì)胞分泌的促炎因子量、升高了Treg細(xì)胞分泌的抗炎因子量,重新恢復(fù)Th17/Treg平衡,從而減輕RA疾病的發(fā)病與病情的惡化。然而,Mora等[20]也提出IL-38在高濃度條下會(huì)喪失抑炎作用,甚至發(fā)揮促炎因子的作用。本研究結(jié)果表明,RA患者經(jīng)治療后外周血中IL-38的表達(dá)水平較治療前下降,緩解期RA患者IL-38的表達(dá)水平與健康對(duì)照組的表達(dá)無(wú)差異,表明IL-38可評(píng)估RA患者的治療效果。此外,ROC曲線分析結(jié)果表明,單獨(dú)診斷時(shí),IL-38對(duì)RA具有較高的臨床診斷價(jià)值;聯(lián)合診斷時(shí),IL-38聯(lián)合CD247 mRNA檢測(cè)對(duì)RA的診斷有一定的價(jià)值。

綜上所述,本研究IL-38、CD247蛋白及CD247 mRNA參與到RA疾病的發(fā)生發(fā)展中,并且IL-38可能是RA疾病診斷的一個(gè)潛在生物診斷標(biāo)志物。