肖一佳,趙素娥,周若蘭

(南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,湖南 長(zhǎng)沙 410001)

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是多種原因所致的肺功能進(jìn)行性、不可逆性下降,是多種急性和慢性肺損傷最常見的臨床結(jié)果,其主要病理特征包括肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺成纖維細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積,從而導(dǎo)致肺順應(yīng)性降低和氣體交換障礙,最終導(dǎo)致廣泛的瘢痕形成、肺功能喪失,甚至死亡[1]。PF不是單一病因引起的疾病,而是由多種原因引起,如自身免疫/結(jié)締組織疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或硬皮病)、藥物相關(guān)(如抗心律失常胺碘酮或化療藥物博來霉素)、職業(yè)暴露(如長(zhǎng)期粉塵接觸、放射線接觸)或一些過敏原接觸等,臨床上有一部分PF患者因找不到確切病因,稱之為特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)。IPF主要發(fā)生在50歲以上的人群中,診斷時(shí)2/3的患者年齡超過60歲,男性多于女性[2]。在美國和歐洲,IPF的患病率估計(jì)為10～20/10萬人,而診斷后的中位生存期只有3～5年[3-4]。目前臨床上治療PF藥物主要為吡非尼酮和尼達(dá)尼布,但它們不能阻止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展或降低死亡率,只是小幅降低肺功能惡化的發(fā)生率[5-6];且由于脫靶效應(yīng)導(dǎo)致惡心、疲勞和腹瀉等癥狀,患者通常也難以耐受這些藥物,因此臨床迫切需要深入研究PF的發(fā)病機(jī)制,尋找更有效的治療策略。豆科槐屬植物苦參是我國的傳統(tǒng)中草藥,氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是從苦參中提取分離出的一種活性生物堿成分。累積證據(jù)表明OMT具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)特性,例如抗炎、抗腫瘤、抗凋亡、抗纖維化、抗氧化等[7-9]。Xu等[10]證明OMT能夠減輕博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化,這種有益作用與抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺部炎癥和脂質(zhì)過氧化以及減少成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成有關(guān)。盡管如此,OMT在肺纖維化過程中發(fā)揮抗纖維化作用的確切機(jī)制尚未完全闡明。Notch信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物組織中,參與哺乳動(dòng)物胚胎細(xì)胞和成體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等多個(gè)細(xì)胞生理過程。研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)可直接導(dǎo)致肺纖維化,可能還與其下游因子Hes1過表達(dá)導(dǎo)致α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)增加相關(guān)[11]。還有文獻(xiàn)報(bào)道,TGF-β1是Notch信號(hào)通路激活的關(guān)鍵細(xì)胞因子,可通過Smad3上調(diào)Notch受體相應(yīng)配體Jagged1和Notch信號(hào)靶基因Hey1的表達(dá),兩者共同作用于Notch信號(hào)通路的靶基因,誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)發(fā)生[12]。目前關(guān)于OMT是否可調(diào)控Notch信號(hào)抑制PF發(fā)生發(fā)展的研究較少,本研究以人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)為PF細(xì)胞模型,以Notch信號(hào)為靶點(diǎn)深入研究OMT抑制PF作用機(jī)制,探討OMT防治PF的作用及機(jī)制,為PF肺纖維化的防治發(fā)掘新的藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

OMT(純度,98%)購自上海綠谷制藥有限公司,MRC-5細(xì)胞購自北京鼎國長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司,重組人TGF-β1購自美國PeproTech公司,Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT (N-[N-(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨酰]-s-苯基甘氨酸叔丁基酯)購自美國BioGems;Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)來自美國GIBCO公司,ELISA試劑盒來自上海迪澤生物工程公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與造模 MRC-5細(xì)胞分為空白對(duì)照(Control)組、TGF-β1組(TGF-β1 20 μg/L作用24 h)、OMT低劑量(OMT-L)組(0.05 g/L)、OMT高劑量(OMT-H)組(0.1 g/L)和DAPT組(1 μmol/L),其中OMT高、低劑量組及DAPT組實(shí)驗(yàn)時(shí)與TGF-β1同時(shí)加藥處理24 h。

1.2.2CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將MRC-5細(xì)胞根據(jù)一定細(xì)胞密度均勻鋪于96孔板,根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入不同藥物處理24 h,再進(jìn)行細(xì)胞吸光度檢測(cè)。

1.2.3細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 處理后的MRC-5細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min,0.5%Triton-X 100通透20 min,室溫下用10%牛血清白蛋白封閉1.5 h,4 ℃與兔抗α-SMA單克隆抗體(1∶50稀釋度)孵育過夜,次日回收一抗、并在室溫下與二抗(fitc標(biāo)記的羊抗小鼠IgG,1∶50稀釋)孵育1 h,再予以4-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,5 g/L)孵育10 min,最后使用熒光顯微鏡(尼康公司,東京,日本)檢測(cè)熒光吸光度。

1.2.4蘇木精-伊紅染色 按實(shí)驗(yàn)分組要求分組加藥處理,取6孔板上的MRC-5細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定15 min,蘇木精染10 min,多余染料用自來水洗滌,伊紅染色2 min,光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Elisa) 按試劑盒要求操作步驟,標(biāo)準(zhǔn)品的加樣:設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL,然后再加待測(cè)樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL,空白孔除外。溫育:使用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌:揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗。

1.2.6聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR) RNA提取:從-80 ℃冰箱中取出待測(cè)細(xì)胞樣本,加入Trigol液1 mL、劇烈震蕩混勻,室溫放置5 min,使其充分裂解,4 500 r/min離心5 min,吸上清轉(zhuǎn)入無RNase的1.5 mL EP管中;向EP管中加入200 μL氯仿,漩渦震蕩儀震蕩混勻15 s(無分層現(xiàn)象),4 ℃靜置5 min,4 ℃ 4 500 r/min離心15 min,吸取上清液(約600 μL),轉(zhuǎn)移至新的無RNase的1.5 mL EP管中;再按等體積加入異丙醇,上下顛倒充分混勻,靜置30 min,4 ℃ 4 500 r/min 離心10 min,棄上清,RNA沉于管底,加入1 mL 75%乙醇(無RNase水配置),懸浮沉淀,4 ℃ 3 500 r/min離心5 min,棄上清。室溫晾干或真空干燥5～10 min,最后將獲得的總RNA溶于30 μL無RNase水中。反轉(zhuǎn)錄體系:總RNA 2.5 μL、10×Buffer 4 μL、dNTPs(10 mmoL) 1 μL、Oligo(dT)18(50 μmoL) 1 μL、引物(100 μmoL)0.5 μL、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL、DEPC H2O 10.5 μL,總體系20 μL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MRC-5細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,與Control組相比,TGF-β1組顯著增加MRC-5細(xì)胞的增殖,DAPT和OMT組抑制了TGF-β1對(duì)MRC-5細(xì)胞的增殖作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與Control組比較,P<0.01;(2)與TGF-β1組比較,P<0.05。

2.2 MRC-5中的α-SMA表達(dá)

α-SMA是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特異標(biāo)志物,是細(xì)胞模型造模成功的關(guān)鍵。細(xì)胞免疫熒光染色顯示,與Control組比較,TGF-β1組α-SMA明顯增高,而OMT-L、OMT-H組及DAPT組可減少α-SMA表達(dá)。蘇木精伊紅染色結(jié)果顯示,與TGF-β1組比較,OMT及DAPT組減少TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5的細(xì)胞增殖。見圖2、圖3。

注：(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與TGF-β1組比較,P<0.05。

圖3 各組MRC-5細(xì)胞(蘇木精伊紅,×20)

2.3 MRC-5中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)

Ⅰ型和Ⅲ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,通過Elisa試劑盒檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原的分泌。與Control組比較,TGF-β1組細(xì)胞裂解液和細(xì)胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的水平顯著增加,而OMT和DAPT組降低TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解液和細(xì)胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A～B為細(xì)胞上清液及細(xì)胞沉淀Ⅰ型膠原表達(dá)含量,C～D為細(xì)胞上清液及細(xì)胞沉淀Ⅲ型型膠原表達(dá)含量;(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與TGF-β1組比較,P<0.05。

2.4 Smad2、Smad3、Notch3和Hey1的基因表達(dá)

Notch信號(hào)通路主要通過受體與配體結(jié)合及后續(xù)靶蛋白的激活來介導(dǎo)。PCR分析顯示,與Control組相比,TGF-β1組中Smad2、Smad3、Hey1和Notch3的基因表達(dá)水平顯著升高,OMT和DAPT組降低了TGF-β1誘導(dǎo)上述基因表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為Smad2 mRNA表達(dá)含量,B為Smad3 mRNA表達(dá)含量,C為Notch3 mRNA表達(dá)含量,D為Hey 1mRNA表達(dá)含量;(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與TGF-β1組比較,P<0.05。

3 討論

PF是一種進(jìn)行性慢性肺部疾病,其特征是ECM過度積累、膠原蛋白沉積異常,導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)喪失并限制其氣體交換功能[13]。EMT是最重要的肺纖維化的病理過程,也是纖維化疾病發(fā)生、發(fā)展的起始和可逆步驟。TGF-β1是導(dǎo)致纖維化的關(guān)鍵調(diào)控因子,其介導(dǎo)的Smads信號(hào)通路在EMT過程中起重要作用[14]。在正式實(shí)驗(yàn)之前,通過預(yù)實(shí)驗(yàn)CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TGF-β1刺激MRC-5細(xì)胞呈濃度依賴及時(shí)間依賴促進(jìn)細(xì)胞增殖,而DAPT以劑量依賴抑制細(xì)胞增殖,最后根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)以及本研究前期基礎(chǔ),最后確定TGF-β1 20 μg/L作用24 h為肺纖維化細(xì)胞模型,并確定DAPT工作劑量為1 μmol/L。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DAPT組和OMT組處理后可減弱TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。蘇木精-伊紅染色證實(shí),OMT 和 DAPT 顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5 細(xì)胞增殖,以上提示OMT及DAPT可以在體外抑制TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞增殖,然而確切機(jī)制不明。

Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原主要由ECM組成,PF最重要的病理特征是ECM的過量產(chǎn)生[15-16]。α-SMA是評(píng)價(jià)EMT的常用指標(biāo),也是肌成纖維細(xì)胞的特征,可通過ECM的過度分泌導(dǎo)致氣道重塑和纖維化[17-18]。通過細(xì)胞免疫熒光,TGF-β1促進(jìn)MRC-5細(xì)胞分化和且α-SMA表達(dá)增加,而OMT和DAPT組降低了α-SMA的表達(dá),提示OMT組及DAPT組可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞EMT。另外通過Elisa檢測(cè)Ⅰ及Ⅲ型膠原表達(dá),無論是在細(xì)胞上清液還是細(xì)胞裂解液中TGF-β1組可促進(jìn)Ⅰ及Ⅲ型膠原表達(dá),而OMT組和DAPT組均可減少膠原表達(dá)。但OMT是否通過抑制 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)來促進(jìn)膠原蛋白合成尚不清楚。據(jù)報(bào)道,Notch1的激活直接刺激α-SMA表達(dá)并誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化,而Notch的缺失減少肺中的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和膠原蛋白分泌,表明Notch1信號(hào)傳導(dǎo)在纖維化的發(fā)展中起重要作用,升高的Notch3水平導(dǎo)致 PDGFRb 1成纖維細(xì)胞增殖。因此,Notch 信號(hào)在肺泡形成過程中的上皮-間充質(zhì)相互作用中也起著重要作用[19-20]。

Notch3是Notch信號(hào)關(guān)鍵受體[21-22],Hey1是Notch信號(hào)下游關(guān)鍵靶基因[23-24],TGF-β1促進(jìn)MRC-5細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)基因Notch3、Hey1的表達(dá),同時(shí)也促進(jìn)TGF-β通路相關(guān)蛋白Smad2、Smad3的基因表達(dá),這表明TGF-β1可激活Notch信號(hào)通路以誘導(dǎo)PF。然而DAPT組可以減少Smad3、Notch3、Hey1表達(dá),這提示抑制Notch信號(hào)也可間接抑制TGF-β信號(hào)Smad3表達(dá),這提示TGF-β信號(hào)與Notch信號(hào)之間可能存在交叉作用[25]。與TGF-β1處理相比,OMT組可減少上述相關(guān)基因的的表達(dá),提示OMT可抑制TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞增殖并可能與介導(dǎo)Notch信號(hào)通路來防止纖維化。