金宏亮,宣睿*,許立軍

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 泌尿外科,江蘇 蘇州 215004)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤,亦是男性第6大常見腫瘤,在中老年男性中更為常見。PCa在2020年美國男性中的發(fā)病率最高,致死率第2[1]。臨床常用直腸指檢、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSA)水平檢測、前列腺穿刺等手段篩查發(fā)現(xiàn)PCa,并采用根治性前列腺切除術(shù)或放射線治療[2]。大部分 PCa患者在初次就診時已是晚期、無法手術(shù)切除,內(nèi)分泌治療是治療轉(zhuǎn)移性PCa的重要方法,并且治療初期的效果良好。然而,在內(nèi)分泌治療18—24個月,PCa大多數(shù)會進展為去勢抵抗性前列腺癌(castration resisant prostate cancer,CRPC),患者預(yù)后不佳。細胞因子超家族包含趨化因子CXC配體L12(C-X-C motif ligand 12,CXCL12)等多個成員,其作用是誘導(dǎo)、激活和控制不同白細胞亞型的運動,通過影響腫瘤細胞增殖、侵襲而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[3-5]。白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)是一種促炎癥細胞因子,與PCa的發(fā)展有關(guān)[6-8],其除了促進PCa細胞增殖和抗凋亡外、能使PCa細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[9-11];最新研究表明,IL-6與CRPC的發(fā)展有直接關(guān)系,還發(fā)現(xiàn)PCa細胞可自分泌IL-6來推進其惡性程度[6,9]。在臨床治療前列腺的過程中發(fā)現(xiàn),對不同PCa患者使用同一種治療方案后,存在明顯的個體差異性,尤其在CRPC患者和激素敏感性PCa患者中尤為明顯。本研究選取CRPC細胞C4-2和激素敏感性PCa細胞LNCaP為研究對象,采用通量測序觀察CXCL12、IL-6和IDO基因和蛋白在CRPC細胞和激素敏感性PCa細胞中的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 LNCaP細胞株是激素敏感性人PCa細胞株,C4-2細胞株是renCRPCa細胞株,均購自南京凱基生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑與儀器 TRIzol(美國Invitrogen,15596-026),SYBR Green RT-PCR 試劑盒(日本TaKaRa,RR086B),rabbit Anti-GAPDH (中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,KGAA002),分子量37 kDa,稀釋比例1∶5 000,蛋白電泳膠濃度10%。羊抗兔IgG-HRP(中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,KGAA35),Rabbit Anti-IL-6(abcam,ab233706),分子量21 kDa,稀釋比例1∶1 000,蛋白電泳膠濃度10%。Rabbit Anti-CXCL12(abcam,ab155090),分子量11 kDa,稀釋比例1∶10 000,蛋白電泳膠濃度15%。Rabbit Anti-吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO))武漢三鷹,13268-1-AP),分子量42 kDa,稀釋比例1∶1 000,蛋白電泳膠濃度10%。si-NC、si-IL-6和si-CXCL12均由南京凱基生物科技公司設(shè)計合成,MTT和流式細胞術(shù)試劑盒均購自南京凱基生物科技公司,序列如下:si-NC,上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′,下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′;si-IL-6,上游5′-AGACUUGCCUGGUGAAAAU-3′,下游5′-AUUUUCACCAGGCAAGUCU-3;si-CXCL12,上游5′-GGACAUUUCUCUAAGAGAACA-3′,下游5′-UUCUCUUAGAGAAAUGUCCUG-3′。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng) LNCaP和C4-2細胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 ng/L青、鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中,待細胞密度達到90%以上時,進行傳代。

1.2.2高通量mRNA測序 使用featureCounts和StringTie軟件進行基因和轉(zhuǎn)錄本表達量readcount的計算樣本間基因表達水平,隨后計算基因和轉(zhuǎn)錄本的FPKM。利用limma包和DESeq包進行差異表達基因分析比較,篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>=1且P≤0.05。將目標(biāo)基因集合和背景基因向GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)映射,差異表達基因GO功能富集分析,利用超幾何分布進行假設(shè)檢驗,得到Corrected P-Value值,數(shù)值越低富集結(jié)果越顯著。差異表達基因KEGG信號通路分析利用超幾何分布進行假設(shè)檢驗,得到Corrected P-Value值,數(shù)值越小富集結(jié)果越顯著。差異表達基因蛋白互作(PPI)分析,蛋白質(zhì)互作通常包括物理互作和遺傳互作,分析采用STRING數(shù)據(jù)庫,以combined score進行篩選。

1.2.3轉(zhuǎn)染及分組 使用Lipofectamine?3000根據(jù)分組要求分別將si-NC(陰性對照),si-IL-6(或)si-CXCL12轉(zhuǎn)染入LNCaP(或)C4-2(2×108個/L)。Control組細胞給予常規(guī)培養(yǎng);si-NC組細胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下將si-NC轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi);si-IL-6組細胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下將si-IL-6轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi);si-CXCL12組細胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下將si-CXCL12轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)。在培養(yǎng)48 h后,收獲細胞用于進一步的實驗。

1.2.4qRT-PCR法檢測兩種細胞中IDO、CXCL12和IL-6基因表達 采用TRIzol試劑提取總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,隨后用熒光定量試劑盒進行檢測,操作步驟按照試劑盒說明書進行,用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.2.5Western-blot檢測LNCaP或C4-2細胞中CXCL12、IL-6和IDO蛋白表達 加入蛋白酶抑制劑,用BCA試劑盒進行蛋白定量,加入上樣緩沖液,并煮沸5 min,用SDS-PAGE分離蛋白并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉1 h,加入一抗,孵育過夜;洗膜3次后,加入二抗,孵育1 h后洗膜3次,最后進行ECL顯色,使用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進行灰度分析。

1.2.6MTT法檢測LNCaP或C4-2細胞增殖 取各組處于對數(shù)生長期細胞,將MTT(5 g/L,20 μL)溶液加入各組細胞中,常溫孵育4 h后,將培養(yǎng)基去除后,加入二甲基亞砜(150 μL,振蕩處理10 min后,使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測各組吸光度,計算細胞增殖率。

1.2.7流式凋亡術(shù)檢測LNCaP或C4-2細胞凋亡 取各組處于對數(shù)生長期細胞,將細胞懸液用離心機離心(1 200 r/min) 5 min后,除去上清液,1× Binding buffer 50 μL重懸,再加入Annexin V-FITC和PI各5 μL輕搖混勻,避光常溫孵育10 min,加入Binding Buffer 400 μL輕輕混勻,1 h內(nèi)進流式細胞儀分析。

1.2.8Transwell實驗檢測 LNCaP或C4-2細胞侵襲能力 在半透膜上方涂覆一層Matrigel基質(zhì),將下腔室裝滿含有微量補充物的培養(yǎng)基,Transwell插入下腔室,并在上腔室中添加經(jīng)處理后的LNCaP或C4-2細胞懸液(1×108個/L)。將Transwell系統(tǒng)放入細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h后,去除上腔室中的細胞懸液、用PBS洗滌,將下室取出后,加入800 μL甲醇,室溫固定30 min后,PBS洗3次。將小室放置于預(yù)先加有0.1%結(jié)晶紫的溶液中,室溫下反應(yīng)30 min;PBS 漂洗3 次,于倒置顯微鏡下計數(shù),并拍照。

1.2.9劃痕恢復(fù)實驗檢測LNCaP或C4-2細胞遷移能力 取各組處于對數(shù)細生長期細胞,使用槍頭垂直于細胞培養(yǎng)板劃痕,然后使用PBS 溶液沖洗細胞3次,在0、48 h進行拍照并測量劃痕寬度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料比較用t檢驗;計數(shù)資料比較用χ2檢驗;P<0.05表示數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量mRNA測序結(jié)果

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,激素敏感性前列腺癌細胞株LNCaP和去勢抵抗性前列腺癌細胞株C4-2細胞株之間共有3 505個差異基因,其中上調(diào)基因1 695個,下調(diào)的基因1 810個。

2.2 IDO、CXCL12和IL-6基因表達

與激素敏感性前列腺癌細胞LNCaP比較,去勢抵抗性前列腺癌細胞C4-2中CXCL-12 mRNA表達水平顯著升高、而IL-6和IDO mRNA表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注： (1)與LNCap細胞比較,P<0.01。

2.3 LNCaP或C4-2細胞中CXCL12、IL-6和IDO蛋白表達

與激素敏感性前列腺癌細胞LNCaP比較,去勢抵抗性前列腺癌細胞C4-2中CXCL12蛋白表達水平顯著升高、而IL-6和IDO蛋白表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與LNCaP細胞比較,P<0.01。

2.4 si-IL-6敲低對LNCaP或C4-2細胞增殖及細胞凋亡的影響

MTT和流式凋亡術(shù)檢測結(jié)果顯示,兩種細胞的control組、si-NC組LNCaP、C4-2細胞增殖率和凋亡率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示轉(zhuǎn)染過程未對細胞增殖和凋亡造成影響;使用si-IL-6將LNCaP或C4-2細胞中IL-6敲除后,與si-NC組比較,LNCaP細胞的si-IL-6組細胞增殖率顯著降低、而細胞凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而C4-2細胞中,si-IL-6組細胞增殖率和凋亡率雖有一定變化,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：A為流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率情況,B為IL-6對LNCaP或C4-2細胞凋亡的影響,C為IL-6對LNCaP或C4-2細胞增殖的影響;(1)與si-NC組比較,P<0.01。

2.5 si-IL-6敲低后對LNCaP或C4-2細胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示,兩種細胞的control組和si-NC組的LNCaP或C4-2細胞侵襲細胞數(shù)、遷移恢復(fù)率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示轉(zhuǎn)染過程中未對細胞侵襲能力造成影響;使用si-IL-6將LNCaP或C4-2細胞中IL-6敲除后,與si-NC組比較,LNCaP細胞的si-IL-6組侵襲細胞數(shù)、遷移恢復(fù)率均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而C4-2細胞的si-IL-6組侵襲細胞數(shù)和遷移恢復(fù)率雖有一定降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

注：A為IL-6對LNCaP或C4-2細胞侵襲能力的影響,B為IL-6對LNCaP或C4-2細胞遷移能力的影響;(1)與si-NC組比較,P<0.01。

2.6 si-IL-6敲低后對IL-6、IDO和CXCL12基因和蛋白的影響

qRT-PCR和WB結(jié)果顯示,兩種細胞的control組和si-NC組IL-6、IDO和CXCL12 mRNA和蛋白表達比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示轉(zhuǎn)染過程未對IL-6、IDO和CXCL12mRNA和蛋白表達造成影響;與si-NC組比較,LNCaP細胞或C4-2細胞中IL-6和IDOmRNA和蛋白表達均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而CXCL12mRNA和蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

2.7 si-CXCL12敲低后對LNCaP或C4-2細胞增殖和凋亡的影響

MTT和流式調(diào)亡術(shù)檢測結(jié)果顯示,兩種細胞的control組、si-NC組LNCaP或C4-2細胞增殖率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示轉(zhuǎn)染過程中未對細胞增殖能力造成影響;使用si-CXCL12將LNCaP和C4-2細胞中CXCL12敲除后,與si-NC組比較,C4-2細胞的si-CXCL12組細胞增殖率顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而LNCaP細胞的si-CXCL12組細胞增殖率雖有一定降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

注：A為流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率情況,B為CXCL12對LNCaP或C4-2細胞凋亡的影響,C為CXCL12對LNCaP或C4-2細胞增殖的影響;(1)與si-NC組比較,P<0.01。

2.8 si-CXCL12敲低后對LNCaP或C4-2細胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示,兩種細胞的control組、si-NC組的侵襲細胞數(shù)和劃痕愈合率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示轉(zhuǎn)染過程中未對細胞侵襲和遷移能力造成影響;使用si-CXCL12將LNCaP或C4-2細胞中CXCL12敲除后,與si-NC組比較,C4-2細胞的si-CXCL12組侵襲細胞數(shù)和劃痕愈合率均顯著降低(P<0.01);而LNCaP細胞中的si-CXCL12組侵襲細胞數(shù)雖有一定降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

2.9 si-CXCL12敲低后對相關(guān)基因和蛋白的影響

qRT-PCR實驗結(jié)果顯示,兩種細胞的control組和si-NC組IL-6,IDO和CXCL12mRNA和蛋白表達比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示轉(zhuǎn)染過程未對相關(guān)mRNA和蛋白表達造成影響;與si-NC組相比,LNCaP細胞和C4-2細胞中的CXCL12mRNA和蛋白表達均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而IL-6和IDOmRNA和蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖8。

注：A為CXCL12對相關(guān)mRNA表達的影響,B為CXCL12對相關(guān)蛋白表達的影響;(1)與si-NC組比較,P<0.01。

3 討論

長期持續(xù)的慢性炎癥也可能引發(fā)腫瘤等多種疾病[12-13]。有學(xué)者認為,炎癥是全球約25%的癌癥發(fā)生發(fā)展的主要誘因[14]。越來越多的研究表明,趨化因子不僅在炎癥和免疫反應(yīng)中刺激、招募和控制粒細胞運動,還與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)[15,16]。CXCL12是CXCR4的唯一配體。在部分惡性腫瘤中,包括小細胞肺癌、卵巢癌和腦膠質(zhì)瘤,CXCL12對表達CXCR4的腫瘤細胞均有促進增殖和生存的作用[17-19]。本研究結(jié)果顯示,在去勢抵抗性PCa細胞株C4-2中CXCL12表達水平顯著高于激素敏感性前列腺癌細胞LNCaP,由此可以推斷,對激素敏感性PCa細胞使用有效的抗癌藥物更多的有可能是導(dǎo)致CXCL12的失活;細胞實驗結(jié)果顯示,將去勢抵抗性PCa細胞株C4-2中CXCL12表達敲低后,C4-2細胞的生物活性顯著降低;而將激素敏感性PCa細胞株LNCaP中CXCL12表達敲低未見對LNCaP生物活性造成影響,此結(jié)果提示,臨床中針對激素敏感性PCa患者使用CXCL12拮抗劑,其治療效果可能更佳。CRPC細胞可分泌IL-6和IL-6R。兩者結(jié)合后,促進CRPC細胞增殖并抑制其凋亡,保障CRPC細胞持續(xù)分泌IL-6,最終形成惡性循環(huán)[18-21]。IL-6已是激素敏感性PCa惡化為CRPC的重要預(yù)測標(biāo)記物,有助于判斷患者預(yù)后。色氨酸是必需氨基酸之一,主要用于合成大分子蛋白質(zhì),如血清素、免疫球蛋白和褪黑激素等。IDO參與催化色氨酸合成犬尿喹啉,對色氨酸代謝至關(guān)重要[22,23]。色氨酸代謝可激活氨基酸敏感基因GCN2,進而激活酪氨酸激酶途徑。這將引發(fā)細胞周期停滯和自噬,并最終引起免疫細胞失效,而犬尿喹啉酸的堆積可阻礙免疫效應(yīng)細胞生存[24]。腫瘤微環(huán)境中IDO表達增加引發(fā)低色氨酸水平和有毒物質(zhì)犬尿喹啉堆積,抑制免疫細胞的增殖與活性,這是癌細胞免疫逃逸并發(fā)生無限增殖的可能機制之一[25]。本研究結(jié)果推斷,激素敏感性PCa細胞LNCaP生物活性的發(fā)揮可能與IDO和IL-6表達的異常增高密切相關(guān),細胞水平驗證結(jié)果顯示,將LNCaP細胞中IL-6敲除后,LNCaP細胞的生物活性(增殖、侵襲和遷移)能力顯著降低,而凋亡率顯著升高,同時IDO表達水平也顯著降低。然而在C4-2細胞中,將si-IL-6敲除后,IDO表達也顯著降低,但對C4-2細胞的生物活性雖有抑制,但無顯著變化。此結(jié)果提示,臨床治療中使用IL-6/IDO通路拮抗劑對激素敏感性PCa患者治療效果可能更加有效。

綜上所述,CXCL12、IDO以及IL-6在去勢PCa細胞和激素敏感性PCa細胞中存在顯著差異,此差異可能是導(dǎo)致臨床用藥存在明顯個體差異性的重要因素。