萬(wàn)雯,胡曉霞,潘迪,陶玲,付凌云,徐旖旎**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

心脈通膠囊(xinmaitong capsule,XMT)是一種以中醫(yī)典籍為基礎(chǔ)的復(fù)方制劑,由當(dāng)歸、決明子、鉤藤等10味中藥材組成[1],方中以丹參、當(dāng)歸、毛冬青為君藥,具有活血化瘀、補(bǔ)血養(yǎng)心的作用;以牛膝、葛根為臣藥,起到補(bǔ)養(yǎng)肝腎、活血生津之用;佐以鉤藤、決明子、夏枯草、槐米,兼有清肝瀉火、名目止眩功用,全方立足活血化瘀、通脈養(yǎng)心之效果,具有降血壓[2-4]、降血脂[5-6]及治療冠心病[7]、心絞痛[8]、心力衰竭[9]等作用。有研究表明,XMT能顯著降低血漿中內(nèi)皮素的含量,促進(jìn)降鈣素基因相關(guān)肽的產(chǎn)生和釋放,具有良好的抗缺血作用[10]。XMT聯(lián)合貝那普利等常規(guī)降壓西藥應(yīng)用,具有良好的降低收縮壓和舒張壓作用,療效優(yōu)于單純西藥治療[11-12]。XMT聯(lián)合貝尼地平對(duì)老年原發(fā)性高血壓療效顯著,可有效降低患者血壓水平,緩解臨床癥狀,改善血管內(nèi)皮功能和動(dòng)脈彈性功能[3]。XMT亦可用于高血脂治療,XMT聯(lián)合非諾貝特對(duì)飲食控制療法效果不佳的高脂血癥患者,可有效控制血脂、血液流變學(xué)和血管內(nèi)皮功能[5]。付凌云等[13]研究證實(shí),XMT降低高血脂大鼠的血脂水平;曹剛等[14]報(bào)道XMT能夠降低總膽固醇、低密度脂蛋白以及提高高密度脂蛋白水平,也可降低全血的高切黏度和低切黏度;XMT與左卡尼汀聯(lián)合應(yīng)用治療慢性心力衰竭效果較好,可改善患者心功能及血栓前狀態(tài),且安全性好[15]。李謙等[16]的研究證實(shí),XMT降低麻醉犬血壓的同時(shí),并不減少心臟供血,因此推測(cè)其可能與減少心臟后負(fù)荷、舒張外周血管有關(guān)。XMT可以多靶點(diǎn)、多機(jī)制的干預(yù)對(duì)整個(gè)血管系統(tǒng)產(chǎn)生良好的保護(hù)作用。然而,XMT對(duì)血管尤其是胸主動(dòng)脈是否具有舒張功能,仍需深入研究。因此,本研究通過(guò)觀察 XMT對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈條在去甲腎上腺素(noradrenaline,NE)、高鉀、高鈣及無(wú)鈣作用下收縮反應(yīng)的影響,進(jìn)一步探討其對(duì)血管舒張的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康正常6～8周齡雄性Sprague Dawley(SD)大鼠10只,體質(zhì)量200～250 g,購(gòu)自學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(黔)2018-0001,使用許可證號(hào)SYXK(黔)2018-0001]。所有大鼠均于動(dòng)物房檢疫合格,標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房飼養(yǎng),室溫20～22 ℃,相對(duì)濕度 50%,每天交替進(jìn)行 12 h 光照、12 h 黑暗處理,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),HH-601型超級(jí)恒溫水浴箱(江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng)),SQG-4型四腔器官浴槽系統(tǒng)(成都儀器廠(chǎng)),FT-100生物張力傳感器(成都泰盟軟件有限公司)。

1.1.3藥物及試劑 XMT(貴州益佰制藥股份有限公司),重酒石酸去甲腎上腺素注射液(NE,遠(yuǎn)大醫(yī)藥有限公司),Krebs-Henseleit溶液(克-亨氏液),無(wú)鈣Krebs液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠胸主動(dòng)脈條制備 SD大鼠處死后迅速開(kāi)胸并游離胸主動(dòng)脈,置于4 ℃經(jīng)氧飽和Krebs液中,沖洗至無(wú)血跡,剔除多余脂肪及結(jié)締組織,棉簽順血管走行方向擦除動(dòng)脈內(nèi)皮。剪成長(zhǎng)2～3 mm長(zhǎng)的血管環(huán),斜對(duì)角穿線(xiàn),下端固定,使血管環(huán)懸吊于含10 mL Krebs液的恒溫水浴槽(37±0.5)℃中,上端接張力換能器并連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。持續(xù)通以95% O2和5% CO2的混合氣體,將靜息張力調(diào)節(jié)至2 g,15 min換液1次,穩(wěn)定1 h。

1.2.2NE量效曲線(xiàn)的制備及XMT干預(yù)[17]血管環(huán)張力平衡穩(wěn)定后,用1×10-5mmol/L NE使血管收縮,穩(wěn)定后沖洗,重復(fù)此操作數(shù)次使血管收縮達(dá)最大并維持平衡。按0.5對(duì)數(shù)遞增加入NE 1×10-8～1×10-5mmol/L,求得對(duì)數(shù)量效曲線(xiàn),反復(fù)沖洗,平衡1 h使血管張力達(dá)到給藥前水平,依次加入XMT至終濃度為200、400及800 g/L,孵育10 min后再以同法加入NE得到量效曲線(xiàn)。

1.2.3高鉀-量效曲線(xiàn)及XMT干預(yù) 方法同“1.2.2”,以50 mmol/L KCl誘導(dǎo)血管收縮達(dá)最大并維持平衡后,在浴槽中按0.2的對(duì)數(shù)遞增加入 10～100 mmol/L的KCl,可見(jiàn)血管條呈劑量依賴(lài)性收縮。再反復(fù)沖洗并平衡1 h后,依次加入XMT至終濃度為200、400及800 g/L,孵育10 min后再以同法加入KCl得到量效曲線(xiàn)。

1.2.4XMT對(duì)NE在無(wú)Ca2+液中及復(fù)Ca2+后的縮血管效應(yīng) 判斷動(dòng)脈條收縮反應(yīng)穩(wěn)定性的方法同“1.2.2”。平衡1 h,用無(wú)Ca2+的 Kerbs液沖洗,穩(wěn)定3 min,再加入1×10-6mmol/L的NE,動(dòng)脈條產(chǎn)生迅速而短暫的收縮。待舒張平穩(wěn)后,累積加入1.1 mmol/L和2.2 mmol/L CaCl2;隨Ca2+濃度增加,動(dòng)脈條再次收縮并達(dá)峰值,以此作為藥前對(duì)照;然后用正常Kerbs液反復(fù)沖洗,平衡1 h,加入無(wú)Ca2+的Krebs液同時(shí)加入不同濃度XMT,穩(wěn)定10 min,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前再做一次無(wú)Ca2+的NE收縮對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 XMT對(duì)NE收縮血管量效曲線(xiàn)的影響

經(jīng)XMT溶液孵育后,NE量效曲線(xiàn)明顯右下移,最大反應(yīng)變小;隨著XMT濃度的增高,對(duì)NE所致動(dòng)脈條收縮抑制作用增強(qiáng);與對(duì)照組比較,XMT各組中NE的最大收縮率均降低,XMT高、中濃度組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 XMT對(duì)NE所致離體大鼠胸主動(dòng)脈條收縮率的影響

2.2 XMT對(duì)高鉀去極化所致離體大鼠胸主動(dòng)脈條收縮量效曲線(xiàn)的影響

經(jīng)XMT 孵育后,高鉀所致的主動(dòng)脈最大收縮強(qiáng)度明顯下降,高鉀量效曲線(xiàn)呈濃度依賴(lài)性向右下移;與對(duì)照組相比,XMT 3個(gè)濃度中高鉀的最大收縮幅度均降低,XMT高、中濃度組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),XMT低濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 XMT對(duì)KCl所致離體大鼠胸主動(dòng)脈條收縮率的影響

2.3 XMT對(duì)NE在無(wú)Ca2+ 液及復(fù)Ca2+ 液中縮血管效應(yīng)的影響

在無(wú)Ca2+的Krebs液中,NE通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)鈣釋放引起血管收縮,XMT高濃度對(duì)NE引起收縮的抑制率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);復(fù)鈣作為對(duì)照,經(jīng)復(fù)鈣后,結(jié)果顯示XMT對(duì)NE誘導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放所致的離體大鼠胸主動(dòng)脈條短暫收縮有明顯的抑制作用,對(duì)外鈣內(nèi)流具有一定的抑制作用。見(jiàn)表3。

表3 XMT對(duì)NE在無(wú)Ca2+液及復(fù)Ca2+液中動(dòng)脈條收縮抑制率

3 討論

主動(dòng)脈通過(guò)收縮或舒張調(diào)節(jié)血管直徑和血流量,從而維持血壓穩(wěn)定[18]。胸主動(dòng)脈是主動(dòng)脈的一部分,其收縮與舒張?jiān)谡{(diào)節(jié)血流量及血壓中起著至關(guān)重要的作用。眾所周知,血管平滑肌的舒張主要通過(guò)兩種方式實(shí)現(xiàn)[19],一是非內(nèi)皮依賴(lài)性舒張,主要指受試藥通過(guò)直接作用于血管平滑肌,調(diào)節(jié)平滑肌上多重通道,如Ca2+通道、Na+通道等而引起血管舒張;二是內(nèi)皮依賴(lài)性舒張,主要指血管內(nèi)皮細(xì)胞在受試藥等刺激下釋放一氧化氮、前列環(huán)素I2等舒張因子引起血管舒張。血管收縮和舒張受細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平、收縮蛋白的質(zhì)量、信號(hào)轉(zhuǎn)到過(guò)程以及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等的影響。平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度是調(diào)節(jié)血管收縮和舒張的最主要參與者,細(xì)胞內(nèi)Ca2+的下降可導(dǎo)致血管平滑肌舒張。血管平滑肌細(xì)胞收縮所需Ca2+源于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)Ca2+釋放。在血管平滑肌細(xì)胞膜上主要有兩種鈣離子通道,分別為電壓依賴(lài)性鈣通道和受體依賴(lài)性鈣通道[20]。高濃度的KCl可通過(guò)增加平滑肌細(xì)胞外K+水平,誘發(fā)血管平滑肌細(xì)胞膜去極化而使電壓依賴(lài)性鈣通道開(kāi)放,促使細(xì)胞外液中或與細(xì)胞膜疏松結(jié)合的Ca22+內(nèi)流,進(jìn)而導(dǎo)致血管收縮[21]。NE作用于血管平滑肌上的腎上腺素受體,可引起受體依賴(lài)性鈣通道開(kāi)放使得Ca2+內(nèi)流,引起血管收縮。

高血壓病的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜,其中細(xì)胞內(nèi)鈣代謝異常、質(zhì)膜結(jié)合鈣能力、鈣轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,均可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高,血管平滑肌持續(xù)性收縮而導(dǎo)致血壓升高。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的來(lái)源,位于細(xì)胞膜上,調(diào)控細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞的通道稱(chēng)為鈣內(nèi)流通道,位于肌質(zhì)網(wǎng)上調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣庫(kù)的Ca2+釋放的通道稱(chēng)為鈣釋放通道[22]。研究還表明,高血壓病患者對(duì)縮血管物質(zhì)(如腎上腺素等)敏感性增高,而對(duì)擴(kuò)血管物質(zhì)(如前列環(huán)素I2等)敏感性降低。NE作為血管活性物質(zhì),在無(wú)鈣Krebs中,刺激血管平滑肌內(nèi)鈣釋放,導(dǎo)致血管收縮,當(dāng)在無(wú)鈣Krebs中加入CaCl2后,可導(dǎo)致大量的Ca2+內(nèi)流,同時(shí)能激活ROC,不僅使細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流,還促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存在肌質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放,使得胞漿內(nèi)游離Ca2+大量升高。高濃度KCl主要使 電壓依賴(lài)性Ca2+通道開(kāi)放,細(xì)胞外 Ca2+內(nèi)流,也增加細(xì)胞內(nèi) Ca2+的濃度,從而引起血管收縮,血壓升高[19]。從而引起主動(dòng)脈進(jìn)一步收縮,血壓升高。

本研究結(jié)果顯示,在離體條件下,XMT對(duì)NE和KCl引起的胸主動(dòng)脈條收縮有抑制作用,且呈劑量效應(yīng)關(guān)系,其中高、中濃度具有明顯差異性,使其量效曲線(xiàn)明顯右下移,最大反應(yīng)性降低,而低濃度則無(wú)明顯差異性,提示XMT需達(dá)到一定劑量方能有效擴(kuò)張血管,降低血壓?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,XMT中鉤藤含有鉤藤堿、異鉤藤堿,以及當(dāng)歸揮發(fā)油等可發(fā)揮鈣拮抗作用,松弛動(dòng)脈,從而降低血壓[23-24]。XMT中的其他成分均有不同程度擴(kuò)張血管作用,但機(jī)制不明,推測(cè)也與抑制受體依賴(lài)性鈣通道和電壓依賴(lài)性鈣通道開(kāi)放均有關(guān)。在無(wú)鈣溶液中,XMT對(duì)NE引起的動(dòng)脈條收縮有明顯的抑制作用,當(dāng)復(fù)鈣后NE誘導(dǎo)的血管收縮作用由受體依賴(lài)的Ca2+通道開(kāi)放,外鈣內(nèi)流所致,對(duì)NE引起的動(dòng)脈條收縮抑制作用相對(duì)減弱。推測(cè)XMT抑制NE引起的動(dòng)脈條收縮可能與其主要抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)上Ca2+釋放有關(guān),而對(duì)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流抑制作用不顯著。XMT對(duì)于血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度是否有直接調(diào)節(jié)作用,是否影響平滑肌細(xì)胞的內(nèi)鈣釋放,還需進(jìn)一步研究。

本研究提示,XMT抑制血管收縮,降低血壓,可能與鈣激活通道活性有關(guān),胞外Ca2+內(nèi)流減少,胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)上Ca2+釋放減少,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的自身穩(wěn)定,減輕胞內(nèi)Ca2+超載,降低血管平滑肌的收縮性。

綜上所述,本研究明確了XMT對(duì)血管具有舒張作用,其機(jī)制可能與鈣離子拮抗有關(guān),為XMT在抗高血壓方面提供有效的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)于XMT抑制血管收縮的其它機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究,為臨床治療及配方改進(jìn)提供更多依據(jù)。