龍金華,冷吉,曾憲琳,金仙槐

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 頭頸腫瘤科,貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550004)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)發(fā)病率為我國(guó)頭頸部惡性腫瘤之首,放療是NPC的主要治療手段[1]。有研究表明,放療后非轉(zhuǎn)移性NPC患者的5年生存率可達(dá)到67%[2],但仍有30%左右的患者出現(xiàn)放射抗性,發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致治療失敗[3]。放療是一種利用電離輻射破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu),從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖的治療手段[4]。Riva等[5]發(fā)現(xiàn),大劑量放療可增加腫瘤部位CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并延長(zhǎng)模型小鼠的生存期;多位學(xué)者發(fā)現(xiàn),大分割電離輻射可增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答[6-9],還發(fā)現(xiàn)電離輻射劑量與免疫原性細(xì)胞死亡(immunogenic cells death,ICD)有關(guān)[10]。ICD能夠在具有免疫能力的宿主中誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的細(xì)胞死亡方式[11-12],以鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CRT)、高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1,HMGB1)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)等的表達(dá)上調(diào)為標(biāo)志[11-13],ICD的發(fā)生與腫瘤放療的臨床療效密切相關(guān)[14]。目前,大分割放療是否能誘導(dǎo)放射抗性NPC細(xì)胞發(fā)生ICD尚不明確,本研究選取高轉(zhuǎn)移性Epstein-Barr病毒陽(yáng)性細(xì)胞株C666-1和對(duì)應(yīng)的放射抗性細(xì)胞株C666-1R作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究大分割電離輻射對(duì)細(xì)胞周期和ICD相關(guān)標(biāo)志物的影響,為進(jìn)一步優(yōu)化NPC患者的臨床治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

NPC細(xì)胞株C666-1和C666-1R細(xì)胞為廣西醫(yī)科大學(xué)王仁生教授惠贈(zèng)。RPIM-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購(gòu)于Gibco,胎牛血清購(gòu)于Gemini Bio,CCK-8試劑盒購(gòu)于索萊寶,細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)于美侖生物,引物序列購(gòu)于上海生工,cDNA逆轉(zhuǎn)試劑盒購(gòu)于Takara,GAPDH、HMGB1、CRT和HSP70的特異性抗體均購(gòu)于Abcam公司,HMGB1、CRT和HSP70的ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于深圳子科,ATP含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于索萊寶。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和放射處理 C666-1和C666-1R細(xì)胞均培養(yǎng)于含10% FBS的RPIM-1640完全培養(yǎng)基中,待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%～90%,進(jìn)行放射處理,放射劑量為0、2、4、6、8、10、12及14 Gy。

1.2.2細(xì)胞活力檢測(cè) 收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的NPC細(xì)胞,以1×103個(gè)/孔將細(xì)胞種植于96孔板中,常規(guī)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行放射處理;每次每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次,用不加細(xì)胞的完全培養(yǎng)基作為空白孔。放射處理后常規(guī)培養(yǎng)0、24及48 h,每孔加入CCK-8試劑100 μL,37℃孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值。

1.2.3細(xì)胞周期檢測(cè) NPC細(xì)胞照射后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,用70%的乙醇固定過(guò)夜,1 000 r/min離心5 min,棄上清,PBS洗3次,加入PI染料常溫孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè),分析細(xì)胞周期。

1.2.4細(xì)胞HMGB1、CRT及HSP70 mRNA表達(dá) 采用定量RT-PCR分析法檢測(cè),NPC細(xì)胞照射后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)濃度后,取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;RT-PCR利用SYBR Green進(jìn)行,特異性引物見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5細(xì)胞HMGB1、CRT及HSP70蛋白表達(dá) 采用蛋白印跡(Western blot)檢測(cè),NPC細(xì)胞照射后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度后,取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉處理。TBST洗滌3次,加入GAPDH、HMGB1、CRT、HSP70的特異性抗體4℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗,室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,加入ECL發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)蛋白條帶。

1.2.6細(xì)胞培養(yǎng)上清液HMGB1、CRT及HSP70表達(dá) 采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)實(shí)驗(yàn)檢測(cè),收集放射后常規(guī)培養(yǎng)48 h的NPC細(xì)胞培養(yǎng)上清液,根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行HMGBI、CRT和HSP70的含量檢測(cè),最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處讀值。

1.2.7細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測(cè) 收集放射后常規(guī)培養(yǎng)48 h的NPC細(xì)胞于EP管內(nèi),細(xì)胞密度調(diào)整為5×109個(gè)/L,根據(jù)ATP檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書檢測(cè)ATP的含量,最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)340 nm處的OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同分割電離輻射照射對(duì)NPC細(xì)胞活力的影響

為了確定NPC細(xì)胞株對(duì)電離輻射應(yīng)答的時(shí)量效關(guān)系,本研究用CCK-8法檢測(cè)不同分割電離輻射照射結(jié)束后不同時(shí)間(0、24及48 h)C666-1和C666-1R細(xì)胞的活力,結(jié)果(圖1)顯示,C666-1R細(xì)胞活力均高于C666-1細(xì)胞(P<0.05);在常規(guī)分割(2 Gy)照射結(jié)束后48 h,2種NPC的細(xì)胞活力均降低(P<0.05);經(jīng)大分割8 Gy電離輻射照射后,C666-1和C666-1R活力僅有71.6%和74.3%,處于最低水平。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件設(shè)定為,對(duì)照組(0 Gy),常規(guī)分割組(2 Gy)和大分割組(8 Gy),照射后培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

注：A為C666-1細(xì)胞活力統(tǒng)計(jì)圖,B為C666-1R細(xì)胞活力統(tǒng)計(jì)圖;(1)與24 h的0 Gy組比較,P<0.05;(2)與48 h的0 Gy組比較,P<0.05。

2.2 大分割電離輻射照射對(duì)NPC細(xì)胞周期的影響

經(jīng)不同分割電離輻射照射后48 h,C666-1和C666-1R細(xì)胞的細(xì)胞周期如圖2所示,與0 Gy期細(xì)胞比較G2期的細(xì)胞約為23%,經(jīng)8 Gy電離輻射照射后,62%的C666-1細(xì)胞、72%的C666-1R細(xì)胞停留在G2期(P<0.05)。

注：A為C666-1和C666-1R的細(xì)胞周期流式圖,B、C為C666-1和C666-1R的細(xì)胞周期統(tǒng)計(jì)圖,(1)與0 Gy組比較,P<0.05,(2)與2 Gy組比較,P<0.05。

2.3 大分割電離輻射照射對(duì)2種NPC細(xì)胞ICD相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比,經(jīng)常規(guī)分割照射后,2種NPC細(xì)胞中CRT、HMGB1和HSP70 mRNA的表達(dá)均無(wú)顯著變化(P>0.05);經(jīng)大分割照射后,2種NPC細(xì)胞中上述mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05,圖3A)。如圖3B所示,C666-1分泌的CRT隨著電離輻射照射劑量的增加而增加,HMGB1隨著電離輻射照射劑量的增加而減少(P<0.05);C666-1R分泌的CRT、HMGB1及HSP70均隨著電離輻射照射劑量的增加而增加(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示(圖3C),經(jīng)8 Gy大分割照射后的2種NPC細(xì)胞中CRT、HMGB1和HSP70 蛋白表達(dá)均較對(duì)照組上調(diào)(P<0.05)。經(jīng)8 Gy大分割照射后,C666-1R分泌的ATP較對(duì)照組和常規(guī)分割照射增多(P<0.05,圖3D)。

注：A為細(xì)胞中ICD相關(guān)基因mRNA表達(dá),B為細(xì)胞中相關(guān)分泌蛋白的表達(dá),C為細(xì)胞中ICD相關(guān)蛋白表達(dá),D為細(xì)胞上清中ATP含量,(1)與0 Gy組比較,P<0.05,(2)與2 Gy組比較,P<0.05。

3 討論

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),不同電離輻射劑量對(duì)多種腫瘤具有不同的療效和預(yù)后[6-7]。放療作為NPC重要的治療手段,局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是NPC患者常見(jiàn)的治療失敗原因,這可能與NPC細(xì)胞放射抗性獲得有關(guān)。因此,本研究首先檢測(cè)不同劑量(0～14 Gy)電離輻射對(duì)NPC細(xì)胞株C666-1及其放射抗性細(xì)胞株C666-1R細(xì)胞活力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)不同劑量放射處理后的C666-1R細(xì)胞活力均高于C666-1細(xì)胞,表明C666-1R具有更高的放射抗性,這與Huang等[15]的結(jié)果一致。經(jīng)2～14 Gy電離輻射照射后,8 Gy分割能夠?qū)е聝煞N細(xì)胞株的活力降至最低,而大于8 Gy的分割使NPC細(xì)胞的活力顯著增加,這可能是由于電離輻射照射后死亡細(xì)胞脫落,殘存細(xì)胞之間的接觸抑制現(xiàn)象消失,使少數(shù)殘存的細(xì)胞分裂增殖加快,最終表現(xiàn)為細(xì)胞活力的增加[16-17],這與“4R理論”中的細(xì)胞再增生作用相符,即放射損傷的修復(fù)(repair)、再氧合作用(reoxygenation)、細(xì)胞周期的再分布(redistribution)和細(xì)胞再增殖(repopulation),可能與NPC細(xì)胞逐步獲得放射抗性有關(guān)。

電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞的DNA損傷與細(xì)胞死亡密切相關(guān)[18],細(xì)胞出現(xiàn)可修復(fù)的DNA損傷時(shí),細(xì)胞會(huì)停滯細(xì)胞周期的進(jìn)程并進(jìn)行損傷修復(fù)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)NPC細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程與電離輻射分割劑量呈依賴性關(guān)系,大分割照射后停留在G2期的NPC細(xì)胞明顯增加,G2/M檢查點(diǎn)阻斷了細(xì)胞周期的進(jìn)程[20-21]。

大量研究表明,電離輻射照射損傷腫瘤細(xì)胞,從而釋放CRT、HMGB1、HSP70和ATP等分子,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD,增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性[13],進(jìn)而產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。腫瘤細(xì)胞釋放CRT誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn),與C666-1相比,經(jīng)2 Gy電離輻射照射后的C666-1R中CRT、HMGB1和HSP70基因的表達(dá)較低,這可能與C666-1R中脂肪含量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity associated,FTO)表達(dá)顯著上調(diào)有關(guān)[15],FTO的增多能促進(jìn)DNA修復(fù),從而抑制促ICD相關(guān)基因的表達(dá)[24]。與對(duì)照組和常規(guī)分割組相比,經(jīng)8 Gy電離輻射照射后的NPC細(xì)胞表達(dá)的CRT明顯上調(diào),這與細(xì)胞活力和細(xì)胞周期的結(jié)果相一致。此外,大分割電離輻射照射后的NPC細(xì)胞表達(dá)的HMGB1、HSP70和ATP明顯上調(diào)。HMGB1可以介導(dǎo)NF-κB的激活和下游炎癥細(xì)胞因子的應(yīng)答,放大炎癥反應(yīng)[25-26];HSP70和ATP可促進(jìn)DCs成熟和TNF-α的分泌[11],表明經(jīng)大分割電離輻射處理的NPC細(xì)胞可能會(huì)促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,經(jīng)不同分割電離輻射照射后,正常NPC細(xì)胞C666-1的細(xì)胞活力均明顯低于其放療抗性細(xì)胞C666-1R;與常規(guī)分割組相比,大分割電離輻射能更好的促進(jìn)NPC放射抗性細(xì)胞C666-1R的細(xì)胞周期阻滯,并誘導(dǎo)ICD的發(fā)生,啟動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答,進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)展。