唐銀彤,官志忠,陸定艷,陳帥帥,吳忠秀,曹陶濤,郭瑋鈺,劉亭*

(1.貴州醫(yī)科大學 藥學院,貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室,貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室 &貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室,貴州 貴陽 550001; 4.貴州醫(yī)科大學 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心,貴州 貴陽 550004)

近年來,惡性腫瘤的發(fā)病率正逐步上升,國際癌癥機構(gòu)最新全球癌癥數(shù)據(jù)也提示惡性腫瘤的預防及治療至關(guān)重要[1-3]。治療惡性腫瘤的方法包括放射、化學及手術(shù)治療等,但都因具有嚴重的毒副作用而導致患者預后效果不理想,長期生存率也較低[4]。隨著技術(shù)的發(fā)展,靶向治療方案逐漸進入人們的視野[5],并被證明在惡性腫瘤治療方面具有較好功效[6-7]。在表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)家族中,EGF受體突變體Ⅲ(EGF receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)是常見的變異型[8],它是惡性腫瘤的特異性受體,僅在腫瘤細胞表面表達[9];約80%的惡性腫瘤患者過表達EGFRvⅢ基因,包括直腸癌、白血病、卵巢癌、胸腺癌、肺癌和膠質(zhì)母細胞瘤等[10-15];EGFRvⅢ參與信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄等過程,其通常存在于擴增產(chǎn)物中,該類型的突變會導致大量的基因拷貝,從而促進細胞的生長信號轉(zhuǎn)導和有絲分裂,最終加快惡性腫瘤的發(fā)展病程[16-18]。因此,針對EGFRvⅢ抗癌藥物的開發(fā)成為治療惡性腫瘤的熱點之一[19]。黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr)是滇杠柳的干燥根、全株,具有抗腫瘤、祛風除濕及通經(jīng)活血等功效[20],系貴州“十大苗藥”之一,當?shù)鼐用癯Ｒ运逯?、酒劑服?治療風濕痛、擦傷及腫瘤等各種痹病,其提取物具有抗腫瘤活性。研究表明,黑骨藤的乙酸乙酯部位對腫瘤抑制率可高達97.48%,且對白血病的抑制率可達到80.71%[21]。高表達EGFRvⅢ的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系DKMG細胞(human glioblastoma cell line DKMG cells,DKMG)和不表達EGFRvⅢ的人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87MG細胞(U87MG)常用于惡性腫瘤的研究[22],本研究將利用DKMG細胞,探討黑骨藤對其細胞存活率、凋亡率的影響,從信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)及蛋白層面驗證EGFRvⅢ、BCL2-Associated X(Bax)蛋白質(zhì)及B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達情況,從而闡明黑骨藤殺傷DKMG細胞的作用及其機制,為其深入開發(fā)提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 過表達EGFRvⅢ的人膠質(zhì)母細胞瘤細胞株DKMG來源于江西阿普斯戴爾生物技術(shù)有限公司,不表達EGFRvⅢ的人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87MG由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

1.1.2主要藥品與試劑 黑骨藤(貴陽萬東橋),由貴州醫(yī)科大學生藥學教研室劉春花副教授鑒定;血清、Dulbecco's Modified Eagle Medium培養(yǎng)液(DMEM,美國Gibco),胰酶(美國Thermo),Eastep Super總RNA提取試劑盒、MTS細胞增殖與毒力檢測試劑盒(MTS cell proliferation and cytotoxicity detection kit,MTS;北京Promega),凋亡試劑盒(美國BD),實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)所需TB Green qPCR Master Mix(北京Biomed),5×PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑(日本TaKaRa),引物(上海英俊生物技術(shù)有限公司)。EGFRvⅢ引物上、下游分別為5′-GAGTACTGATCGCGAGAG-3′和5′-CTTCTGATAGCTGTCTGC-3′,Bcl-2上、下游分別為5′-ATGTGTCTGGAGAGCGTCA-3′和5′-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3′,Bax上、下游分別為5′-GGTTGTCGCCCTCTTCTACTT-3′和5′-GGAGGAAGTCCAATGTCCAG-3′,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上、下游分別為5′-CATCATCTCCGCCCCTTCTG-3′和5′-CATGGACCGTGGTCATGAGT-3′。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、甘氨酸(glycine,Gly)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、蛋白濃度測定試劑盒(BCA assay,BCA)及牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA;北京Solarbio),苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)和RIPA蛋白裂解液(RIPA lysis buffer,RIPA;大連美倫生物科技),BeyoECL Plus超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(上海Beyotime),甲醇(國藥集團),蛋白預染Maker(上海absin),聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF;德國Millipore),肌動蛋白(Actin,β-actin)、EGFRvⅢ、半胱氨酸蛋酶家族(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3或Cleaved caspase-3)、Bax、Bcl-2一抗及山羊抗兔二抗(英國Abcam)。

1.1.3主要儀器 N50型核酸蛋白檢測儀(德國IM-PLEN),BLOCOL層析柜(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司),Fresco型冷凍離心機和5%CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo),690型酶標儀(上海伯樂),TS200型倒置顯微鏡(日本Nikon),流式細胞儀(美國BD),CFX型實時熒光定量PCR儀、Power Pac Basic型垂直電泳儀、Trans-Blot型蛋白快速濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印儀及GBOXChemiXL1.4型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 利用10% FBS及90% DMEM基本培養(yǎng)液培養(yǎng)DKMG、U87MG細胞,并置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);取P4～P10代生長期且狀態(tài)較好的細胞,進行擴大培養(yǎng)及實驗。

1.2.2細胞分組及細胞毒性檢測 取生長期的DKMG和U87MG細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,細胞密度為2.0×108個/L,待細胞匯合度為80%時,棄舊培養(yǎng)基,分別將2種細胞設為空白(Control,Con)組、100 mg/L(低濃度)黑骨藤組、200 mg/L(中濃度)黑骨藤組及400 mg/L(高濃度)黑骨藤組,空白組加DMEM培養(yǎng)液,其余各組加黑骨藤,并使其終濃度為100、200及400 mg/L的培養(yǎng)液;各組藥物作用細胞24 h,采用MTS檢測各組的吸光度(absorbance,A)值,并計算各組細胞的存活率。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 取生長期的DKMG細胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h,按“1.2.2”項下分組處理24 h,PBS洗滌細胞2次,按凋亡試劑盒避光染色15 min;利用流式細胞儀對樣本進行檢測,數(shù)據(jù)用FlowJo V10軟件進行分析。

1.2.4qRT-PCR法檢測DKMG細胞的GFRvⅢ、Bcl-2及Bax mRNA表達 將DKMG細胞按“1.2.3”項下分組給藥處理24 h,按總RNA提取試劑盒操作流程,提取Con組及低、中、高濃度黑骨藤組DKMG細胞的總RNA。測定各組總RNA濃度,并反轉(zhuǎn)錄為互補DNA(complementary DNA,cDNA);qRT-PCR反應體系為2×Green qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L上下游引物0.5 μL、cDNA 2 μL、加無核酸酶水至20 μL,95 ℃ 60 s預變性,95 ℃ 15 s變性、60 ℃ 30 s退火、72 ℃ 30 s延伸、循環(huán)45次,利用GAPDH管家基因進行歸一化處理,并通過2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測DKMG細胞的EGFRvⅢ、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Cleaved caspase-3蛋白表達 取“1.2.3”項下分組給藥處理24 h的各組DKMG細胞,加RIPA裂解液,提取Con組及低、中、高濃度黑骨藤組細胞的總蛋白,采用BCA試劑盒測定蛋白濃度,變性;取各組蛋白20 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳;恒壓25 V轉(zhuǎn)膜30 min,BSA封閉3 h,加一抗EGFRvⅢ、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Cleaved caspase-3多克隆抗體(稀釋度為1∶1 000);β-actin單克隆抗體(稀釋度1∶2 000);4 ℃層析柜中孵育12 h,回收一抗,1×TBST洗膜5次、5 min/次,室溫孵育二抗(稀釋度1∶2 000)2 h;1×TBST洗膜5次,5 min/次;PVDF膜上均勻滴加ECL Plus超敏曝光液,顯影,Quantity分析蛋白灰度值,以目的蛋白與管家基因β-actin的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 細胞存活率

結(jié)果顯示,與Con組比較,經(jīng)低、中及高濃度黑骨藤組處理后的DKMG細胞存活率降低,且呈濃度依賴性(P<0.05);與Con組比較,低、中及高濃度黑骨藤組U87MG細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：(1)與Con組比較,P<0.05;(2)與低濃度黑骨藤組比較,P<0.05;(3)與中濃度黑骨藤組比較,P<0.05。

2.2 DKMG細胞凋亡率

結(jié)果如圖2所示,與Con組比較,低、中、高濃度黑骨藤組DKMG細胞凋亡率逐漸增加(P<0.05),且呈劑量依賴性改變。

2.3 EGFRvⅢ、Bcl-2及Bax mRNA的表達

結(jié)果如圖3所示,與Con組比較,低、中及高濃度黑骨藤組DKMG細胞中EGFRvⅢ和Bcl-2 mRNA表達呈濃度依賴性降低(P<0.05或P<0.01),但Bax mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 EGFRvⅢ、Bax、Bcl-2、Caspase-3及Cleaved caspase-3蛋白的表達

蛋白表達實驗結(jié)果表明(圖4),中,與Con組比較,低、中及高濃度黑骨藤組DKMG細胞中EGFRvⅢ蛋白表達降低(P<0.05);中、高濃度黑骨藤組DKMG細胞中Bax蛋白和Bax/Bcl-2蛋白比值表達升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05);與Con組比較,低、中及高濃度黑骨藤組DKMG細胞中Cleaved caspase-3蛋白及Cleaved caspase-3/Caspase-3蛋白表達升高(P<0.05),Caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)。

注：A為各蛋白電泳結(jié)果,B為EGFRvⅢ蛋白表達,C為Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2蛋白表達,D為Caspase-3、Cleaved caspase-3及Cleaved caspase-3/Caspase-3蛋白表達;(1)與Con組比較,P<0.05;(2)與低濃度黑骨藤組比較,P<0.05;(3)與中濃度黑骨藤組比較,P<0.05。

3 討論

EGFR家族中,EGFRvⅢ是最容易出現(xiàn)的突變型[23]。它是一種分子量為145 kDa的糖蛋白,由于缺乏胞外富含半胱氨酸的CR1和L1亞結(jié)構(gòu)域,EGFRvⅢ不存在配體結(jié)合的區(qū)域,但能發(fā)生自體二聚體化而被激活[24]。作為組成型激活突變體,EGFRvⅢ會促進惡性腫瘤的發(fā)展,使其成為卵巢、乳腺及神經(jīng)膠質(zhì)等惡性腫瘤治療的研究熱點[25]。目前,靶向EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體及阻斷受體細胞內(nèi)磷酸化的小分子激酶抑制劑,已被臨床批準上市,盡管兩類EGFR抑制劑初始緩解率較高,但大多數(shù)患者最終會出現(xiàn)耐藥[26-27]。因此,以EGFRvⅢ為靶標的藥物逐步進入市場,且針對EGFRvⅢ靶點研制出嵌合抗原受體T細胞免疫、EGFRvⅢ抗體、EGFRvⅢ小分子抑制劑及EGFRvⅢ介導相關(guān)疫苗等多種治療藥物[28]。

研究表明,EGFR表達異常與惡性腫瘤細胞放射敏感性、轉(zhuǎn)移、增殖、血管形成等密切相關(guān),且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展緊密關(guān)聯(lián),其中EGFRvⅢ對腫瘤的預后具有重要作用[29]。抑制EGFRvⅢ能夠降低腫瘤細胞的增殖和致瘤性,從而促進腫瘤細胞的凋亡,這可能與EGFRvⅢ所激活的凋亡信號通路有關(guān)[30]。EGFRvⅢ被激活后,抑制凋亡蛋白Bcl-2表達上調(diào),促使Bax二聚體解離,生成Bax/Bcl-2二聚體增多,從而抑制細胞凋亡[31]。為探討黑骨藤對過表達EGFRvⅢ的DKMG細胞及不表達EGFRvⅢ的U87MG細胞的相互作用,本研究從細胞毒性等方面驗證了其作用機制。本研究首先采用了MTS法測定細胞活性,研究黑骨藤對DKMG細胞及U87MG細胞活力的影響,結(jié)果顯示低、中及高濃度黑骨藤可呈濃度依賴性殺傷DKMG細胞,但對U87MG細胞的毒性無影響;流式細胞術(shù)結(jié)果表明,各濃度黑骨藤能促進細胞凋亡,提示黑骨藤可能通過調(diào)控EGFRvⅢ對DKMG細胞產(chǎn)生細胞毒性,從而發(fā)揮治療作用。

體內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡,一方面在于細胞的毒性作用,而另一方面在于細胞的凋亡過程[32]。在細胞的凋亡過程中常有多種蛋白酶及凋亡基因參與其中,從而促發(fā)了細胞凋亡信號通路,最終導致細胞凋亡[33];Caspase家族參與其中,活化的Caspase-3在凋亡級聯(lián)反應中至關(guān)重要,其可降解DNA損傷修復酶,從而導致細胞凋亡[34];同等重要的Bcl-2蛋白家族中,凋亡信號調(diào)控與抑制細胞凋亡的Bcl-2、Bcl-XL蛋白及促進細胞凋亡的Bad、Bax蛋白等水平高低密切關(guān)聯(lián)[35]。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示,與Con組比較,各濃度組黑骨藤可降低DKMG細胞中EGFRvⅢ和Bcl-2 mRNA表達,對Bax mRNA表達無影響;Western blot結(jié)果表明,與Con組比較,各濃度黑骨藤組可降低DKMG細胞中EGFRvⅢ、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達,提高Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達。

綜上所述,黑骨藤對高表達EGFRvⅢ的DKMG細胞具有細胞毒性,主要是通過降低EGFRvⅢ、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達,上調(diào)Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達,從而促進細胞凋亡,進一步發(fā)揮抗腫瘤活性。