王迪迪,黃玉榮,王建君,左常茜,何磊,楊杰*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,貴州 貴陽 550025; 2.六盤水市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科,貴州 六盤水 553000)

肝癌在癌癥死因中排在第4位[1],其常用治療方法有外科手術(shù)切除、肝動(dòng)脈栓塞、放化療及分子靶向治療等,但治愈率仍然很低[2]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p在肝癌中可通過調(diào)節(jié)膽固醇和甘油三酯來影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[3]。miR-148b-3p作為miR-148/152家族成員之一,理論上與同族miR-148a-3p可以靶向同源基因,可能具有相似的生物學(xué)行為[4],但其在肝癌脂代謝中的作用卻鮮有報(bào)道。本研究通過探索miR-148b-3p對(duì)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為和肝癌中脂質(zhì)代謝的影響,以尋找治療肝癌的潛在靶點(diǎn),為后續(xù)的臨床轉(zhuǎn)化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞來源 人肝臟細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞系Huh7、Hep1均從中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫購買。

1.1.2主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶均購于美國Gibco公司,CCK8試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒、油紅染料、棕櫚酸、油酸及BCA蛋白定量試劑盒均購自北京金式金生物技術(shù)有限公司,miRNA轉(zhuǎn)染試劑盒、miR-148b-3p mimics以及陰性對(duì)照(miR-148b-3p mimics NC)均購自廣州銳博生物公司,Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室購自美國Corning公司;miR-148b-3p引物、U6引物及脂代謝相關(guān)引物由上海生工生物工程有限公司合成,蛋白激酶AMP激活的非催化亞基γ2(PRKAG2)、胰島素誘導(dǎo)基因2(INSIG2)、染色體結(jié)構(gòu)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白9(CHD9)、脂肪酸合成酶(FASN)、硬脂基輔酶A去飽和酶1(SCD1)、過氧化物增殖物激活受體γ(PPAR-γ)一抗及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)購于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,CKX31倒置顯微鏡購于日本Olympus公司,5840R高速離心機(jī)購于德國Eppendorff 公司,3131細(xì)胞培養(yǎng)箱、Scientific全波段酶標(biāo)儀、ND-2000超微量核酸蛋白定量?jī)x均購于美國Thermo公司。

1.2 研究方法

1.2.1交集基因篩選 運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取肝癌、miR-148b-3p、脂代謝通路三者交集的靶基因,使用R語言cor.test函數(shù)對(duì)miR-148b-3p進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn),篩選條件為cor<-0.2 &P<0.001,找出共表達(dá)關(guān)系的基因;使用String軟件對(duì)共表達(dá)基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),得到蛋白的相互作用關(guān)系;使用Cytoscape軟件對(duì)miR-148b-3p調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化,得到網(wǎng)絡(luò)圖;使用TargetScan軟件對(duì)目標(biāo)miR-148b-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),得到其靶基因結(jié)果;使用R語言篩選miR-148b-3p靶基因和共表達(dá)基因的交集基因,得到韋恩圖和交集基因列表;將miR-148b-3p的共表達(dá)基因、靶基因和脂代謝通路取交集,得到交集基因和韋恩圖。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人肝臟細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞系Huh7、Hep1細(xì)胞分別用含有10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng),檢測(cè)miR-148b-3p在3種細(xì)胞中的表達(dá)水平;選取肝癌細(xì)胞系中miR-148b-3p表達(dá)量最低的細(xì)胞系Huh7作為研究對(duì)象,繼續(xù)培養(yǎng)傳代,待培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)達(dá)到80%的細(xì)胞時(shí),將細(xì)胞分為對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-148b-3p NC)及實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-148b-3p mimics),接種于6孔板中,培養(yǎng)密度至50%,備用。

1.2.3PRKAG2、INSIG2、CHD9、FASN、PPAR-γ及SCD1的mRNA表達(dá) 采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法測(cè)定Huh7實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中PRKAG2、INSIG2、CHD9、FASN、PPAR-γ及SCD1的mRNA表達(dá)水平。使用Trizol提取細(xì)胞和組織的總RNA并測(cè)定核酸濃度,取0.4～1 μg RNA 按miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒或RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成;分別以U6或β-acting為內(nèi)參,以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR,miR-148b-3p、PRKAG2、INSIG2、CHD9、FASN、PPAR-γ及SCD1的引物序列見表1;計(jì)算各基因在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的相對(duì)水平(RQ=2-ΔΔCt);重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,每次3個(gè)復(fù)孔。

表1 引物序列

1.2.4細(xì)胞增殖能力 通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的肝癌Huh7細(xì)胞均以2×103個(gè)/100 μL接種于96孔板中,每孔繞邊緣一圈加入100 μL PBS以減少蒸發(fā),隨后放入培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞貼壁后觀察;分別在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL的CCK8試劑后避光孵育1 h;在波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)其吸光度值(OD值),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每組各設(shè)置8個(gè)復(fù)孔。用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆數(shù):按照500個(gè)/孔細(xì)胞種植于6孔板中,并加入1.5 mL的完全培養(yǎng)基孵育,每3天觀察1次細(xì)胞狀態(tài);在第10天顯微鏡下觀察克隆形成情況,每孔加入4%多聚甲醛1 mL于4 ℃冰箱內(nèi)固定60 min,PBS清洗1次;每孔加入0.1%結(jié)晶紫染液1 000 μL,染2 min,雙蒸水洗滌數(shù)次,晾干后拍照并計(jì)數(shù);每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5細(xì)胞遷移能力 通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的肝癌Huh7細(xì)胞均按5×105個(gè)/孔加入6孔板中37 ℃培養(yǎng)過夜,待每孔內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí),用200 μL的槍頭垂直于底部的水平線劃線,隨后用PBS清洗3次;加入無血清培養(yǎng)基,于0 h、48 h在微鏡下拍照并測(cè)定劃痕寬度,記為劃痕距離,同一位置的0 h劃痕距離與48 h的劃痕距離之差即為各組遷移距離(遷移距離=0 h劃痕距離-48 h的劃痕距離),重復(fù)3次,結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.6細(xì)胞侵襲能力 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力:取濃度為 5×105個(gè)/mL的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Huh7細(xì)胞懸液200 μL加入到Transwell小室內(nèi)(含孵育后無血清培養(yǎng)基水化基底膜),下室加入含10% FBS的DMEM 600 μL,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h;PBS清洗后4%多聚甲醛中固定20 min,隨后放入0.1%結(jié)晶紫中染色20 min、自來水中清洗30 s～1 min后取出,中性樹脂封片后在倒置顯微鏡下觀察并拍照,每張玻片在200倍下隨機(jī)拍取3個(gè)視野并計(jì)數(shù),取平均值,重復(fù)3次。

1.2.7油紅O染色觀察脂滴形成 將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的肝癌Huh7細(xì)胞用脂性培養(yǎng)基(油酸鈉∶棕櫚酸鈉=2∶1)刺激,再培養(yǎng)24 h后,用1×PBS清洗3次,4%多聚甲醛2 mL固定30 min(常溫),雙蒸水清洗掉固定液,隨后加入100%丙二醇1 mL 脫水5 min,加入經(jīng)濾菌和預(yù)熱處理的0.5%油紅O染液1 mL于37 ℃孵箱中孵育30 min,85%丙二醇1 mL洗1 min,再用雙蒸水漂洗3次,最后加入l mL的雙蒸水在孔中防止脂滴破裂,隨后在顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂滴形成并拍照。

1.2.8PRKAG2、INSIG2、CHD9、FASN、CD36、PPAR-γ蛋白表達(dá) Western blot法測(cè)定各基因蛋白表達(dá)的相對(duì)水平:取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肝癌Huh7細(xì)胞,依據(jù)BCA蛋白定量試劑盒使用說明提取總蛋白并檢測(cè)濃度和定量;將定量的蛋白樣品分別進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn),以GAPDH作為內(nèi)參,將目標(biāo)蛋白通過SDS-PAGE分離,隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜并在常溫下用含5%脫脂奶粉的TBET封閉1 h、TBST清洗4次,使用PRKAG2、INSIG2、CHD9、FASN、CD36、PPAR-γ、GADPH一抗(1∶1 000)孵育,在4 ℃冰箱中過夜,TBST緩沖液洗膜3次,使用辣根過氧化酶二抗(1∶5 000)孵育1 h,TBST洗膜3次,最后打開V3蛋白印記檢測(cè)分析系統(tǒng)顯色、曝光、拷貝,利用軟件Image J將蛋白曝光圖片進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì),重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 交集基因篩選

將miR-148b-3p的共表達(dá)基因、靶基因和脂代謝通路取交集,得到交集基因韋恩圖,共找到了3個(gè)交集基因,即PRKAG2、CHD9、INSIG2,說明miR-148b-3p在肝癌中可能通過這3個(gè)基因調(diào)節(jié)脂代謝通路。如圖1。

圖1 miR-148b-3p的共表達(dá)基因、靶基因和脂代謝通路交集情況

2.2 miR-148b-3p表達(dá)

結(jié)果顯示,肝癌細(xì)胞系Huh7中miR-148b-3p的表達(dá)量顯著低于Hep1細(xì)胞(P<0.01)和正常肝細(xì)胞系LO2(P<0.001),Hep1中的表達(dá)量也低于LO2(P<0.05)。如圖2。

2.3 細(xì)胞增殖能力

實(shí)驗(yàn)組Huh7細(xì)胞增殖能力在24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)間點(diǎn)均弱于對(duì)照組,提示Huh7細(xì)胞的增殖能力受到了miR-148b-3p的抑制(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組Huh7細(xì)胞克隆形成數(shù)目要顯著少于對(duì)照組(P<0.01)。如圖3、圖4。

注：(1)與對(duì)照組比,P<0.05。

注：A、B分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Huh7細(xì)胞克隆形成結(jié)晶紫染色的結(jié)果,C表示細(xì)胞克隆形成數(shù)的相對(duì)定量結(jié)果;(1)與對(duì)照組比,P<0.01。

2.4 細(xì)胞的遷移能力

轉(zhuǎn)染48 h后,實(shí)驗(yàn)組Huh7細(xì)胞的傷口愈合能力較對(duì)照組顯著減弱,說明miR-148b-3p能夠抑制肝癌細(xì)胞Huh7的遷移能力(P<0.05)。如圖5。

注：圖A表示劃痕實(shí)驗(yàn)的鏡下結(jié)果,B圖為劃痕測(cè)量結(jié)果;(1)與對(duì)照組比較,P<0.05。

2.5 細(xì)胞的侵襲能力

Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿過基底膜的數(shù)量要明顯少于對(duì)照組,說明miR-148b-3p能夠顯著抑制Huh7的侵襲能力(P<0.01)。見圖6。

注：A、B分別表示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Huh7細(xì)胞結(jié)晶紫染色結(jié)果,C表示侵襲細(xì)胞數(shù)的定量結(jié)果;(1)與對(duì)照組相比,P<0.01。

2.6 油紅O染色檢測(cè)脂滴形成情況

油紅O染料發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組脂滴形成較對(duì)照組明顯減少(P<0.01),說明miR-148b-3p抑制了細(xì)胞中的脂滴的形成。見圖7。

注：A、B分別表示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Huh7細(xì)胞脂滴形成的結(jié)果,C表示脂滴形成的定量結(jié)果;(1)與對(duì)照組相比,P<0.01。

2.7 肝癌細(xì)胞中交集基因及脂肪生成指標(biāo)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組Huh7細(xì)胞中,交集基因PRKAG2及INSIG2在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量較對(duì)照組升高(P<0.01、P<0.01),而CHD9則降低(P<0.001),脂肪生成指標(biāo)FASN、PPAR-γ、SCD1 mRNA水平在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量較對(duì)照組均降低(P<0.001、P<0.001、P<0.01)。見圖8和表2。

注：A—F表示各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量;與對(duì)照組相比,(1)P<0.01,(2)P<0.001。

表2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR-148b-3p后交集基因及脂肪生成基因mRNA水平

2.8 肝癌細(xì)胞中交集基因及脂肪生成指標(biāo)基因蛋白的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-148b-3p 能夠引起肝癌細(xì)胞系Huh7中交集基因PRKAG2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)、INSIG2蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)、CHD9蛋白表達(dá)量降低(P<0.05);脂肪生成指標(biāo)基因FASN蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)、PPAR-γ蛋白表達(dá)量降低(P<0.01)、SCD1蛋白表達(dá)量降低(P<0.01)。見圖9和表3。

注：A—F表示蛋白相對(duì)表達(dá)量,G、H表示蛋白條帶結(jié)果;與對(duì)照組相比,(1)P<0.05,(2)P<0.01。

表3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-148b-3p后交集基因及脂肪生成基因蛋白

3 討論

異常脂質(zhì)代謝在癌細(xì)胞中普遍存在,其不僅改變細(xì)胞膜的組成成分及細(xì)胞通透性,還能產(chǎn)生多種脂毒性物質(zhì),從而誘發(fā)異常的生物學(xué)行為[5-7]。這些變化都源自于癌細(xì)胞需要適應(yīng)局部環(huán)境的代謝變化,也就是腫瘤細(xì)胞的“代謝重編程”。脂質(zhì)代謝受到多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié),并與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相互關(guān)聯(lián)[8]。

miR-148/152家族在肝癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[9-11]。miR-148b-3p可通過調(diào)節(jié)相關(guān)通路抑制肝癌的進(jìn)展,其機(jī)制除了抗炎,抗血管形成外,也存在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的可能[9,12]。在本研究中,通過數(shù)據(jù)庫初步證實(shí)miR-148b-3p與肝癌脂代謝通路中存在的交集基因:PRKAG2、INSIG2和CHD9。

PRKAG2是蛋白激酶(AMPK)的亞基基因,它的經(jīng)典功能包括減少肝臟和脂肪組織中的脂肪合成、增加脂肪酸氧化、刺激肌肉葡萄糖攝取和糖酵解[13-14]。INSIG2主要參與脂肪酸和膽固醇合成的調(diào)節(jié)[15],在小鼠體內(nèi)敲除INSIG2后,小鼠肝臟中的膽固醇和甘油三酯積累增多[16]。CHD9的低水平表達(dá)能夠激活Notch信號(hào)的傳導(dǎo)[17],該信號(hào)傳導(dǎo)被認(rèn)為是新陳代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,且Notch1 的單倍體不足會(huì)促進(jìn)脂肪生成和積累[18-19]。由此可見,以上3個(gè)基因與脂代謝的關(guān)系密切相關(guān),這為研究miR-148b-3p與脂代謝的關(guān)系提供了理論依據(jù)。

在脂肪生成指標(biāo)基因FASN、PPAR-γ、SCD1中,FASN是脂肪酸從頭合成過程中的關(guān)鍵酶,也是惡性腫瘤治療的靶點(diǎn)。FASN特異性抑制劑如cerulenin、C75、奧利司他及TVB-2640等,能夠在體內(nèi)外對(duì)各種惡性細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用[20-22]。PPAR-γ在脂質(zhì)的儲(chǔ)存和動(dòng)員、葡糖糖代謝和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[23]。在肝細(xì)胞中,PPAR-γ不僅促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積,還促進(jìn)游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)及甘油三酯攝取的增加[24]。SCD1是硬脂基輔酶A去飽和酶1,其敲低可以降低脂肪肝細(xì)胞中甘油三脂的水平[25]。

在本研究中,過表達(dá)miR-148b-3p能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞中脂滴的形成,肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用也明顯受到抑制。通過上調(diào)miR-148b-3p的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),交集基因中PRKAG2、INSIG2基因的mRNA表達(dá)水平升高,CHD9基因的mRNA表達(dá)水平下降,前者功能與抑制脂肪生成有關(guān),后者是促脂肪生成的基因,這說明上調(diào)miR-148b-3p在肝癌中能夠抑制脂肪的生成。脂肪生成指標(biāo)基因FASN、PPAR-γ、SCD1mRNA表達(dá)量及對(duì)應(yīng)蛋白表達(dá)量均因miR-148b-3p高表達(dá)而降低,提示miR-148b-3p在肝癌脂代謝的上游調(diào)控效應(yīng)中,可能存在多靶點(diǎn)的作用。

綜上所述,過表達(dá)miR-148b-3p可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力,可能與miR-148b-3p抑制了肝癌細(xì)胞的脂代謝有關(guān)。