秦思源,屠秋霞,鄭乾,翟素珍,焦玲,張春林*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,常見于中老年人群,在我國擁有龐大的患病群體[1]。有研究顯示,中國城市中65歲以上人群PD 發(fā)病率約為1.7%[2]。PD臨床表現(xiàn)主要包括靜止性震顫、運動遲緩、肌強直、姿勢步態(tài)異常等運動癥狀以及其他非運動癥狀,典型病理學(xué)特征為中腦黑質(zhì)致密帶(substantia nigra zona compact,SNc)多巴胺 (dopamine,DA)能神經(jīng)元進行性、不可逆性的丟失,殘留的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)以α-突觸核蛋白 (α-synuclein,α-syn)為主要成分的路易小體(lewy body,LB)[3]。PD發(fā)病機制復(fù)雜,涉及α-syn異常聚集、氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)、神經(jīng)炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體功能障礙等致病因素,其中α-syn異常聚集與OS是PD藥物治療的主要靶點[4]。依達拉奉(edaravone,Eda)是一種臨床上用于急性缺血性腦血管病的治療藥物,近年來,作為一種強效的自由基清除劑在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中備受關(guān)注[5]。Eda不僅對急性缺血性腦血管病具有保護作用,而且對多發(fā)性硬化、癲癇及阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在治療作用[6-8];除此之外,Eda在PD動物疾病模型與臨床治療的研究中所發(fā)揮的作用也愈發(fā)引人關(guān)注,如Eda可通過抗氧化對抗細胞凋亡[9],還可通過抑制核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3[NOD (nucleotide-binding oligomerization domain)-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLPR3]炎癥小體的激活和調(diào)節(jié)Ⅰ型/Ⅱ型小膠質(zhì)細胞(microglia 1/2,M1/M2)極化來改善PD大鼠的神經(jīng)行為功能達到抗炎作用[10],還能通過影響線粒體融合和分裂蛋白對線粒體進行調(diào)節(jié)從而治療PD[11]。目前有關(guān)Eda對α-syn表達的調(diào)節(jié)以及對PD的作用機制尚不清楚,因此本研究擬以Eda為活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除劑,探討其對α-syn表達和自噬的作用,以期為Eda“舊藥新用”于PD的修飾治療提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株、蟲株及菌株來源 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12細胞(高分化型)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫;秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegans)轉(zhuǎn)基因蟲株BZ555[Pdat-1::綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)]、NL5901[Punc-54::α-synuclein::黃色熒光蛋白 (yellow fluorescent protein,YFP)+unc-119]及DA2123[Plgg-1::GFP::lgg-1+rol-6 (su1006)];菌株大腸埃希氏桿菌 (Escherichiacoli,E.coli) OP50(尿嘧啶滲漏突變型)均購自美國線蟲遺傳中心(CaenorhabditisGenetics Center,CGC)。

1.1.2主要藥物及試劑 6-羥基DA(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、抗壞血酸及Eda(美國Sigma),杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青-鏈霉素及谷氨酰胺(美國Hyclone),四季青胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;天杭生物),噻唑藍(methylthiazolyl-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量檢測試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒(索萊寶生物),ROS及二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物),自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;美國MCE),α-syn 抗體(美國Abcam),微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B)抗體(美國CST),泛素結(jié)合蛋白p62(sequestosome-1,p62/SQSTM1)抗體(日本MBL),Tubulin抗體(博奧森生物),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(康成生物),Alexa Fluor 488二抗(美國Thermo Fisher),近紅外染料(infrared dye,IRDye)680RD 免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、IRDye 800CW IgG二抗(美國Li-cor),其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器 生物安全柜和CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher),超微量微孔板紫外分光光度計、垂直電泳槽、電泳儀電源及蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad),近紅外雙色激光成像系統(tǒng)(美國Li-cor),倒置熒光顯微鏡(日本Nikon),激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素、1%谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于含有5%CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h換液處理,待單層細胞匯合至80%～90%,0.25%胰蛋白酶消化、傳代,取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2細胞活力檢測 采用MTT比色法檢測6-OHDA對細胞活力的影響,以確定其最適造模濃度。取“1.2.1”項下對數(shù)生長期PC12細胞以1.5×108個/L的密度接種于96孔板,分別使用50～800 μmol/L 6-OHDA 處理24 h,吸棄上清,加0.5 g/L MTT,孵育4 h,加DMSO溶解沉淀,室溫振蕩10 min,使用超微量微孔板分光光度計測量其在490 nm處吸光度值。同樣方法使用10～200 μmol/L Eda預(yù)處理“1.2.1”項下對數(shù)生長期的PC12細胞3 h,再用200 μmol/L 6-OHDA(后續(xù)實驗選擇此濃度為最適造模濃度)處理細胞24 h,最后檢測吸光度,計算各組細胞存活率。

1.2.3熒光探針法、微量法及可見分光光度法檢測細胞的OS水平 取“1.2.1”項下對數(shù)生長期的PC12細胞,以2×108個/L的密度接種于6孔板,分為對照組(不做任何處理)、模型組(6-OHDA處理)及 Eda組(Eda+6-OHDA)。給藥干預(yù)后使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗去藥物,加10 μmol/L 2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)熒光探針,孵育30 min,無血清培養(yǎng)基清洗3次,倒置熒光顯微鏡觀察熒光;使用細胞裂解液處理各組細胞,1 200 r/min離心 20 min,收集上清,按照MDA和SOD試劑盒配制反應(yīng)體系,使用酶標儀檢測吸光度值,計算MDA含量和SOD活性。

1.2.4免疫熒光法檢測細胞中α-syn的表達 取“1.2.1”項下對數(shù)生長期的細胞接種至細胞爬片,分為對照組(不做任何處理)、模型組(6-OHDA處理)及 Eda組(Eda+6-OHDA),藥物處理后、用PBS洗去藥物,依次進行4%多聚甲醛固定、0.2% Triton X-100透膜、3% 牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)封閉、一抗二抗孵育,含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)的封片膠水封片,于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝α-syn免疫熒光的表達。

1.2.5Western blot檢測細胞α-syn和自噬相關(guān)蛋白的表達 提取“1.2.1”項下對數(shù)生長期的細胞,分為對照組(不做任何處理)、模型組(6-OHDA處理)及 Eda組(Eda+6-OHDA),提取各組蛋白進行定量以及變性處理,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜,3% BSA封閉1 h,α-syn(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)、p62(1∶1 000)、Tubulin(1∶5 000)及GAPDH抗體(1∶5 000)一抗4 ℃孵育過夜,次日TBST清洗3次,加IRDye 680RD IgG、IRDye 800CW IgG二抗,避光孵育1 h,清洗,使用Li-cor Odyssey CLx系統(tǒng)進行成像,結(jié)果使用Image J軟件分析。

1.2.6線蟲的培養(yǎng)和同期化 配制標準線蟲生長培養(yǎng)基(nematode growth medium,NGM),以E.coliOP50作為食物,置于20 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)。使用M9緩沖液沖洗收集產(chǎn)卵期線蟲,置于裂解液中裂解3～6 min,收集蟲卵,M9緩沖液清洗2～3次,置于鋪有E.coliOP50的NGM平板上,20 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)20 h,得到同期化的第一階段幼蟲(larva 1,L1)。以上均按照國際化標準程序進行培養(yǎng)。

1.2.7線蟲PD模型建立及實驗分組 取“1.2.6”項下發(fā)育至L3階段的BZ555蟲株,使用M9緩沖液收集至離心管,2 000 r/min離心2 min,M9緩沖液重復(fù)洗滌3次、緩沖液1 mL重懸;上述蟲液分為2份,分別轉(zhuǎn)移至含有10 mmol/L抗壞血酸配制的6-OHDA(濃度50 mmol/L)離心管和只含有等濃度抗壞血酸的離心管中,后者作為對照組,2管均處理1 h,每隔10 min輕柔搖晃。將暴露于6-OHDA的L3線蟲洗凈后分為4份,1份轉(zhuǎn)移至均勻涂有OP50菌液的NGM培養(yǎng)板中記為模型組,其余3份分別轉(zhuǎn)移至含有50、200 及400 μmol/L Eda的培養(yǎng)板中,分別記為低、中及高濃度Eda組。將僅使用抗壞血酸處理的對照組洗凈后轉(zhuǎn)移至涂有E.coliOP50菌液的空白NGM培養(yǎng)板中,20 ℃恒溫氣候箱培養(yǎng)24 h。NL5901、DA2123蟲株以相同方法進行處理分為對照組、模型組和中濃度Eda組后,額外設(shè)置中濃度Eda+3-MA組,即將模型組線蟲轉(zhuǎn)移至含有200 μmol/L Eda+100 μmol/L 3-MA的培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。

1.2.8線蟲的DA依賴行為學(xué)檢測 分別取“1.2.7”項下發(fā)育至L4時期的對照組、模型組、低、中、高濃度Eda組BZ555蟲株40只,置于空白NGM板,使其自由運動以脫去附在身上的E.coliOP50菌液。(1)基礎(chǔ)減緩行為:將線蟲分別放在涂有OP50(B+)和未涂有OP50(B-)的培養(yǎng)板中,適應(yīng)5 min,計數(shù)30 s內(nèi)線蟲的身體彎曲數(shù)。(2)乙醇趨避行為:將培養(yǎng)板劃分為4個象限,取對角2個象限均勻加入75%乙醇50 μL,使線蟲處于平板中央,自由活動30 min,清點各象限線蟲的數(shù)量,計算偏好指數(shù)[preference index,PI;PI=(空白象限線蟲數(shù)量-乙醇象限線蟲數(shù)量)/線蟲總數(shù)]。

1.2.9熒光顯微成像法檢測線蟲DA能神經(jīng)元的損傷與修復(fù) 分別取“1.2.7”項下發(fā)育至L3～L4時期對照組、模型組及中濃度Eda組BZ555蟲株10只,利用2%瓊脂制備瓊脂薄片,使用鹽酸左旋咪唑作為麻醉劑固定線蟲;使用中性樹膠封片,置于倒置熒光顯微鏡下觀察DA能神經(jīng)元。

1.2.10熒光顯微成像法檢測線蟲體內(nèi)ROS水平 分別取“1.2.7”項下對照組、模型組、中濃度Eda組發(fā)育至L3～L4時期的BZ555蟲株10只,收集至離心管,轉(zhuǎn)移至含有50 μmol/L DCFH-DA的NGM板中,避光培養(yǎng)2 h,觀察各組線蟲的ROS變化。

1.2.11Western blot法檢測線蟲體內(nèi)α-syn蛋白的表達 分別取“1.2.7”項下對照組、模型組、中濃度Eda組發(fā)育至L3～L4時期的NL5901蟲株10只,觀察線蟲體壁上α-syn蛋白的熒光變化;同時各組各取10個長滿L4時期線蟲的培養(yǎng)板,離心收集裂解,將提取的線蟲蛋白進行定量及變性處理,SDS-PAGE凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)印至PVDF膜,3% BSA封閉1 h,加α-syn抗體(1∶1 000),Tubulin抗體(1∶5 000),置于4 ℃孵育過夜;次日TBST清潔3次,加IRDye 680RD IgG、IRDye 800CW IgG二抗,避光孵育1 h,清洗,使用Li-cor Odyssey CLx 系統(tǒng)進行成像,結(jié)果使用Image J軟件分析。

1.2.12熒光顯微成像法檢測自噬抑制劑處理前后線蟲自噬小體和α-syn的表達 分別取“1.2.7”項下對照組、模型組、中濃度Eda組以及中濃度Eda+3-MA組發(fā)育至L3～L4時期的NL5901和DA2123蟲株各10只,觀察DA2123線蟲體內(nèi)綠色熒光蛋白標記的自噬小體數(shù)量和NL5901線蟲體壁上α-syn蛋白的熒光表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細胞活力

MTT結(jié)果表明,在50～800 μmol/L 6-OHDA范圍內(nèi)PC12細胞存活率隨著6-OHDA的濃度升高而降低(P<0.01或P<0.000 1或P<0.001);當6-OHDA濃度為200 μmol/L時,PC12細胞存活率約為60%,較符合PD模型的情況,故選擇該濃度為造模濃度。與模型組比較,100 μmol/L Eda組PC12細胞存活率增加(P<0.05),此時PC12細胞存活率恢復(fù)至80%,故將此濃度確定為Eda的保護濃度。見圖1。

注：A、B分別為不同濃度6-OHDA和Eda處理后的細胞存活率;與對照組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.000 1,(3)P<0.001;(4)與模型組比較,P<0.05。

2.2 線蟲的 DA依賴行為學(xué)和DA能神經(jīng)元形態(tài)

基礎(chǔ)減緩行為檢測實驗結(jié)果顯示(圖2A),模型組BZ555線蟲身體彎曲數(shù)相較于對照組明顯減少(P<0.000 1),低、中、高濃度Eda組線蟲身體彎曲數(shù)相較于模型組均有不同程度的增多(P<0.05或P<0.01);乙醇趨避實驗結(jié)果顯示(圖2B),模型組BZ555線蟲的乙醇PI明顯低于對照組(P<0.000 1),低、中、高濃度Eda組線蟲高于模型組(P<0.000 1)。熒光顯微成像結(jié)果顯示(圖2C),與對照組相比,模型組BZ555線蟲DA能神經(jīng)元胞體出現(xiàn)不對稱收縮、GFP減弱且突起處出現(xiàn)大量異?？张?不同濃度Eda組線蟲DA能神經(jīng)元胞體異常收縮現(xiàn)象有減少的趨勢、GFP表達恢復(fù)正常且異?？张蒿@著減少。

注：A為身體彎曲次數(shù),B為乙醇PI,C為DA能神經(jīng)元GFP表達 (200×) ;紅、藍及白色箭頭分別表示咽部神經(jīng)元(anterior deirids,ADEs)、頭部神經(jīng)元(cephalic sensilla,CEPs)及CEPs的細胞突起;(1)與對照組比較,P<0.000 1;與模型組比較,(2) P<0.01,(3) P<0.05,(4) P<0.000 1。

2.3 細胞和線蟲的ROS水平

使用DCFH-DA探針檢測PC12細胞和BZ555線蟲體內(nèi)的ROS,結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組PC12細胞和線蟲體內(nèi)ROS含量明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.001);與模型組比較,Eda組細胞和中濃度Eda組線蟲體內(nèi)ROS含量減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

注：A、B分別為細胞和線蟲中ROS表達,C、D分別為細胞和線蟲ROS定量結(jié)果;A、B中綠色螢光表示ROS含量;與對照組比較,(1) P<0.01,(3) P<0.001;與模型組比較,(2) P<0.05,(4) P<0.01。

2.4 細胞的MDA及SOD水平

使用試劑盒檢測PC12細胞MDA,結(jié)果顯示,模型組PC12細胞MDA含量較對照組明顯增加(P<0.000 1),Eda組細胞MDA含量較于模型組明顯減少(P<0.001);使用試劑盒檢測細胞SOD活力,結(jié)果顯示,模型組細胞SOD活力較對照組下降(P<0.01),Eda組細胞SOD活力較模型組升高(P<0.01)。見圖4。

注：A、B分別為MDA相對含量和SOD活力;與對照組比較,(1) P<0.000 1,(3) P<0.01;與模型組比較,(2) P<0.001,(4) P<0.01。

2.5 細胞和線蟲的α-syn蛋白表達

Western blot和細胞免疫熒光法結(jié)果表明(圖5),模型組PC12細胞中α-syn蛋白表達較對照組明顯升高(P<0.01或P<0.001),Eda組細胞內(nèi)α-syn表達較模型組降低(P<0.05或P<0.01);Western blot和熒光顯微成像法結(jié)果表明(圖6),模型組線蟲α-syn蛋白表達較于對照組升高(P<0.01),中濃度Eda組線蟲體α-syn蛋白表達較模型組降低(P<0.05)。

注：A、B為Western blot檢測結(jié)果及相對表達定量結(jié)果,C、D為細胞免疫熒光法檢測結(jié)果和平均熒光強度定量結(jié)果(藍色熒光表示DAPI染色的細胞核,綠色熒光表示Alexa Fluor 488染色的α-syn);與對照組比較,(1)P<0.01,(3)P<0.001;與模型組比較,(2)P<0.05,(4)P<0.01。

注：A、B為Western blot檢測結(jié)果及相對表達定量結(jié)果;C、D為熒光顯微成像法檢測結(jié)果和定量結(jié)果(綠色熒光表示線蟲體壁的α-syn);(1)與對照組比較,P<0.01;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.6 細胞和線蟲的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、α-syn表達

Western blot實驗結(jié)果表明(圖7),與對照組相比,模型組PC12細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低、p62表達升高(P<0.01);與模型組比較,Eda組PC12細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高、p62表達降低(P<0.05);與Eda組比較,Eda+3-MA組PC12細胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低、α-syn表達升高(P<0.05)。Western blot實驗結(jié)果表明(圖8),模型組DA2123線蟲自噬小體數(shù)量較對照組明顯減少(P<0.001),中濃度Eda組DA2123線蟲體內(nèi)自噬小體較模型組增加(P<0.01),中濃度Eda+3-MA組DA2123線蟲較中濃度Eda組減少(P<0.05);模型組NL5901線蟲體內(nèi)α-syn蛋白表達較對照組升高(P<0.001),中濃度Eda組NL5901線蟲較模型組下降(P<0.01),中濃度Eda+3-MA組NL5901線蟲較中濃度Eda 組增加(P<0.05)。

注：A為LC3的Western blot檢測結(jié)果及相對表達定量結(jié)果,B為p62的Western blot檢測結(jié)果及相對表達定量結(jié)果,C為使用自噬抑制劑后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的Western blot檢測結(jié)果及相對表達定量結(jié)果,D為使用自噬抑制劑后α-syn的Western blot檢測結(jié)果及相對表達定量結(jié)果;(1)與對照組比較,P<0.01;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與Eda組比較,P<0.05。

注：A為DA2123蟲株中自噬小體的熒光顯微成像(綠色熒光代表DA2123線蟲體內(nèi)的自噬小體,白色方框表示自噬小體聚集典型區(qū)域),B為NL5901蟲株中α-syn蛋白的熒光顯微成像(100×,綠色熒光表示NL5901線蟲體壁的α-syn,白色方框表示α-syn蛋白聚集典型區(qū)域),C、D分別為DA2123蟲株中自噬小體和NL5901蟲株中α-syn蛋白的平均熒光強度; (1)與對照組比較,P<0.001; (2)與模型組比較,P<0.01;(3)與Eda組比較,P<0.05。

3 討論

PD是一種以黑質(zhì)DA能神經(jīng)元選擇性死亡和變性為特征的神經(jīng)退行性疾病[12]。DA能神經(jīng)元的丟失導(dǎo)致運動癥狀的出現(xiàn),如運動遲緩、靜止性震顫、僵硬和姿勢不穩(wěn)定,以及非運動癥狀,如睡眠障礙、抑郁及認知缺陷等[13]。PD現(xiàn)有治療主要以藥物DA替代治療為主,雖然有治療效果,但不能很好地延緩病程,且隨著疾病的進展,藥物療效減弱,故尋求一種有效的、針對病因的治療非常重要[14]。

除了OS,α-syn也受到自噬的調(diào)節(jié)。自噬是真核細胞清除蛋白質(zhì)等物質(zhì)的主要通路[25],PD中α-syn的寡聚體和多聚體形式主要是通過自噬途徑進行降解[26]。在自噬缺失的小鼠體內(nèi),發(fā)生了DA能神經(jīng)元死亡,在存活的神經(jīng)元中出現(xiàn)了LB和α-syn內(nèi)源性聚集[27],提示阻斷自噬通路會加劇α-syn異常聚集,從而產(chǎn)生細胞毒性;當使用自噬增強劑時,由α-syn介導(dǎo)的大鼠運動不對稱行為和黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元退行性變等現(xiàn)象明顯減輕[28],提示上調(diào)自噬水平可以降解α-syn,從而達到治療PD的作用。因此,對自噬的調(diào)節(jié)是降解α-syn聚集的關(guān)鍵靶標。

本研究選擇的造模藥物6-OHDA是PD相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)DA的羥基化類似物,可以被DA轉(zhuǎn)運體攝取進入細胞內(nèi),迅速引發(fā)非酶促氧化反應(yīng),抑制膜轉(zhuǎn)運蛋白功能,導(dǎo)致大量氧化物質(zhì)與神經(jīng)遞質(zhì)蓄積,進而抑制線粒體呼吸復(fù)合物Ⅰ的相關(guān)功能[29],造成細胞發(fā)生OS,最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元壞死、缺失,使機體神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)退行性現(xiàn)象[30]。因此,6-OHDA常用于制作氧化損傷的PD模型。線蟲作為小型模式生物,具有繁殖周期短、易于飼養(yǎng)觀察、遺傳背景清晰且易于實驗操作等優(yōu)點[31]。通過對線蟲基因組的分析,發(fā)現(xiàn)其離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)合成酶、受體以及轉(zhuǎn)運體與哺乳動物結(jié)構(gòu)功能相似,同時60%～80% 基因與人類同源,已成為研究神經(jīng)退行性疾病機制的理想模型[32]。其中通過在不同細胞人為導(dǎo)入突觸核蛋白α(synuclein alpha,SNCA)基因使線蟲體內(nèi)過表達α-syn,以及采用6-OHDA等毒性藥物造成線蟲發(fā)生OS或運動功能障礙,以構(gòu)建PD線蟲模型進而給藥干預(yù),是利用線蟲進行PD治療研究常用的手段。

Eda是目前常用的氧自由基清除劑和抗氧化劑,能夠抑制細胞膜性結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),以及氧自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)和核酸損傷,減輕細胞毒性作用[33]。Bandookwala 等[34]研究顯示,Eda可單獨使用或與其他抗氧化劑聯(lián)用達到減輕OS水平的作用,從而對PD相關(guān)的體外模型產(chǎn)生明顯的保護作用。另外,有臨床證據(jù)表明,Eda能夠減輕血管源性PD患者的病情嚴重程度,并改善患者的預(yù)后[35]。這些證據(jù)都提示,Eda對于PD的基礎(chǔ)研究與臨床治療具有一定的潛力。

綜上所述,Eda不僅能作為抗氧化劑減緩氧化應(yīng)激損傷,同時能通過激活自噬通路降解異常聚集的α-syn發(fā)揮神經(jīng)保護作用,但更深入的機制還需要進一步研究和證實。