劉利芳，楊思宇，李撒

（鄭州中農(nóng)快檢科技有限公司 鄭州 451164）

口蹄疫是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的人畜共患傳染病，是畜間發(fā)生于牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播迅速，流行面廣，成年動(dòng)物多取良性經(jīng)過(guò)，幼齡動(dòng)物多因心肌受損而死亡率較高。本病廣泛流行于世界各地，由于本病使動(dòng)物及其產(chǎn)品流通和國(guó)際貿(mào)易受到限制，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將口蹄疫列為動(dòng)物A 類傳染病，我國(guó)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》將其列為一類疫病[1]。目前在我國(guó)，疫苗免疫是最主要手段。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)因在口蹄疫檢測(cè)中具有敏感、特異、穩(wěn)定、安全、快速、簡(jiǎn)單易于操作等特點(diǎn)而備受青睞。本研究利用兩種口蹄疫ELISA 檢測(cè)試劑盒對(duì)血清進(jìn)行檢測(cè)，研究不同試劑盒的應(yīng)用情況，以期選擇更簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的方法用于大規(guī)模檢測(cè)，以便做好口蹄疫防治工作，也有利于試劑盒的不斷改進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣品

1）四份已知中和抗體效價(jià)的豬口蹄疫O 型血清，編號(hào)N 為9 號(hào)、10 號(hào)、11 號(hào)、17 號(hào)。一份已免疫口蹄疫豬只血清，編號(hào)N為20 號(hào)。血清均由河南豬拱門(mén)生物科技有限公司提供。

2）樣品處理：將上述血清分別以2 倍倍比稀釋至1:512，分裝至1.5ml 離心管內(nèi)，并依次編號(hào)為N-1～N-9，含原血清共50 個(gè)待檢樣品。

1.1.2 檢測(cè)試劑

1）口蹄疫病毒A 型、O 型液相阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒。

2）口蹄疫病毒A 型、O 型抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒。

1.1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀（BioTek ELX808）、移液器（Eppendorf）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（精宏DNP-9082）、生化培養(yǎng)箱（精宏SUP-080）。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)：

1）實(shí)驗(yàn)方法主要參考說(shuō)明書(shū)，實(shí)驗(yàn)流程如下：①用ELISA 稀釋液依次1/10 倍稀釋樣本血清、1/10 和1/30 倍稀釋陽(yáng)性血清；②加樣布局如表1 所示，50 μL/孔依次加入陰性對(duì)照、1/10 倍稀釋的樣本血清、1/10 倍和1/30 倍稀釋的陽(yáng)性對(duì)照，室溫孵育1 h；③加酶標(biāo)記物25 μL/孔，室溫孵育1 h；④1×洗液200 μL/孔，洗板4 次；⑤加底物顯色液50 μL/孔，室溫避光孵育20 min；⑥加終止液50 μL/孔，酶標(biāo)儀讀取OD450nm值。

表1 口蹄疫病毒A、O型抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)酶標(biāo)板樣品布局

2）實(shí)驗(yàn)成立條件：A 型陰性對(duì)照OD 值≥0.8，O 型陰性對(duì)照OD值≥1.0；A 型、O 型陽(yáng)性對(duì)照血清的阻斷率在1/10 稀釋時(shí)應(yīng)≥85%，在1/30 時(shí)＞50%。

3）結(jié)果判定：阻斷率≥50%時(shí)為陽(yáng)性；阻斷率＜50%時(shí)為陰性。

1.2.2 液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)：

1）實(shí)驗(yàn)流程：①選擇10 份樣品布局操作，使用5 板，加樣布局如表2 所示，A1～A10：75μl 1×PBST+25μl 待檢樣品；A11～A12：50μl 1×PBST+50μl 陽(yáng)性、陰性對(duì)照；B1～12、C1～H11：50μl 1×PBST；2×倍比稀釋（陰性對(duì)照只稀釋2 孔）50μl/孔；4 個(gè)病毒抗原對(duì)照孔加工作濃度病毒抗原100μl/孔，其余各孔加50μl/孔，37℃溫育30min。②1×PBST 270μl/孔，洗板3 次。③加酶標(biāo)抗體工作液50μl/孔，37℃溫育30min。④1×PBST 270μl/孔，洗板3 次。⑤加混合底物液50μl/孔（TMB 底物A 溶液與B 溶液1:1 混合），37℃溫育15min。⑥加終止液50μl/孔，酶標(biāo)儀讀取OD450nm值。

表2 口蹄疫病毒A、O型抗體液相阻斷ELISA試驗(yàn)酶標(biāo)板樣品布局（板1～板5）

2）實(shí)驗(yàn)成立條件：4 孔病毒抗原對(duì)照OD450nm值應(yīng)在1.0 以上。陽(yáng)性對(duì)照抗體效價(jià)應(yīng)在1:1024±1 滴度以內(nèi)，陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)應(yīng)＜1:8。

3）結(jié)果判定：抗體效價(jià)大于或等于1:128 判為口蹄疫抗體陽(yáng)性；1:64～1:128 時(shí)，判為可疑；小于1:64，判定為陰性?？梢裳鍢悠罚梢灾販y(cè)，重測(cè)抗體效價(jià)大于或等于1:128，判為陽(yáng)性，小于1:128 判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 50 份樣本抗體陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果（表3）

表3 50份樣本抗體陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果

1）從表3 可以看出血清10 號(hào)、11 號(hào)和17 號(hào)三組，O 型固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性數(shù)高于O 型液相阻斷，9 號(hào)和20 號(hào)兩組，O 型液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性數(shù)高于O 型固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒，總體來(lái)說(shuō)，兩種O 型試劑盒檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率差別不大。

2）血清9 號(hào)、10 號(hào)、11 號(hào)和17 號(hào)四組都是O 型抗體血清（無(wú)A 型抗體），A 型固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果全為陰性，無(wú)假陽(yáng)性，符合預(yù)期，但A 型液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的每組均出現(xiàn)了假陽(yáng)性。相對(duì)來(lái)說(shuō)，A 型固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒的特異性較好。

2.2 O 型試劑盒檢測(cè)結(jié)果與中和抗體的線性關(guān)系

1）固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)阻斷值與中和抗體的線性關(guān)系（圖1）

圖1 固相競(jìng)爭(zhēng)-FMD-O-ELISA-BR（%）與中和抗體的線性關(guān)系

O 型固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)值與中和抗體呈現(xiàn)強(qiáng)線性關(guān)系（線性系數(shù)R＞0.9）（圖1），證明此O 型固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒是合適的免疫評(píng)估試劑盒[2]。

2）液相阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)與中和抗體的線性關(guān)系

圖2 顯示此口蹄疫O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒在待檢血清稀釋到512 倍處于高抗原、低抗體水平進(jìn)行檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)中的后帶現(xiàn)象，這是試劑盒不穩(wěn)定的一種現(xiàn)象。液相阻斷試劑盒檢測(cè)連續(xù)被成倍稀釋的血清易得相同的抗體效價(jià)值（如1 024、720、360、180 等），檢測(cè)結(jié)果區(qū)別度不高，這也是試劑盒不穩(wěn)定的外在表現(xiàn)之一。同時(shí)，檢測(cè)范圍受限，高抗體即超過(guò)效價(jià)1 024，就無(wú)法檢測(cè)出來(lái)了。

圖2 液相阻斷-FMD-O-ELISA-Titer 與中和抗體的線性關(guān)系

3 結(jié)論與討論

1）從本次試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)O 型抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒和O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性率相差不大；A 型抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒較A 型抗體液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒特異性強(qiáng)，且A 型抗體固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)值與中和抗體呈現(xiàn)更強(qiáng)線性關(guān)系，穩(wěn)定性較好。

2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A 型抗體液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)O 型抗體血清時(shí)每組均出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，推測(cè)O 型液相阻斷試劑盒是否也會(huì)存在假陽(yáng)性，值得進(jìn)一步驗(yàn)證。

3）綜合來(lái)看，液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒能測(cè)定血清中的具體抗體效價(jià)值，但其特異性、穩(wěn)定性仍需提高，且操作過(guò)程涉及血清梯度稀釋步驟煩瑣，對(duì)人員實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高，同時(shí)一板反應(yīng)板檢測(cè)樣品數(shù)量少（10 份）成本較高，需測(cè)定血清中的具體抗體效價(jià)可選擇液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒。固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒在操作方面同時(shí)具有簡(jiǎn)便、耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，且一板反應(yīng)板檢測(cè)樣品數(shù)量90 份，檢測(cè)成本低。在實(shí)際應(yīng)用中多數(shù)基層檢測(cè)是進(jìn)行口蹄疫抗體定性分析，用于確定口蹄疫抗體水平是否在保護(hù)范圍內(nèi)[3]，因此更推薦基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室選擇使用固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒。■