袁濱 黃藝寧 連燕萍 柯麗娜 吳振強 鄧優(yōu)錦

毛木耳發(fā)酵料堆細菌群落多樣性分析

袁濱1黃藝寧2連燕萍1柯麗娜1吳振強1鄧優(yōu)錦3

（1. 漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建漳州 363005；2. 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福建漳州 363000；3. 福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心 福建福州 350002）

為了探究毛木耳培養(yǎng)料發(fā)酵過程中，微生物群落的多樣性變化以及各時期標記物種，為揭示發(fā)酵機制提供依據(jù)，從而為篩選發(fā)酵過程的有益細菌提供參考。將栽培毛木耳的發(fā)酵培養(yǎng)料混勻建堆，自然發(fā)酵，發(fā)酵周期35 d，從初始開始，每次翻堆前采用5點取樣法取5個平行樣本，一共5組25個樣本；對樣本進行16S rDNA擴增子建庫及測序，并進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明：毛木耳發(fā)酵堆中的微生物多樣性豐富，每個時期的OTU樣本，數(shù)目分別為2 807、 2 271、2 553、2 465和2 106個，建堆期最多，第4次翻堆最少；PCA分析結(jié)果顯示，同一時期的樣本聚集，不同時期的樣本分開；UPGM聚類顯示，每個時期的不同重復(fù)在同一個分支內(nèi)，每個時期形成獨立分支。根據(jù)豐度的占比，在屬水平，發(fā)酵堆中的菌群演化規(guī)律為尿素芽孢桿菌屬從發(fā)酵初期到發(fā)酵完成，相對豐度依次為0.53%，18.51%，20.31%，37.10%和40.85%；嗜熱共生桿菌屬相對豐度依次為2.90%，4.69%，6.88%，7.22%和18.27%，占比逐漸提高；嗜熱雙孢菌屬與己酸菌屬在D0期的相對豐度分別為14.55%與13.42%，發(fā)酵一個月后下降為1.82%與0.08%。隨著發(fā)酵的進行，微生物的α多樣性呈下降趨勢，局部在第二次翻堆有反彈；PCA及UPGM聚類能將各個時期發(fā)酵堆有效分開；在屬水平，發(fā)酵堆的微生物群落從建堆期的嗜熱雙孢菌屬與己酸菌屬演變成發(fā)酵成熟期的尿素芽孢桿菌屬與嗜熱共生桿菌。

毛木耳；發(fā)酵料；16S rDNA擴增子測序

毛木耳（）隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，曾用學(xué)名和，子實體呈韌膠質(zhì)的口感，被稱為“樹上的海蜇皮”，食藥用價值高[1-3]。目前毛木耳普遍采用熟料袋栽蔭棚出耳技術(shù)[4]，但各地具體操作存在較大差異，如山東、江蘇、河南、廣西等地以木屑、玉米芯、木糖醇渣等為主要原料，培養(yǎng)料攪拌均勻后立即裝袋、滅菌；四川什邡等地以棉籽殼、玉米芯、木屑各30%為主要原料，培養(yǎng)料攪拌均勻后堆積12～16 h，再裝袋、滅菌；福建閩南地區(qū)自20世紀80年代開始栽培毛木耳，以木屑等為主要原料，早期菇農(nóng)都是將培養(yǎng)料攪拌均勻后立即裝袋、滅菌，后來將培養(yǎng)料攪拌均勻后堆積發(fā)酵一定時間，發(fā)展至今，閩南地區(qū)菇農(nóng)普遍將培養(yǎng)料堆積發(fā)酵約35 d，期間翻堆4～5次，再裝袋、滅菌，開放式接種，大棚養(yǎng)菌、出耳[5-7]，發(fā)酵模式栽培的毛木耳單產(chǎn)高，品質(zhì)好，病害少。閩南地區(qū)毛木耳一般每年7月后開始堆料，8月下旬開始裝袋、接種，規(guī)模較大的農(nóng)戶需連續(xù)生產(chǎn)至國慶前后，菌包接種后直接上架養(yǎng)菌。菇農(nóng)在生產(chǎn)實踐中選擇培養(yǎng)料先發(fā)酵較長時間，再滅菌、接種，符合當(dāng)?shù)貧夂蛱卣骱驮耘鄺l件。培養(yǎng)料堆積發(fā)酵過程是微生物生長代謝過程中分泌的酶分解有機物的過程，為適應(yīng)營養(yǎng)和環(huán)境的動態(tài)變化，發(fā)酵料中的微生物群落也在動態(tài)變化，某些微生物的出現(xiàn)可以反映發(fā)酵料的腐熟程度[8]。單一微生物不能完全有效降解長鏈高分子化合物，相對復(fù)雜的微生物群落更有利于培養(yǎng)料中纖維的降解及營養(yǎng)素的釋放[9]。因此，研究毛木耳培養(yǎng)料發(fā)酵過程，有助于了解培養(yǎng)料理化性質(zhì)和微生物群落的變化，預(yù)測發(fā)酵過程中的有益菌，能為進一步改善發(fā)酵效果提供理論依據(jù)。近年來，高通量16S rDNA測序被廣泛應(yīng)用于細菌群落多樣性分析。Katarzyna等[10]利用該技術(shù)對雙孢蘑菇發(fā)酵料堆滲濾液的微生物群落進行分析，發(fā)現(xiàn)其中豐度最高的為嗜熱棲熱菌（）。高曉靜等[11]對雙孢菇的堆肥期雜草培養(yǎng)料進行16S rDNA測序發(fā)現(xiàn)，堆肥期的優(yōu)勢菌為普氏菌屬、芽孢桿菌、屬，屬，屬，屬，假黃單胞菌屬等。雋加香等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在麥草雙孢菇發(fā)酵料3次發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌為棲熱菌門、綠彎菌門、變形桿菌門、厚壁菌門和放線菌門。閩南地區(qū)由于特殊氣候條件，菇農(nóng)種植毛木耳時最終選擇較長時間堆料發(fā)酵的模式，現(xiàn)實需求和理論依據(jù)是什么，在發(fā)酵過程中何種微生物對發(fā)酵起作用，到目前為止相關(guān)研究依然比較有限，使得對其發(fā)酵過程中起主要作用的菌群知之甚少。本研究對毛木耳發(fā)酵堆料中的微生物群落進行16S rDNA測序，從而鑒定出各個時期屬及以上分類水平的指示物種信息，明確發(fā)酵期間起作用的微生物菌群，為進一步改善發(fā)酵效果提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

栽培毛木耳的培養(yǎng)料配方為82%的雜木屑（雜木屑粒度≤0.5 cm的占比20%，0.5～1.0 cm占比約35%，1.0～2.0 cm的占比約45%），12%麩皮，3%豆粕，3%輕質(zhì)碳酸鈣，含水量約63%。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 將毛木耳的發(fā)酵培養(yǎng)料混勻建堆，堆高1.5～1.8 m，寬約5 m，長約10 m。間隔10、8、7、5、5 d各進行1次翻堆，共發(fā)酵35 d，取樣5次，分別為D0，D10，D20，D30和D40。每次在翻堆前取樣，取樣位置在料堆表面50 cm深度，采用五點取樣法選取5個點取樣混勻為1個樣本，設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)。堆積發(fā)酵及翻堆過程中不再添加其它物質(zhì)。

1.2.2 微生物群落16S rDNA擴增子測序分析（1）DNA提取 采用HiPure Soil DNA Kits（型號D3142，公司廣州美基生物科技有限公司，產(chǎn)地中國）對樣品總DNA進行提取，具體步驟參照試劑盒的使用說明。樣品DNA濃度采用NanoDrop 微量分光光度計ND2000進行檢測。

（2）PCR擴增、建庫及測序 研究發(fā)現(xiàn)，物種間16S rRNA序列既有物種間高度相似保守區(qū)，也有物種之間有差異的高變區(qū)-V區(qū)，呈交替排列，原核16S rRNA序列包含9個高變區(qū)[8]。Niv等[13]基于SILVA數(shù)據(jù)庫篩選獲得27 013條高質(zhì)量全長16S rRNA序列，在不考慮測序平臺、測序質(zhì)量等條件下，模擬對比6個常用連續(xù)擴增區(qū)域發(fā)現(xiàn)，V3-V4區(qū)和V4-V5區(qū)在各分類層級鑒定的準確性最高。在微生物多樣性的分析時，可優(yōu)先選擇V3-V4區(qū)。因此，本研究擬采用16S rDNA的V3-V4區(qū)進行發(fā)酵料微生物多樣性分析。

PCR擴增條件如下：94℃ 2 min，然后98℃ 10 s，62℃ 30 s (16S V4 區(qū)時，為55℃ 30 s)，68℃ 30 s進行30個循環(huán)，最后68℃ 5 min。使用擴增引物341F: CCTACGGGNGGCW GCAG；806 R: GGACTACHVGGGTATCTAAT，產(chǎn)物片段長度約為466 bp。PCR 反應(yīng)進行一式3份。擴增體系：50 μL 混合物，包含5 μL 10×KOD 緩沖液，5 μL 2 mmol/L dNTPs，3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL下游引物（10 μmol/L），1 μL KOD 聚合酶，100 ng模板DNA。從2%瓊脂糖凝膠中搜集擴增子，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）按照制造商的說明進行純化，并使用ABI StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)（Life Technologies，F(xiàn)oster City，USA）進行定量。純化后的擴增子根據(jù)Illumina平臺進行PE250模式上機測序。該項工作委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

（3）OTU聚類與PCA分析 使用Uparse(Edgar, 2013)軟件將測序獲得的Clean tags進行聚類，設(shè)置相似度≥97%聚類為同一個操作分類單元（Operational taxonomic units, OTU）。采用UCHIME算法對Clean tags存在的嵌合體進行檢查和過濾，獲得的Effective tags進行OTU豐度統(tǒng)計和其他后續(xù)分析。選取豐度最高的Tag作為每個OTU的代表序列，計算每個OTU在各個樣品中的tags豐度信息?；贠TU列表的物種豐度信息，進行主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）；基于歐式距離（Euclidean distances）進行方差分解，對多維數(shù)據(jù)進行降維，從而提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)，研究樣本間的組成距離關(guān)系。分析結(jié)果中，樣品微生物組成越相似，反映在PCA 圖中的距離越近。

（4）稀釋曲線及α多樣性分析 稀釋曲線（Rarefaction curve）用于評價測序量是否足以覆蓋所有類群。不同階段的發(fā)酵料ACE指數(shù)的稀釋曲線，反映物種豐富度的變化趨勢，ACE指數(shù)越大，表明物種豐富度越高。采用α多樣性指數(shù)Shannon、Simpson和Pielou分析樣品中微生物群落多樣性與復(fù)雜度，指數(shù)越高表明群落多樣性越高。采用UPGMA 2.2.1（非加權(quán)組平均法）展現(xiàn)各個樣品的關(guān)系和樣品分組。

（5）物種組成分析 利用注釋軟件RDP 2.2 (Edgar, 2013)將OTU代表序列比對到SILVA數(shù)據(jù)庫，進行物種分離注釋，設(shè)置閾值為0.8～1.0。根據(jù)不同樣品的微生物物種組成分布，采用R語言ggplot 2包繪制物種豐度堆疊圖。

（6）指示物種分析 采用R語言labdsv包計算比較組各個樣品中豐度值>0且總占比>0.1%的物種在每個分組的indicator value，找出各個組的指示物種。使用cross-validation進行統(tǒng)計檢驗，獲得值。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)料發(fā)酵效果與營養(yǎng)成分變化情況

培養(yǎng)料剛堆積發(fā)酵時升溫較慢，36 h后料堆50 cm深處料溫達到52℃，之后逐漸上升，至第3天后料溫達到65～73℃，保持約3 d，之后料溫逐漸下降，料溫降至約60℃前開始翻堆，翻堆后當(dāng)天料溫即可達50℃以上，并快速上升，2 d后料溫達到65～70℃。毛木耳培養(yǎng)料發(fā)酵后期，料堆高溫保持的時間逐漸減少，料溫下降速度增加，若沒有及時翻堆，料堆表面溫度過低，可能會出現(xiàn)墨汁鬼傘，浪費培養(yǎng)料營養(yǎng)，而且料堆底部會因缺氧而局部厭氧發(fā)酵，因此后期翻堆間隔時間逐漸縮短。發(fā)酵成功的培養(yǎng)料，顏色由本色逐漸變?yōu)榛液稚琾H約7.5，有大量白色放線菌等有益菌的生長，料堆沒有刺鼻的氨味，而是有一股清香味。

發(fā)酵前后，培養(yǎng)料營養(yǎng)成分發(fā)生較大的變化。從表1可以看出，培養(yǎng)料全氮含量從發(fā)酵前的0.43%提高至發(fā)酵后的0.83%，C/N從88.0降低至43.92；粗纖維含量從45.88%減少至39.56%，可溶性糖含量減少更加顯著，從1.95%減少至0.52%。發(fā)酵前后，全氮含量增加了93.02%，粗纖維和可溶性糖含量分別減少了13.78%、73.33%。真菌是喜糖生物，在形成菌落初期主要利用葡萄糖、果糖等可溶性糖類，發(fā)酵料不容易感染鏈孢霉可能與可溶性糖等物質(zhì)的減少有關(guān)。

表1 發(fā)酵料營養(yǎng)成分分析

2.2 擴增子16S rDNA測序數(shù)據(jù)分析

2.2.1 OTU聚類與α多樣性分析 對每個時期的16S rDNA進行測序數(shù)據(jù)及質(zhì)控后，共獲得2 768 296條有效序列，平均每份樣品獲得106 473條。每個時期的OTU平均數(shù)目分別為2 807、2 271、2 553、2 465和2 106個。ACE指數(shù)稀釋曲線如圖1顯示，所有樣本的測序深度趨于平臺期，曲線趨于平緩，已覆蓋了大部分微生物，表明測序數(shù)據(jù)足夠符合分析要求。從不同階段的OTU數(shù)目可以看出，隨著發(fā)酵與翻堆次數(shù)的增加，微生物的豐富度整體呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，第4次發(fā)酵與翻堆的OTU數(shù)目最低，平均為2 106個（表2），局部在第2次翻堆有細微反彈。

圖1 發(fā)酵料堆不同階段的ACE指數(shù)稀釋曲線

ACE稀釋曲線中，橫坐標為從某個樣本中隨機抽取的測序條數(shù)，縱坐標為基于該測序條數(shù)能構(gòu)建的OTU數(shù)量的指數(shù)，用來反映測序深度是否達到飽和的情況，不同的樣本使用不同顏色的曲線表示。

表2 基于細菌16S rDNA測序的發(fā)酵料堆不同階段的細菌群落文庫構(gòu)建引物及OTU信息

注：有效標識.不同發(fā)酵階段測序質(zhì)控后的平均有效數(shù)據(jù)，后續(xù)分析用該數(shù)據(jù)進行；操作分類單元總數(shù).不同發(fā)酵階段測序質(zhì)控后的OTU總數(shù)量。

α多樣性是指特定生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性情況，通常利用物種豐富度（種類情況）與物種均勻度（分布情況）2個重要參數(shù)來計算。α多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、Pielou，圖2-A、2-B、2-C）的組間差異性統(tǒng)計檢驗表明，D0時期微生物物種豐富度較高，D30與D40時期的微生物多樣性會顯著低于D10與D20時期。據(jù)多樣性指數(shù)分析顯示，在建堆前期微生物種類和數(shù)量有上升，這可能是由于堆肥初期營養(yǎng)比較豐富，培養(yǎng)料中易被降解的有機質(zhì)的存在使得一些競爭性菌滋生，微生物數(shù)量升高。隨著發(fā)酵的進行，嗜熱微生物的大量繁殖進一步消耗了這些易于降解的碳源，這些競爭性菌大量死亡，于是微生物多樣性指數(shù)下降[14]。

2.2.2 各發(fā)酵時間樣本聚類及主成分分析 不同發(fā)酵料堆階段的樣品都具有階段性特性，往往可能表現(xiàn)出各自聚集的分布情況。如圖3-A所示，不同階段的發(fā)酵料堆微生物群落有所不同，每個階段的組內(nèi)重復(fù)樣本聚類在一起，不同的階段分開，表明組內(nèi)重復(fù)性好，組間區(qū)分度較好。同時，UPGMA聚類樹也顯示，每個時期的樣本能夠較好分開，每個時期內(nèi)部聚集（圖3-B）。PCA分析及聚類樹分析均將各個時期有效分開，表明利用發(fā)酵堆中的微生物信息將發(fā)酵堆進行區(qū)分具有可行性。

圖2 發(fā)酵料堆不同階段的微生物群落α多樣性指數(shù)

A.主成分分析PCA，展現(xiàn)每個樣本的距離關(guān)系與聚類情況；B.UPGMA聚類樹。

2.2.3 微生物門、屬分類水平上的組成與豐度 根據(jù)OTU物種注釋結(jié)果，全部序列共注釋到了35個門，其中厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）是最主要的4個門（圖4-A），并在不同的發(fā)酵階段具有明顯的變化。厚壁菌門在所有階段中占有絕對優(yōu)勢，相對豐度分別為46.13%，62.78%，66.51%，78.81%與84.34%，各時期中在D0期的相對豐度最低，并隨翻堆次數(shù)與發(fā)酵時間的增加而升高，在D40期的相對豐度達到最高值。放線菌門在D0期相對豐度最高，為22.77%，在D30與D40期分別為2.78%與2.97%。變形菌門（Proteobacteria）在D0期相對豐度最高，為13.09%，在D40期最低，為2.25%。擬桿菌門（Bacteroidetes）在D0期的相對豐度最高，為10.59%，在D40期最低，為0.22%。放線菌門、變形菌門與擬桿菌門的相對豐度都隨著翻堆次數(shù)與發(fā)酵時間的增加而下降，趨勢一致。

從屬水平分析顯示，尿素芽孢桿菌屬、嗜熱共生桿菌、嗜熱雙孢菌屬、瘤胃梭菌屬、己酸菌屬Caproiciproducens是屬水平優(yōu)勢菌種（圖4-B），在不同階段的發(fā)酵料堆變化幅度大。尿素芽孢桿菌屬在不同時期的相對豐度依次為0.53%，18.51%，20.31%，37.10%和40.85%。其中，在D0期比例最低，不占優(yōu)勢，卻隨著翻堆次數(shù)與發(fā)酵時間的增加而顯著提高，在D40期為最高比例的優(yōu)勢菌屬。嗜熱共生桿菌屬相對豐度依次為2.90%，4.69%，6.88%，7.22%和18.27%，占比逐漸提高。瘤胃梭菌屬相對豐度依次為3.56%，1.62%，9.04%，8.79%和6.52%，在發(fā)酵后期呈現(xiàn)增長。嗜熱雙孢菌屬與己酸菌屬，在D0期的相對豐度分別為14.55%與13.42%，發(fā)酵1個月后，相對豐度下降為1.82%與0.08%。

利用堆疊圖能直觀展示發(fā)酵不同階段群落中的物種組成情況。挑選在所有樣本中的豐度均值排名前10的物種詳細展現(xiàn)，其他已知物種歸為others。

圖4 發(fā)酵料堆樣品在門（A）和屬（B）分類水平上細菌種類和相對豐度

2.2.4 微生物指示物種（Indicator）分析、與在發(fā)酵前期所占豐度非常高，成熟的發(fā)酵料卻非常低，可以作為發(fā)酵不充分的指示物種。

嗜熱厭氧菌科的，芽孢桿菌科的，芽孢桿菌屬，假黃單胞菌，在發(fā)酵中期D10和D20期含量豐富，可作為發(fā)酵主體物種，其對培養(yǎng)料的分解及利用，以及所產(chǎn)生的可能對有害菌抑制的次生代謝產(chǎn)物可進行深入研究。在高溫有氧條件下，可利用葡萄糖和木糖快速生長[15]，在發(fā)酵D10時期生長溫度適宜，生長較快，因此，在D10期測得豐度最高，隨著競爭菌群的增殖以及自身對易降解的C源的消耗，其生長速度降低，豐度減小。

為異氧硝化、好氧反硝化菌，在高溫階段產(chǎn)生抗生素抑制致病菌的同時產(chǎn)生木質(zhì)纖維素胞外酶分解木質(zhì)纖維素。在高濃度有機碳環(huán)境下，假黃單胞菌屬自身好氧代謝會大量產(chǎn)熱，熱量一部分用于細胞合成和代謝，多余部分則以熱的形式散發(fā)，其表現(xiàn)在宏觀上使得外界溫度升高，因此其在D10期升溫期豐度較高，后期由于氧氣的消耗而增長停滯，逐漸減少[12]。

從圖5可以看出，越靠近發(fā)酵后期（D40），尿素芽孢桿菌屬與嗜熱共生桿菌屬會顯著變高，可以作為發(fā)酵后期、發(fā)酵料堆成熟的指示物種。尿素芽孢桿菌作為一種芽孢桿菌，是一類防治植物病害的重要生物資源，廣泛存在于土壤、植物內(nèi)部及表面，對環(huán)境無影響，對人和動物無毒害，且具有廣譜抑菌活性。芽孢桿菌對病原微生物的生長及代謝抑制作用主要源于其自身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如酶類、細菌素、脂肽類及成分復(fù)雜的揮發(fā)性物質(zhì)等[16]。嗜熱雙孢菌在發(fā)酵前期豐度高，嗜熱細菌具有十分豐富的酶系，對纖維素、木質(zhì)素等復(fù)雜碳水化合物具有較強的生物轉(zhuǎn)化功能[17]。

圖5 發(fā)酵料堆樣品在屬水平指示物種（Indicator）分析

Indicator分析基于物種在樣本中的豐度和出現(xiàn)頻率，計算各物種在每個分組的indicator value (IndVal)，數(shù)值越大表示物種作為該分組指示物種的可能性越大，即越有可能是該分組的指示物種。

3 討論與結(jié)論

筆者調(diào)研發(fā)現(xiàn)，盡管毛木耳培養(yǎng)料長時間的堆積發(fā)酵后原料會損失，一般體積減少約30%，但發(fā)酵質(zhì)量過關(guān)的培養(yǎng)料，即便是開放式接種，接種后基本不出現(xiàn)不吃料、綠霉感染等情況，整個栽培周期菌包不會感染鏈孢霉，毛木耳單產(chǎn)高，品質(zhì)好。試驗表明，發(fā)酵好的培養(yǎng)料裝袋、常壓滅菌后，單獨接種鏈孢霉后該菌絲不能正常生長；菌包兩頭分別接種毛木耳、鏈孢霉時，毛木耳菌絲正常生長，最終覆蓋整個菌包，并正常出耳。未發(fā)酵培養(yǎng)料直接常壓滅菌時，較易出現(xiàn)滅菌不徹底等問題，養(yǎng)菌、出耳期間感染鏈孢霉的風(fēng)險很大，且一旦感染，擴散速度極快，最終往往造成“全軍覆滅”；未發(fā)酵培養(yǎng)料參照杏鮑菇菌包高壓滅菌時，基本未出現(xiàn)滅菌不徹底等現(xiàn)象，恒溫養(yǎng)菌，在適溫條件下出耳，其第一潮木耳產(chǎn)、質(zhì)量稍優(yōu)于發(fā)酵后常壓滅菌菌包的第一潮耳；未發(fā)酵培養(yǎng)料高壓滅菌的，若接種后直接大棚內(nèi)上架、養(yǎng)菌，閩南地區(qū)9月當(dāng)?shù)仄骄鶞囟?6～34℃，菌包極易出現(xiàn)“燒菌”，嚴重影響菌包質(zhì)量，且容易感染鏈孢霉，最終嚴重影響產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究表明，毛木耳培養(yǎng)料經(jīng)過較長時間發(fā)酵后，全氮含量較未發(fā)酵料提高了90.02%，C/N從88.0降至43.92，而粗纖維和可溶性糖則分別降低了13.78%、73.33%，毛木耳發(fā)酵料不容易感染鏈孢霉，可能與可溶性糖等物質(zhì)的減少有關(guān)[7]。

本文對毛木耳發(fā)酵堆料中的微生物群落進行16S rDNA測序，能夠有效利用該方法將各發(fā)酵時期分開，并得到各個時期屬及以上分類水平的指示物種信息。筆者檢測到木耳堆料發(fā)酵的優(yōu)勢菌中有放線菌門、厚壁菌門等。張麗麗[18]發(fā)現(xiàn)，主導(dǎo)秸稈木質(zhì)纖維素降解的功能微生物包括細菌中的放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes），這與本研究結(jié)果一致。宏基因組學(xué)的運用確立了嗜熱放線菌在木質(zhì)纖維素生物降解方面的關(guān)鍵地位，及其產(chǎn)生降解酶的工業(yè)開發(fā)潛力[19]。筆者還發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中，噬熱菌是堆肥過程中的優(yōu)勢菌，在培養(yǎng)料發(fā)酵中升溫和維持高溫有重要的作用，這些微生物群落將培養(yǎng)料生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)楹唵蔚臒o機物，可供菌絲生長利用，同時在降解過程中釋放熱量，使堆肥內(nèi)部產(chǎn)生高溫，在加速堆肥熟化過程中同時滅殺了病原微生物，即使堆肥完成后的滅菌不完全，在此階段也減少了有害菌的增殖[20]。在D10時期，假黃單胞菌屬可作為該時期的指示物種，Anna等[21]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥過程中，該菌屬與纖維素的迅速降解相關(guān)。Angolucci等[22]在以橄欖枝廢料為原料的堆肥中加入芽孢桿菌和假黃單胞菌劑，提高了對橄欖枝的降解能力。

由于16S rDNA測序本身的局限性，本研究并不能精確定位到具體的物種信息，為更全面地了解微生物群落的多樣性，使測定結(jié)果更準確科學(xué)，未來的研究應(yīng)更多地運用宏基因組[8]，對指示物種進行更加精確的檢測，以便對特定物種進行深入研究，科學(xué)指導(dǎo)堆肥發(fā)酵。同時，本研究的樣本量有待進一步擴大來確證本文檢測到的信息真實可靠，為毛木耳發(fā)酵料質(zhì)量把控提供更可靠、具體的參考指標。由于微生物菌群動態(tài)受到培養(yǎng)料透氣性、pH、C/N等理化性質(zhì)的影響[23]，在后續(xù)的深入研究中，有必要針對不同來源的培養(yǎng)料，細化監(jiān)測相關(guān)指標，針對特定培養(yǎng)料優(yōu)化出最佳的發(fā)酵條件，進一步提高發(fā)酵料質(zhì)量。黃保敬[24]在研究蘑菇發(fā)酵料選擇性成因時指出，發(fā)酵后的培養(yǎng)料含有微生物殘體及代謝物、微生物多糖、木質(zhì)素蛋白質(zhì)復(fù)合體、木質(zhì)素腐殖質(zhì)復(fù)合體等，這些物質(zhì)有利于蘑菇菌絲的生長。閩南地區(qū)菇農(nóng)在毛木耳栽培的生產(chǎn)實踐中選擇培養(yǎng)料先發(fā)酵較長時間，再滅菌、接種，是符合當(dāng)?shù)貧夂蛱卣骱驮耘鄺l件的。發(fā)酵料對毛木耳的影響是全方位的、綜合的。本研究初步顯示，毛木耳發(fā)酵料不容易感染鏈孢霉可能與可溶性糖等物質(zhì)的減少有關(guān)，是否還與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的其他物質(zhì)如微生物殘體及代謝物等有關(guān)，具體是哪些物質(zhì)起作用，對發(fā)酵料質(zhì)量影響的重要性如何，這些均有待深入研究。

毛木耳木屑培養(yǎng)料經(jīng)過較長時間發(fā)酵后，全氮含量較未發(fā)酵料提高了90.02%，C/N從88.00降至43.92，而粗纖維和可溶性糖則分別降低了13.78%、73.33%。在發(fā)酵過程中，放線菌門、變形菌門與擬桿菌門的相對豐度都隨著翻堆次數(shù)與發(fā)酵時間的增加而下降，噬熱菌是堆肥過程中的優(yōu)勢菌，在培養(yǎng)料發(fā)酵中升溫和維持高溫有重要的作用，尿素芽孢桿菌屬隨著翻堆次數(shù)與發(fā)酵時間的增加而顯著性提高，是發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌屬。另外，尿素芽孢桿菌屬與嗜熱共生桿菌屬越靠近發(fā)酵后期其豐度會顯著變高，可以作為發(fā)酵后期、發(fā)酵料堆成熟的指示物種。

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The Dynamics of Bacterial Community in Fermentation Pile of

YUAN Bin1HUANG Yining2LIAN Yanping1KE Lina1WU Zhenqiang1DENG Youjin3

(1. Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences, Zhangzhou, Fujian 363005, China; 2. Zhangzhou Vocational and Technical College, Zhangzhou, Fujian 363000, China; 3. Mycological Research Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Explore the diversity of microbial communities and marker species during the fermentation process of thecultures. Mix the fermented culture material to build a pile. After it was done, it would be naturally fermented. The fermentation cycle was 40 days. From the beginning, five parallel samples were taken every ten days using the 5-point sampling method, five groups of up to 25. 16S rDNA amplicon libraries construction and sequencing were performed on these samples and then subject to data analysis. The experimental results showed that the fermentation pile had abundant microbe, and there were 2 807, 2 271, 2 553, 2 465 and 2 106 OTUs in each group, and the pile build-up time had the most abundant OTUs, and the fermentation terminal had the least. PCA analysis revealed that samples in the same group were located closer, while those from different groups separated. UPGM clustered samples from the same group in one clade. In the genus level, the abundance ofandwas getting higher, with the relative one of 0.53%, 18.51%, 20.31%, 37.10%, and 40.85% for, and 2.90%, 4.69%, 6.88%, 7.22%, and 18.27% for. However, the abundance ofanddeclined during the fermentation, from 14.55% and 13.42% in the beginning to 1.82% and 0.08% after the fermentation was completed. The α diversity of the fermentation pile microbial has a downward trend with a partial rebound in the D20. PCA and UPGM data analysis can distinguish every fermentation time point. In the genus level, the fermentation pile microbes were dominant byandin the beginning, changed toandin the end.

; fermented material; 16S rDNA Sequencing

TS235.1

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2023.09.008

2022-10-26；

2022-12-19

財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部“國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系”（No.CARS—20）；福建省科技計劃項目農(nóng)業(yè)引導(dǎo)性（重點）項目（No.2019N0054）。

袁濱（1984—），男，碩士，副研究員，研究方向為食藥用菌育種和栽培，E-mail：yuanbin07031@163.com。

鄧優(yōu)錦（1980—），男，博士，副教授，研究方向為食用菌遺傳育種與栽培技術(shù)，E-mail：dengyoujin1980@163.com。

（責(zé)任編輯 龍婭麗）