陳俊峰，桂雄斌，王明剛

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由特異性抗體IgE 介導(dǎo)，多種免疫活性細胞和細胞因子共同參與的一種鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病。AR 的臨床表現(xiàn)以噴嚏、流涕、鼻癢和鼻塞為主要癥狀，是臨床常見病、多發(fā)?。?］。近年來，AR 發(fā)病率不斷上升，據(jù)統(tǒng)計全球性的發(fā)病人數(shù)已超6億［2］。當(dāng)前臨床多采用糖皮質(zhì)激素類、H2抗組胺類藥物作為控制AR 的一線藥物［3］，但效果不甚理想。中醫(yī)治療變應(yīng)性鼻炎重視扶正固本，調(diào)節(jié)和增強免疫功能，具有明顯的優(yōu)勢。課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，補氣通竅方能有效緩解變應(yīng)性鼻炎患者的鼻炎癥狀，臨床療效滿意［4］。本研究通過構(gòu)建AR 大鼠模型，初步探討補氣通竅方對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜病理損傷和免疫球蛋白E（IgE）水平的影響，為補氣通竅方的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 清潔級健康Wistar 大鼠50 只，6～8 周齡，體質(zhì)量250～300 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（湘）2019-0014。

1.2 試藥與試劑 補氣通竅方（中藥組成：黃芪20 g、黨參12 g、甘草12 g、蒼耳子20 g、辛夷花10 g、細辛3 g、荊芥15 g、桔梗10 g、升麻10 g、柴胡10 g），由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，使用江陰天江藥業(yè)有限公司的中藥配方顆粒劑調(diào)制。卵清蛋白（美國Sigma Aldrich 公司，批號：MN-4236596）；氫氧化鋁（研域化學(xué)試劑有限公司，批號：SX-6354158）；大鼠卵清蛋白特異性免疫球蛋白E（OVA sIgE）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-R0517c）；蘇木素（美國Sigma 公司，貨號H9627）；HE 染色試劑盒（中國碧云天生物科技有限公司，批號：TY-741536）。

1.3 儀器 C2500-R-230V 型微型高速離心機（美國萊伯特公司）；ICV-450 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本ASONE 公司）；Multiskan MK3 型全自動酶標儀（美國Thermo scientific 公司）；BX53 型生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 方 法

2.1 動物分組、造模與給藥 采用隨機數(shù)字表法將50只Wistar大鼠隨機分為5組：空白組，模型組和補氣通竅方低、中、高劑量組，每組10 只。除空白組外，模型組和補氣通竅方低、中、高劑量組參照文獻［5］方法復(fù)制AR 大鼠模型：大鼠腹腔注射卵白蛋白抗原佐劑混懸液OVA［每毫升生理鹽水中含卵白蛋白0.3 mg 及Al（OH）330 mg］致敏，隔日1 次，共14 d；自第15 d 起，大鼠兩側(cè)鼻孔各滴入10%卵清蛋白溶液（生理鹽水配制）50 μl 行鼻腔激發(fā)，每天1 次，共7 d。每次滴鼻結(jié)束后觀察大鼠30 min 內(nèi)抓鼻、噴嚏次數(shù)及流涕情況并記錄，動物行為學(xué)積分評分標準見表1。以疊加法記錄總分，行為學(xué)總分≥5 分為建模成功［6］?？瞻捉M滴鼻予以等量生理鹽水。在OVA 滴鼻行鼻腔激發(fā)的同時給予藥物干預(yù)，補氣通竅方低、中、高劑量組劑量分別為14.38 g/kg、28.76 g/kg、57.55 g/kg［4］，連續(xù)灌胃給藥7 d，灌胃容量為4 ml/d；空白組和模型組大鼠給予等容量純凈水灌胃。

表1 動物行為學(xué)積分評分標準

2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測外周血IgE水平 末次灌胃給藥24 h 后將大鼠以10%水合氯醛3 ml/kg 麻醉，用無菌手術(shù)剪剪開大鼠腹部，剝離腹主動脈采血10 ml，并快速分離血清，將血清在-80 ℃下保存，采用ELISA 法于波長450 nm 的酶標儀上檢測。根據(jù)大鼠卵清蛋白特異性免疫球蛋白E（VOA sIgE）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒內(nèi)附的標準品血清測定的OD值結(jié)果，得出標準曲線，再通過測定各大鼠血清IgE 的OD值，根據(jù)標準曲線算出各大鼠的血清IgE的濃度。

2.3 病理形態(tài)學(xué)檢測 血液采集后沿大鼠雙眼眶下剪下鼻骨，鉗出鼻中隔，剝離鼻中隔兩側(cè)鼻黏膜及分離出鼻腔外側(cè)壁鼻黏膜，用40 g/L 多聚甲醛浸潤固定12 h以上，沖水24 h，分別以50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟后，石蠟包埋，切片厚度為5 μm，常規(guī)蘇木精-伊紅染色病理學(xué)檢查。每張切片在光鏡400 倍下取6～8 個視野，觀察鼻黏膜腺體有無萎縮，比較各組鼻組織纖毛狀態(tài)，腺體有無增生，黏膜厚度及上皮細胞、杯狀細胞數(shù)量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗，多個樣本間的比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 補氣通竅方對AR大鼠行為學(xué)的影響 造模大鼠在第1 次給予OVA 滴鼻行鼻腔激發(fā)后，30 min 內(nèi)就出現(xiàn)噴嚏、抓鼻和流涕的癥狀，大鼠的行為學(xué)評分疊加計分＞5 分，提示造模成功。隨著滴鼻次數(shù)的增加，模型組大鼠癥狀逐漸加劇，出現(xiàn)了典型的變應(yīng)性鼻炎癥狀，行為學(xué)積分明顯高于空白組（P＜0.01）。給予不同劑量的補氣通竅方干預(yù)后，大鼠的行為學(xué)癥狀明顯得到緩解，行為學(xué)積分開始下降，其中補氣通竅方中、高劑量組從第2 d～第7 d 的行為學(xué)評分均顯著低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）；表明補氣通竅方能顯著改善AR大鼠的臨床癥狀，結(jié)果見圖1、表2。

圖1 各組大鼠行為學(xué)評分變化

表2 各組大鼠行為學(xué)評分變化比較（分，）

表2 各組大鼠行為學(xué)評分變化比較（分，）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組同時間點比較，②P＜0.01，③P＜0.05

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3.2 各組大鼠血清IgE 水平比較 根據(jù)大鼠卵清蛋白特異性免疫球蛋白E（VOA sIgE）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒內(nèi)附的標準品得出標準曲線（見圖2），再通過測定各大鼠血清IgE 的OD 值，算出各大鼠的血清IgE 的濃度。與空白組比較，模型組血清IgE 水平在AR 大鼠血清中濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，補氣通竅方低、中、高劑量組血清IgE水平有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示補氣通竅方可降低AR 大鼠血清IgE 水平，結(jié)果見表3。

圖2 VOA sIgE對照品標準曲線

表3 各組大鼠血清IgE水平比較（）

表3 各組大鼠血清IgE水平比較（）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

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3.3 各組大鼠鼻黏膜病理損傷情況 空白組：鼻黏膜可見假復(fù)層纖毛柱狀上皮，纖毛完整，固有層未見水腫、充血等改變，無腺體增生。模型組：鼻黏膜纖毛有排列雜亂、脫落及倒伏現(xiàn)象，出現(xiàn)較多淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，黏膜下腺體數(shù)量明顯增加，小血管可見增生擴張。補氣通竅方低劑量組：鼻黏膜纖毛柱狀上皮可見部分纖毛恢復(fù)，上皮內(nèi)見炎性細胞浸潤，固有層水腫、充血，腺體增生。補氣通竅方中劑量組：鼻黏膜纖毛柱狀上皮部分纖毛恢復(fù)，上皮內(nèi)浸潤著少量嗜酸細胞等炎性細胞，固有層無明顯水腫，可見輕度充血，并可見少許嗜酸細胞、淋巴細胞浸潤，腺體輕度增生。補氣通竅方高劑量組：病理形態(tài)恢復(fù)，與空白組比較相近，固有層偶見少量炎性細胞，腺體輕度增生。結(jié)果見圖4。

圖4 各組大鼠鼻黏膜病理改變（×400）

4 討 論

AR 是IgE 介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，發(fā)生在鼻黏膜，主要以促炎因子釋放、鼻腔黏液過度分泌為主要病理特征［7］。IgE 是參與體液免疫的重要免疫球蛋白，吸入性變應(yīng)原可誘導(dǎo)特異性IgE 產(chǎn)生，IgE 具有親細胞性與特異性，可以與鼻黏膜中的肥大細胞和嗜堿性粒細胞結(jié)合，形成致敏性細胞，當(dāng)機體再次接觸特異性抗原時，致敏細胞表面的IgE 與特異性抗原“交聯(lián)”“搭橋”，活化肥大細胞和嗜堿性粒細胞，產(chǎn)生組胺、白三烯等炎性介質(zhì)，使黏膜充血、水腫、分泌物增多，從而導(dǎo)致AR的發(fā)生發(fā)展［8］。降低血清IgE的水平，可減少變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，抑制變應(yīng)性鼻炎的產(chǎn)生。

變應(yīng)性鼻炎屬中醫(yī)“鼻窒”范疇，根據(jù)病邪的性質(zhì)，分為內(nèi)因和外因，內(nèi)因多為肺、脾功能失調(diào)，外因為風(fēng)寒疫氣入侵。肺氣虛，衛(wèi)表不固，風(fēng)寒疫氣趁虛而入，侵犯鼻竅，正邪相搏，肺失宣降，致津液內(nèi)停，壅塞鼻竅，致鼻塞流涕；脾氣虛，母病累及其子，亦可致肺氣虛，脾失健運，聚濕成痰，肺失其宣降而痰嗽喘咳；外因風(fēng)寒疫氣及內(nèi)因肺脾氣虛，均可導(dǎo)致鼻窒的產(chǎn)生。中醫(yī)對“鼻窒”的認識可追溯至先秦時期古籍《禮記·月令》，其中記載“季秋行夏令，則其國大水，冬藏殃敗，民多鼽嚏”；漢代《素問·脈解》中提到“所謂客脈者，則頭痛、鼻鼽、腹腫者”。補氣通竅方由黃芪、黨參、甘草、蒼耳子、辛夷花、細辛、荊芥、桔梗、升麻、柴胡組成，方中黃芪補益肺脾之氣；黨參助君藥補益中氣；甘草能健肺脾之氣同時調(diào)和諸藥；蒼耳子、辛夷花是治療鼻炎的要藥，可辛散風(fēng)邪、芳香通竅；細辛、荊芥散風(fēng)寒通鼻竅；桔梗載藥上行，散結(jié)出涕；柴胡、升麻分別是少陽、陽明之藥，分別引人體之氣自左、右上升，在方中起發(fā)表解肌并升舉中陽之效。全方宣中有補，補益肺脾氣以助祛風(fēng)透達通鼻竅，具有益氣固衛(wèi)、健脾化痰、祛風(fēng)透達通竅之功效。

本實驗復(fù)制大鼠AR 模型，通過記錄大鼠動物行為學(xué)的積分，檢測血清IgE 水平，并采用常規(guī)蘇木精-伊紅染色病理學(xué)檢查鼻中隔和鼻腔外側(cè)壁呼吸區(qū)黏膜組織的病理形態(tài)，探討補氣通竅方治療過敏性鼻炎的可能機制。研究結(jié)果表明，變應(yīng)性鼻炎大鼠經(jīng)補氣通竅方治療后，大鼠的噴嚏、抓鼻、流涕等行為學(xué)癥狀明顯得到緩解，其中中、高劑量組第2 d～第7 d 的行為學(xué)評分均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），表明補氣通竅方對AR有明顯的改善作用。補氣通竅方各劑量均能顯著降低變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IgE水平（P＜0.01），并能明顯改善變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻組織病理損傷。

綜上所述，補氣通竅方能顯著降低血清IgE 水平，改善鼻黏膜組織的病理形態(tài)，緩解變應(yīng)性鼻炎臨床癥狀，抑制變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生，進一步明確了補氣通竅方治療變應(yīng)性鼻炎的作用機制。