婁夢雪，賀凱茹，韓琦，劉曉燕，樸瑜瓊，劉至立，臧健，武俊瑞,3

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽 110866；2.遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，沈陽 110161；3.沈陽市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110866；4.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，沈陽 110866）

0 引言

超高溫滅菌（ultra-high temperature treated，UHT）乳因具有品質(zhì)高、方便飲用等特點(diǎn)而在我國乳品行業(yè)廣受歡迎，現(xiàn)已成為人們?nèi)粘ｏ嬍持械闹匾巧玔1]。目前UHT 乳貨架期雖然能夠延長至6 個(gè)月以上，但是某些環(huán)節(jié)控制不當(dāng)仍會造成UHT 乳在貨架期內(nèi)出現(xiàn)一些質(zhì)量問題，如脂肪上浮、凝塊、變味、褐變、壞包等[2]，影響產(chǎn)品價(jià)值甚至危害人體健康。

在超高溫滅菌乳的長期儲存期間，影響其口感和感官質(zhì)量的主要過程是蛋白質(zhì)分解、脂肪分解、氧化和美拉德反應(yīng)[3]。Caldera 等研究了來自不同食品的66 個(gè)假單胞菌菌株的酶解腐敗活性，發(fā)現(xiàn)在UHT 乳中測得的蛋白質(zhì)分解活性變化很大[4]。UHT 乳中殘留的微生物也與乳品質(zhì)密切相關(guān)，黃衛(wèi)強(qiáng)等[5]采用16S rDNA高通量測序技術(shù)比較了2 個(gè)不同品牌UHT 乳中的微生物多樣性，通過對兩份UHT 牛乳樣品進(jìn)行高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，兩份UHT 牛乳中的生物多樣性豐度存在一定的差異，但差異不顯著。張敏等[6]應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析了新疆2 地區(qū)的7 種乳制品，結(jié)果表明，牛奶的優(yōu)勢菌門是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢菌屬是假單胞桿菌屬（Pseudomonas）。目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛用于分析生乳及巴氏殺菌乳中微生物群落組成，并用于確定有益和有害細(xì)菌的存在[7]，但研究品質(zhì)正常UHT 乳與品質(zhì)劣變UHT 乳的微生物多樣性差異的研究較少。

本研究以某大型乳品企業(yè)采集的9 份在貨架期內(nèi)品質(zhì)劣變和正常質(zhì)量的UHT 乳為研究對象，通過高通量測序和生物信息學(xué)等技術(shù)方法研究樣品乳在質(zhì)量特征、微生物群譜方面的差異及兩者之間的相關(guān)性，為探索品質(zhì)劣變問題產(chǎn)生的原因提供新的見解，并分析與UHT 乳品質(zhì)劣變等質(zhì)量問題相關(guān)的核心微生物群。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

UHT 乳來自于同一品牌的某大型乳企。產(chǎn)地1、產(chǎn)地2、產(chǎn)地3 按照相同的工藝生產(chǎn)，每個(gè)產(chǎn)地分別采集3 個(gè)批次的樣品進(jìn)行檢測分析。產(chǎn)地1 為正常產(chǎn)品乳（SZ1、SZ2、SZ3）、產(chǎn)地2（WY1、WY2、WY3）和產(chǎn)地3（QY1、QY2、QY3）在貨架期內(nèi)觀察到品質(zhì)劣變現(xiàn)象，樣品形態(tài)如圖1 所示。

圖1 樣品形態(tài)

DNA 提取試劑盒，上海美吉生物有限公司；脂肪酶（LPS）活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ALC-1100.2H-2050R 型超速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀公司；2720 型PCR 擴(kuò)增儀，南京貝登電子商務(wù)有限公司；DYY-6C 型電泳儀，濟(jì)寧市翰業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；電子pH 計(jì)，湖南湘儀公司；Mastersizer 2000 納米粒徑電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；120 乳品綜合成分指標(biāo)分析儀，山東國康電子科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色差的測定

采用pH 計(jì)和色差儀測定9 份樣品pH 值及色澤，確定其亮度值（L*）、紅綠值（a*）、黃藍(lán)值（b*）。樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪、非乳脂固體和乳糖采用乳品綜合成分指標(biāo)分析儀進(jìn)行測定。每個(gè)樣品都進(jìn)行3 次平行測試。

1.3.2 酒精陽性乳的測定

9 份樣品分別取5 mL，加入5 mL 70 %的酒精。若牛乳產(chǎn)生微細(xì)顆?；蛐鯛钅龎K，則可判定為酒精陽性乳。反之，則是非陽性乳。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 Zeta 電位的測定

9 份樣品分別取適當(dāng)體積于燒杯中，去離子水稀釋1 000 倍，用0.45 μm 的微孔濾膜過濾后使用納米粒徑電位分析儀進(jìn)行3 次重復(fù)測定，取平均值。

1.3.4 蛋白酶活性的測定

通過福林酚法測定樣品中的蛋白酶活性。具體步驟參見楊旭等[8]研究。UHT 乳中蛋白酶活力為：

X=AKL/T

式中：X 為樣品的蛋白酶活力（U/mL）；A 為樣品的吸光度；K 為吸光常數(shù)；L 為反應(yīng)試劑的總體積；T為反應(yīng)時(shí)間。

1.3.5 脂肪酶活性的測定

使用脂肪酶活性檢測試劑盒測定脂肪酶活力。計(jì)算公式：

酶活力=x/Tm

式中：x 為吸光度；T 為催化反應(yīng)時(shí)間；m 為發(fā)酵液稀釋倍數(shù)。

1.3.6 微生物學(xué)檢測

1.3.6.1 基因組DNA 提取

將20 mL UHT 乳置于20 mL 的離心管中。離心后去除乳脂層，再12 000 g 離心20 min 收集菌體沉淀。使用DNA 提取試劑盒提取UHT 乳樣品中的細(xì)菌DNA，并利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3.6.2 PCR 擴(kuò)增

采用細(xì)菌338F 和806R 通用引物對16S rDNA的V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物利用2 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3.6.3 熒光定量電泳及Miseq 文庫構(gòu)建

將PCR 產(chǎn)物用熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，根據(jù)每個(gè)樣品的測序量進(jìn)行相應(yīng)比例的混合后，最后采用Illumina 系統(tǒng)進(jìn)行文庫構(gòu)建并測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行處理，P＜0.05 為差異顯著。利用Majorbio 云平臺（www.majorbio.com）將樣本的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分離，以97 %相似度區(qū)分有效OTU數(shù)目?；贠TU 聚類分析結(jié)果，通過alpha 多樣性指數(shù)反映微生物群落的豐富度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)Sobs 和Shannon。同時(shí)在OTU 水平上進(jìn)行beta 多樣性分析。基于分類學(xué)信息，在門和屬分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，對樣本的群落組成進(jìn)行一系列深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。最后進(jìn)行相關(guān)的熱力圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 UHT 乳樣品的質(zhì)量特性分析

2.1.1 色差值的測定結(jié)果

利用色差儀對9 份樣品的顏色進(jìn)行檢測分析。其中L*值表示亮度，L*值越大，代表樣品越亮。由圖2可知，與正常UHT 乳SZ 相比，WY 和QY2 亮度均顯著性升高（P＜0.05），QY1 和QY3 亮度顯著降低。牛乳的L*值與牛乳的成分組成有關(guān)，光線的聚集程度決定牛乳的亮度，酪蛋白和脂肪球的分散則會對其造成影響[9]。由圖3、圖4 可知，品質(zhì)劣變UHT 乳的a* 和b*值與正常UHT 乳的a*和b*值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。品質(zhì)劣變UHT 乳的a*絕對值明顯下降，而b*值明顯上升，說明品質(zhì)劣變UHT 乳WY 和QY 在顏色上都發(fā)生了較大變化，并向黃褐色轉(zhuǎn)變，如圖1。一些研究表明，b*值的增加與美拉德反應(yīng)有關(guān)，它導(dǎo)致了牛乳顏色的變化[10]。

圖2 亮度值測定結(jié)果

圖3 紅綠值測定結(jié)果

圖4 黃藍(lán)值測定結(jié)果

2.1.2 pH 值測定結(jié)果

由圖5 可知，樣品的pH 值為6.53～6.78 之間，處于正常乳所要求的pH 值（6.4～6.8）區(qū)域內(nèi)，即樣品均符合標(biāo)準(zhǔn)。品質(zhì)劣變UHT 乳與正常UHT 乳相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），pH 值都在一定程度上呈現(xiàn)下降趨勢。Devi 等[11]也發(fā)現(xiàn)液態(tài)配方奶儲存期間pH 值呈下降趨勢，推測是因?yàn)橹九c氧氣接觸產(chǎn)生游離脂肪酸，從而使pH 值下降。

圖5 樣品的pH 值測定結(jié)果

2.1.3 營養(yǎng)成分測定結(jié)果

通過乳品成分分析儀對UHT 乳中常規(guī)營養(yǎng)成分進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6 所示。從圖6 可以看出，品質(zhì)劣變?nèi)榈幕A(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)含量與正常UHT 乳相比，變化不顯著。品質(zhì)劣變?nèi)榈牡鞍踪|(zhì)和脂肪含量略有下降，推測是乳中存在尚具有一定活性的嗜冷菌能夠產(chǎn)生耐熱酶類物質(zhì)，從而分解蛋白質(zhì)和脂肪，最終影響UHT 乳品質(zhì)。

圖6 常規(guī)營養(yǎng)成分測定結(jié)果

2.1.4 酒精陽性乳測定結(jié)果

將70%酒精與9 份樣品1∶1 混合，出現(xiàn)沉淀即為酒精陽性乳。由表1 可知，品質(zhì)劣變?nèi)閃Y 和QY2 均出現(xiàn)酒精陽性乳現(xiàn)象。酒精陽性乳試驗(yàn)是檢驗(yàn)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，目前使用酒精試驗(yàn)主要目的是檢測牛乳中蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，而牛乳中的蛋白質(zhì)85%為酪蛋白。有研究表明，陽性結(jié)果的絮狀沉淀物就是酪蛋白膠束的凝集物[12]，因此酪蛋白含量改變可能是引起品質(zhì)劣變產(chǎn)品乳產(chǎn)生酒精陽性乳現(xiàn)象的原因。

表1 9 份樣品乳的酒精陽性乳結(jié)果

2.1.5 Zeta 電位測定結(jié)果

表征牛乳體系穩(wěn)定性的指標(biāo)之一就是Zeta 電位，牛乳的體系穩(wěn)定性與Zeta 電位的絕對值呈正相關(guān)。由圖7 可知，所有樣品的Zeta 電位值均為負(fù)數(shù)，且與正常UHT 乳相比，品質(zhì)劣變?nèi)閃Y1、WY2、WY3 和QY2 樣品的Zeta 電位絕對值較低，與正常產(chǎn)品乳具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。推測品質(zhì)劣變UHT 乳Zeta電位絕對值降低，體系穩(wěn)定性下降的原因是牛乳中乳糖分解產(chǎn)生乳酸，使得乳的酸度增加，從而導(dǎo)致體系電位不穩(wěn)定。

圖7 Zeta 電位測定結(jié)果

2.1.6 蛋白酶活性測定結(jié)果

樣品中的蛋白酶活性通過福林酚法測定，結(jié)果如表2。品質(zhì)劣變UHT 乳WY 與QY2 的蛋白酶活性顯著高于正常產(chǎn)品乳SZ（P＜0.05）。這表明品質(zhì)劣變產(chǎn)品乳出現(xiàn)的原因可能與乳中殘留的耐熱蛋白酶相關(guān)，乳中的一些嗜冷菌會產(chǎn)生耐熱蛋白酶，耐熱酶經(jīng)UHT殺菌處理并不能完全失活，而未失活的耐熱酶在貨架期內(nèi)分解乳蛋白質(zhì)，從而造成蛋白沉淀現(xiàn)象。

表2 蛋白酶活性的測定

2.1.7 脂肪酶活性測定結(jié)果

脂肪酶活性由脂肪酶活性檢測試劑盒進(jìn)行測定，結(jié)果如表3。品質(zhì)劣變?nèi)閃Y 和QY2 與正常產(chǎn)品乳相比不具有顯著差異（P＞0.05），而品質(zhì)劣變?nèi)镼Y1 和QY3 的脂肪酶活性顯著升高（P＜0.05）。這可能是由于嗜熱菌產(chǎn)生的耐高溫脂肪酶分解了牛乳脂肪球膜，并聚集成大分子脂肪球，導(dǎo)致UHT 乳在貨架期內(nèi)出現(xiàn)脂肪上浮和脂肪氧化等異常現(xiàn)象。

表3 脂肪酶活性測定結(jié)果

2.2 UHT 乳微生物學(xué)檢測結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌PCR 擴(kuò)增結(jié)果

PCR 產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測的電泳圖如圖8 所示。

圖8 8 份樣品乳的PCR 擴(kuò)增電泳

由圖8 可知，8 份UHT 乳樣品細(xì)菌16S V3-V4區(qū)在750 bp 處擴(kuò)增條帶明顯，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。此外，SZ3 樣品DNA 提取未成功。

2.2.2 細(xì)菌的稀釋曲線

從每個(gè)樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計(jì)該序列所代表的OTU 數(shù)目，從而判斷樣本測序數(shù)據(jù)的合理性。由圖9 可知，當(dāng)樣品細(xì)菌菌落測序堿基量較小時(shí)，OTU 數(shù)目隨著測序堿基量呈拋物線增長趨勢迅速增加，當(dāng)測序量達(dá)到400 左右時(shí)，稀釋曲線總體趨勢增長緩慢并趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理，序列數(shù)基本可以反映出每組樣品中的菌群結(jié)構(gòu)，滿足了后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

圖9 Alpha 多樣性指數(shù)稀釋

2.2.3 Alpha 多樣性指數(shù)分析

Alpha 多樣性指數(shù)與種類數(shù)目和個(gè)體均勻性有關(guān)，可以直接反映樣品的豐富度和均勻度。Shannon 指數(shù)反映微生物群落多樣性，Sobs 指數(shù)反映群落豐富度。由圖10 可知，與正常產(chǎn)品乳相比，品質(zhì)劣變?nèi)镾hannon 指數(shù)顯著降低，表明品質(zhì)劣變?nèi)橹形⑸锒鄻有越档?，其中WY3 樣品其Shannon 指數(shù)最小，該樣品中菌群的多樣性最低。由圖11 可知，與正常產(chǎn)品乳相比，品質(zhì)劣變?nèi)镾obs 指數(shù)也較低，表明品質(zhì)劣變?nèi)橹芯贺S富度較低。與正常UHT 乳相比，劣變產(chǎn)品乳中Alpha 多樣性低，可能是由于品質(zhì)劣變?nèi)橹挟a(chǎn)生了某種優(yōu)勢菌株。同時(shí)，品質(zhì)劣變?nèi)閃Y 樣品與品質(zhì)劣變?nèi)镼Y 樣品相比，Shannon 指數(shù)和Sobs 指數(shù)更低，微生物群落的豐富度及多樣性都更低。

圖10 Shannon 指數(shù)alpha 多樣性分析

2.2.4 樣本Beta 多樣性指數(shù)分析

2.2.4.1 基于OTU 水平的樣本層級聚類分析

為研究不同產(chǎn)地UHT 乳樣本群落結(jié)構(gòu)的相似度或差異性，利用聚類方法建立了樣本層次聚類樹，如圖12 所示，結(jié)果表明，產(chǎn)地2 品質(zhì)劣變?nèi)閃Y 樣品可聚為一個(gè)分支，說明產(chǎn)地2 樣品組間差異較小。產(chǎn)地3品質(zhì)劣變?nèi)榕c產(chǎn)地1 正常產(chǎn)品乳SZ1 和SZ2 可聚為一個(gè)分支，說明產(chǎn)地3 品質(zhì)劣變?nèi)榕c正常產(chǎn)品乳物種間群落結(jié)構(gòu)相似，從樣品形態(tài)圖中也可以看出產(chǎn)地3品質(zhì)劣變?nèi)橐獌?yōu)于產(chǎn)地2，推測產(chǎn)地3 出現(xiàn)品質(zhì)劣變時(shí)間尚短，物種間群落結(jié)構(gòu)還未發(fā)生較大變化，因此會與正常產(chǎn)品乳聚為一個(gè)分支。

圖12 8 份樣品的層級聚類分析

2.2.4.2 基于OTU 水平的PCA 分析

圖13 為不同產(chǎn)地UHT 乳OTU 水平的PCA 分析圖。PCA 的兩個(gè)成分（F1 和F2）解釋了總方差的98.03%，F(xiàn)1 和F2 分別解釋了92.35%和5.68%。根據(jù)OTU 水平的PCA 聚類分析，劣變?nèi)閃Y 聚類在一起，組內(nèi)樣本點(diǎn)分布較聚集，與層次聚類分析結(jié)果相似。同時(shí)，品質(zhì)劣變?nèi)閃Y 與正常產(chǎn)品乳SZ1 和SZ2間距離較遠(yuǎn)，說明樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大。而品質(zhì)劣變?nèi)镼Y 與正常產(chǎn)品乳SZ1 間距離較近，微生物群落結(jié)構(gòu)相似；與SZ2 距離較遠(yuǎn)，微生物群落結(jié)構(gòu)有較大差異。

圖13 樣品乳的PCA 分析

2.2.5 門水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

將測序所得序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，解析UHT乳中具體微生物組成，門水平相對豐度分析如圖14所示，結(jié)果表明，UHT 乳樣品中主要菌群為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）；這和黃衛(wèi)強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)UHT 乳基于門水平的微生物結(jié)構(gòu)組成的結(jié)果相似[5]。我們的研究結(jié)果確定了主要的4 個(gè)細(xì)菌門，主導(dǎo)著UHT 乳的微生物群落。品質(zhì)劣變?nèi)榕c正常UHT 乳在門水平組成上相似，各樣品間的優(yōu)勢菌門基本相同，但相對豐度存在一定的差異。8 個(gè)UHT 乳樣品的優(yōu)勢菌門均為變形菌門（Proteobacteria），含量約為90 %以上，其中SZ2 中變形菌門（Proteobacteria）含量稍低，約為81 %。此外，品質(zhì)劣變?nèi)橹?，產(chǎn)地2 的WY樣品與QY2 樣品組成及含量上接近；QY1 與QY3 中變形菌門（Proteobacteria）含量相較于QY2 和產(chǎn)地2 樣品低一些，但厚壁菌門（Firmicutes）含量稍高。

圖14 8 份樣品門水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

2.2.6 屬水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

由于16S 測序結(jié)果在屬水平上最為準(zhǔn)確，所以將門水平結(jié)果進(jìn)一步整理，對屬分類水平進(jìn)行鑒定，得到結(jié)果如圖15 所示。

圖15 8 份樣品屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

由圖15 可知，在屬水平上，戴爾福特菌屬在各個(gè)UHT 乳樣品中占比超過61%以上，為各個(gè)樣品的優(yōu)勢菌屬，這與唐振華[13]檢測水牛乳屬水平細(xì)菌多樣性的研究結(jié)果相同。品質(zhì)劣變?nèi)閃Y 樣品中微生物多樣性相對較低，群落組成高度集中在戴爾福特菌屬上，約91%以上為戴爾福特菌屬。而正常UHT 乳的微生物群落均勻性相對較高，戴爾福特菌屬占比為73.54%、61.73%，不動桿菌屬占比為15.26%、15.09%。品質(zhì)劣變?nèi)閃Y 樣品與正常UHT 乳樣品間屬分類水平差異較大。同時(shí)，與正常UHT 乳相比，品質(zhì)劣變?nèi)镼Y 樣品在屬水平的微生物組成上差異較小；QY 樣品戴爾福特菌屬占比為82.22%、75.53%和70.30%，不動桿菌屬占比為8.16%、19.93%和16.49%。

Douglas 等[14]在提取母乳微生物組DNA 方法的研究中發(fā)現(xiàn)，戴爾福特菌屬（Delftia）為乳16S rDNA測序檢測中常檢出的微生物。此外，戴爾福特菌廣泛分布于環(huán)境中，從污染土壤和廢水中均可檢出[15-16]。因此推測戴爾福特菌的高豐度出現(xiàn)的原因有兩種，一種是戴爾福特菌為低生物量樣本中的試劑污染物，來源于提取試劑盒，另一種是原料乳被牧場環(huán)境中的灰塵水體等污染，從而導(dǎo)致戴爾福特菌的存在。為了排查其他可能導(dǎo)致UHT 乳品質(zhì)劣變的微生物的存在，對UHT 乳中其他低豐度細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖16。

圖16 8 份樣品屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成（除戴爾福特菌屬外）

與正常UHT 乳相比，品質(zhì)劣變?nèi)閃Y 樣品中優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas），為正常UHT 乳樣品的5～10 倍。此外，品質(zhì)劣變?nèi)镼Y 樣品也檢測出假單胞菌屬，與正常UHT 乳樣品間豐度差異較小。研究表明，假單胞菌屬為乳中常見嗜冷菌，能夠分泌耐熱蛋白酶和脂肪酶[17]，UHT 處理后仍保持一定的酶活性，會導(dǎo)致乳品產(chǎn)生苦味甚至腐敗變質(zhì)[7]。品質(zhì)劣變?nèi)镼Y 樣品和正常UHT 乳樣品SZ1 和SZ2 的優(yōu)勢菌屬均為不動桿菌屬（Acinetobacter），為乳中常見的嗜冷菌屬，低溫保藏下也能生長，并產(chǎn)生耐熱脂肪酶，造成脂肪上浮現(xiàn)象[18]，其中QY2 樣品中不動桿菌屬豐度較高，約為正常UHT 樣品的1.6 倍。此外，鏈球菌（Streptococcus）也是主要菌屬，在正常UHT 乳樣品中豐度相似。

同時(shí)，以O(shè)TU 水平將品質(zhì)劣變?nèi)榕c正常UHT乳進(jìn)行對比分析，對品質(zhì)劣變?nèi)橹刑赜械牟糠治⑸镞M(jìn)行提煉，結(jié)果如表4 所示。

表4 品質(zhì)劣變?nèi)橹刑赜械牟糠治⑸?/p>

與產(chǎn)地1 正常UHT 乳中微生物屬種相比，選出產(chǎn)地2 和產(chǎn)地3 品質(zhì)劣變?nèi)橹胁町惷黠@的特有微生物菌屬共23 種。產(chǎn)地2 劣變產(chǎn)品乳中特有的斯諾德格拉斯菌屬（Snodgrassella）、吉列姆菌屬（Gilliamella）、Bombiscardovia 和孢子菌屬（Sporacetigenium）均為蜜蜂腸道中的常見菌種或蜜蜂共生細(xì)菌[19-20]，推測產(chǎn)地2 品質(zhì)劣變?nèi)榭赡苁艿嚼ハx污染。產(chǎn)地3 品質(zhì)劣變?nèi)橹?，沙雷氏菌屬（Serratia）和厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）為特有菌屬；沙雷氏菌屬為乳中常見嗜冷菌和致病菌，其胞外酶可以水解脂肪和蛋白質(zhì)[21-22]；而厭氧芽孢桿菌屬則是乳品工廠的廢水中常檢測到的優(yōu)勢菌[23]。

2.3 與品質(zhì)劣變UHT 乳的質(zhì)量特性相關(guān)的核心微生物群

2.3.1 UHT 乳中微生物群落組成和理化特性之間的相關(guān)性

利用相關(guān)熱圖分析了UHT 奶中微生物群落組成和理化特性之間的相關(guān)性，如圖17。結(jié)果顯示，樣品的脂肪和蛋白質(zhì)含量與微生物細(xì)菌群落有明顯的相關(guān)性（P＜0.05）。一些細(xì)菌，如吉列姆菌（Gilliamella）、拉爾斯通尼亞菌（Ralstonia）和嗜酸菌（Acidovorax），與乳糖、脂肪和蛋白質(zhì)的豐度表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系。此外，假單胞菌（WY 樣品）、鏈球菌和不動桿菌（QY 樣品）顯著參與了UHT 牛奶的多種理化性質(zhì)。例如，假單胞菌與脂肪、蛋白質(zhì)顯示出明顯的正相關(guān)關(guān)系。鏈球菌與L*值、Zeta 電位呈負(fù)相關(guān)。這進(jìn)一步說明，微生物的功能特征促進(jìn)了糖類的代謝、蛋白質(zhì)的分解和重要代謝物的產(chǎn)生[7]。

圖17 微生物與理化指標(biāo)相關(guān)性熱圖

2.3.2 UHT 乳中微生物群落組成和酶活性之間的相關(guān)性

品質(zhì)劣變UHT 乳（WY 和QY）受到耐熱蛋白酶和脂肪酶的影響，我們進(jìn)一步分析了牛奶中的微生物屬與酶活性之間的相關(guān)性。根據(jù)結(jié)果可以看出，大多數(shù)菌屬在蛋白酶和脂肪酶含量上呈現(xiàn)相反的趨勢如圖18 所示。例如，梭狀芽孢桿菌（Clostridium）和拉爾斯通尼亞菌（Ralstonia）與蛋白酶含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與脂肪酶含量呈負(fù)相關(guān)。此外，作為QY 樣品中的核心微生物，不動桿菌與脂肪酶活性呈正相關(guān)，與蛋白酶活性呈負(fù)相關(guān)，這也與之前測定的酶活性相符。研究表明，不動桿菌屬是一種常見的導(dǎo)致牛奶中甜凝缺陷/苦奶油的病原體[24]，是常見產(chǎn)耐熱酶的嗜冷菌，其大量繁殖會影響乳成分，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)。然而，假單胞菌作為WY 樣品中的主要細(xì)菌屬，與脂肪酶活性呈負(fù)相關(guān)，與蛋白酶呈正相關(guān)。Dina Raats 等[25]采用DGGE技術(shù)分析，結(jié)果表明，乳中的嗜冷菌占主要比例的菌群均為假單胞菌屬。研究表明，假單胞菌屬約占低溫保存的生牛乳微生物總量的70%～90%[26]。假單胞菌屬的豐度主要是受其蛋白水解酶活性和耐低溫特性影響，在巴氏殺菌甚至UHT 處理后仍保持活性[27]，是造成牛奶腐敗變質(zhì)和貨架期縮短的主要原因[28]。

圖18 微生物與酶活力相關(guān)性熱圖

3 結(jié)論

本文探討了同一品牌正常UHT 乳（SZ）和品質(zhì)劣變UHT 乳（WY、QY）的質(zhì)量特性和微生物分布，并研究了它們之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，品質(zhì)劣變UHT 乳在理化指標(biāo)、酶活性和微生物群分布方面與正常UHT 乳有明顯不同。并且假單胞菌和不動桿菌被確定為核心功能微生物，顯著地參與并影響了UHT 乳的質(zhì)量特性，這些菌產(chǎn)生的耐熱酶類物質(zhì)，能夠分解蛋白質(zhì)和脂肪，從而影響UHT 乳品質(zhì)。此外，發(fā)現(xiàn)假單胞菌的豐度在品質(zhì)劣變UHT 乳（WY）中明顯增加，并與耐熱蛋白酶含量呈明顯的正相關(guān)，而品質(zhì)劣變UHT 乳核心微生物不動桿菌與耐熱脂肪酶活性呈正相關(guān)。但對假單胞菌、不動桿菌產(chǎn)酶特性和作用機(jī)制沒有進(jìn)行深入的研究，以及戴爾福特菌屬是否也是產(chǎn)酶的關(guān)鍵菌株同樣需要進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。