許立明 胡莉 胡絲威 敖細(xì)紅 吳海寶

真菌是一類具有典型核結(jié)構(gòu)與完整細(xì)胞器、形態(tài)各異、大小不一的真核細(xì)胞微生物[1]。真菌是植物、昆蟲及人類主要的致病菌，在臨床上將因真菌感染所引起的疾病稱為真菌病，根據(jù)其感染部位不同分為淺部真菌病與深部真菌病[2-3]。近年來，隨著全球衛(wèi)生環(huán)境的改善、醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，深部真菌病發(fā)病率呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)[4]。但淺部真菌病仍是困擾人類的疾病之一，其中以足癬最為常見[5]。雖然足癬并不會(huì)威脅患者生命，但其常伴有瘙癢、糜爛等癥狀，且以上癥狀常于夏季潮濕悶熱時(shí)加重，嚴(yán)重影響患者日常生活。因此，精準(zhǔn)檢出足癬并實(shí)施對(duì)癥治療對(duì)提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。近年來，足癬真菌檢查已逐漸形成規(guī)范化診斷流程，常采用直接鏡檢與真菌培養(yǎng)相結(jié)合的形式[6]。但常規(guī)取材涂片直接鏡檢需用鈍刃刮取樣本，存在創(chuàng)傷風(fēng)險(xiǎn)。而真菌培養(yǎng)則需2～4 周時(shí)間，診斷周期過長(zhǎng)。因此，臨床急需一種快速、高效、精準(zhǔn)的檢查手段。改良取材涂片法鏡檢無需使用刀刃刮取，且耗時(shí)較短，因此，考慮將其應(yīng)用于足癬檢查。為分析該種檢查手段的臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究特選取100 例疑似為足癬患者為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)比改良取材涂片法鏡檢與常規(guī)取材涂片直接鏡檢法的診斷效果并分析改良取材涂片法鏡檢的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究，選取新余銀河醫(yī)院2020 年10 月—2022 年9 月收治的100 例高度疑似足癬的患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）參照文獻(xiàn)[7]《中國臨床皮膚病學(xué)》，臨床表現(xiàn)為腳趾間起水皰、糜爛或皮膚增厚開裂、瘙癢等，高度疑似足癬；（2）首次發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）就診前使用過抗真菌類藥物；（2）足部合并皮疹、銀屑病等其他皮膚疾??；（3）合并全身感染性疾??；（4）合并糖尿病足、炭疽、蜂窩織炎等。剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）未接受完整檢查；（2）選取切片樣本污染。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為兩組，試驗(yàn)組和對(duì)照組各50 例。本研究所有材料均已上交本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)，經(jīng)過討論，予以批準(zhǔn)實(shí)施?；颊呔鈪⑴c本研究。

1.2 方法

（1）改良取材涂片法鏡檢。①取材：暴露足部病變部位，使用一次性棉簽（生產(chǎn)廠家：成都明森醫(yī)療器械有限責(zé)任公司，注冊(cè)證編號(hào)：川械注準(zhǔn)20172140060，型號(hào)規(guī)格：Ⅰ型）蘸取氯化鈉注射液（生產(chǎn)廠家：辰欣藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20056758，規(guī)格：50 mL∶0.45 g），使用一側(cè)在典型病變皮損部位或新發(fā)皮損邊緣來回擦拭10 次左右，后轉(zhuǎn)換到棉簽另一側(cè)再次反復(fù)涂取10 次左右。②檢查：在載玻片中間滴加2～4 滴生理鹽水，順時(shí)針涂抹組織樣本，后將其放入光學(xué)顯微鏡（生產(chǎn)廠家：重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司，注冊(cè)證編號(hào)：渝械注準(zhǔn)20192220096，型號(hào)規(guī)格：B203LED）下觀察，先使用低倍鏡查找菌絲或孢子，找到疑似目標(biāo)后使用高倍鏡再次確認(rèn)檢查結(jié)果。（2）常規(guī)取材涂片直接鏡檢法。①取材：暴露足部皮損部位，使用70%酒精消毒后用鈍刃的手術(shù)刀刮取典型皮損組織或新發(fā)皮損部位邊緣提取組織樣本。②檢查：將組織樣本放置于載玻片中央，滴入1～2 滴的10%氫氧化鉀浮載液[40%二甲基亞砜+10%甘油]后等待片刻，蓋上蓋玻片，將其快速從酒精燈外焰上往復(fù)2～3 次，使組織樣本中的角質(zhì)充分溶解，加熱過程中注意把握溫度，避免烤干結(jié)晶。輕輕擠壓蓋玻片，排出其中氣泡的同時(shí)壓縮樣本，使得樣本呈現(xiàn)出微透明狀態(tài)，并用吸水紙將周圍溢出的液體除去，后將其放置于低倍顯微鏡下觀察，確定疑似目標(biāo)后，將其放置于高倍顯微鏡下確認(rèn)孢子形態(tài)，在檢查時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光影響。（3）真菌培養(yǎng)。①取材同常規(guī)取材涂片直接鏡檢法；②檢查：將所提取的組織樣本隨機(jī)分成2 等份后分別接種于2 個(gè)真菌培養(yǎng)基（溫州市康泰生物科技有限公司；沙保羅瓊脂）中，將其中一個(gè)培養(yǎng)基放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司；BJPX-H54）中，另一個(gè)放置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行雙管培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間：2～4 周，定期觀測(cè)培養(yǎng)結(jié)果。試驗(yàn)組采用改良取材涂片法鏡檢，對(duì)照組采用常規(guī)取材涂片直接鏡檢法，兩組均進(jìn)行真菌培養(yǎng)。（4）質(zhì)量控制。①遵循自愿原則成立課題研究小組，研究團(tuán)隊(duì)由3 名主治醫(yī)師與2 名主管檢驗(yàn)技師構(gòu)成，小組成員皆具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。在試驗(yàn)開始前由專業(yè)人士對(duì)小組成員進(jìn)行培訓(xùn)，并考核醫(yī)務(wù)人員的檢查操作專業(yè)性、結(jié)果判讀準(zhǔn)確性等。②根據(jù)研究課題，查找相關(guān)文獻(xiàn)，從理論層面設(shè)計(jì)研究步驟、原理及操作注意事項(xiàng)等，并對(duì)各部該研究課題的實(shí)用價(jià)值進(jìn)行論證。③由2 名主管檢驗(yàn)技師單獨(dú)讀取判定結(jié)果，如若遇到不一致情況則需請(qǐng)上級(jí)專家再次解讀，以其判定結(jié)果為準(zhǔn)。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 疼痛程度 在完成取材后，使用視覺模擬評(píng)分法（visual analogue scale，VAS）評(píng)估兩組患者在取材時(shí)的疼痛程度。0 分代表完全無痛，10 分代表疼痛難以忍受，分?jǐn)?shù)越高提示患者取材時(shí)的疼痛程度越嚴(yán)重。

1.3.2 陽性判定標(biāo)準(zhǔn) 參照文獻(xiàn)[8]《醫(yī)學(xué)真菌學(xué)》中相關(guān)鏡檢形態(tài)學(xué)特征判斷。（1）直接鏡檢：組織樣本中鏡下可見分支、分隔菌絲，可斷裂或形成關(guān)節(jié)孢子；菌落形態(tài)可呈毛型、羊毛狀、粉型、粉末狀、絨毛狀或溝紋狀，可見表面呈現(xiàn)出白色過渡到乳油色，背面呈現(xiàn)出黃褐色；亦可見表面呈現(xiàn)白色過渡到粉色，背面呈現(xiàn)出酒紅色。（2）真菌培養(yǎng)：絨毛狀、溝紋狀或絨毛狀，表現(xiàn)為分支、分隔、粗細(xì)較為類似的菌絲，孢子常直接從菌絲中生長(zhǎng)出，大分生孢子呈香煙或鉛筆狀，小分生孢子呈淚滴狀、棒形、球形、梨形，偶爾可見蜈蚣狀，或可不見大分生孢子。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用（±s）表示，使用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；采用Kappa 一致性檢驗(yàn)改良取材涂片法鏡檢、常規(guī)取材涂片直接鏡檢法與真菌培養(yǎng)結(jié)果的診斷一致性；0.21＜Kappa 值≤0.40，提示二者檢查結(jié)果一致性一般；0.41＜Kappa 值≤0.60，提示二者一致性中等；0.61＜Kappa 值≤0.80，提示二者具有較強(qiáng)一致性；0.81＜Kappa 值＜1，提示二者具有強(qiáng)一致性，Kappa 值=1，提示二者結(jié)果完全一致。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料

試驗(yàn)組男27 例，女23 例；年齡20～40 歲，平均（30.12±5.12）歲；病程個(gè)4～10 個(gè)月，平均（7.69±1.25）個(gè)月；疾病類型：水皰型17 例、糜爛型23 例、鱗屑角化型10 例。對(duì)照組男29 例，女21 例；年齡20～40 歲，平均（30.56±5.39）歲；病程4～10 個(gè)月，平均（7.45±1.98）個(gè)月；疾病類型：水皰型21 例、糜爛型20 例、鱗屑角化型9 例。兩組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 診斷一致性

試驗(yàn)組，經(jīng)真菌培養(yǎng)檢出真菌陽性46 例，陰性4 例，改良取材涂片法鏡檢檢出真菌陽性45 例，陰性5 例，Kappa 一致性檢驗(yàn)顯示，改良取材涂片法鏡檢與真菌培養(yǎng)檢出結(jié)果具有較強(qiáng)一致性（Kappa=0.634，P＜0.001）。對(duì)照組經(jīng)真菌培養(yǎng)檢出真菌陽性46 例，陰性4 例，常規(guī)取材涂片直接鏡檢法檢出陽性38 例，陰性12 例，Kappa 一致性檢驗(yàn)顯示，常規(guī)取材涂片直接鏡檢法與真菌培養(yǎng)檢出結(jié)果具有一般一致性（Kappa=0.290，P＜0.05）。見表1、2。

表1 試驗(yàn)組改良取材涂片法鏡檢檢出結(jié)果（例）

表2 對(duì)照組常規(guī)取材涂片直接鏡檢法檢出結(jié)果（例）

2.3 診斷效能

改良取材涂片法鏡檢的敏感度、準(zhǔn)確度均高于常規(guī)取材涂片直接鏡檢法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩者特異度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 改良取材涂片法鏡檢與常規(guī)取材涂片直接鏡檢法診斷效能比較（%）

2.4 兩組患者疼痛程度比較

試驗(yàn)組患者VAS 評(píng)分為（1.22±0.31）分，對(duì)照組為（1.45±0.52）分，試驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.686，P＜0.05）。

3 討論

足癬具有極強(qiáng)的傳染性，不僅局限于機(jī)體之間的傳染，還可侵染患者其他健康組織，例如手癬多由觸碰足部病損皮膚而感染真菌所致，足癬真菌侵染患者甲床形成甲癬[9]。因此，盡早檢出足癬有助于避免真菌擴(kuò)散感染其他組織[10-11]。常規(guī)取材涂片直接鏡檢法是臨床上最為常用的早期篩查足癬的技術(shù)手段，具有快捷、經(jīng)濟(jì)成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。但臨床觀察發(fā)現(xiàn)，常規(guī)取材涂片直接鏡檢法的真菌陽性檢出率與真菌培養(yǎng)結(jié)果之間存在差距，極易出現(xiàn)誤診、漏診情況[12]。因此，改良取材涂片法鏡檢逐漸應(yīng)用于足癬真菌檢查中，但目前仍無明確循證證據(jù)支持其診斷率高于常規(guī)取材涂片直接鏡檢法。因此，本研究比較二者之間的診斷效能，為完善足癬真菌檢查方案提供理論支持。

研究結(jié)果顯示，相較于常規(guī)取材涂片直接鏡檢法，改良取材涂片法鏡檢檢出真菌陽性與真菌培養(yǎng)結(jié)果的一致性更高。分析可能與以下幾方面有關(guān)。首先，兩種直接鏡檢法在取材手段上有所區(qū)別。常規(guī)取材涂片直接鏡檢法是利用鈍刃手術(shù)刀刮取患者的樣本組織，在刮取過程中會(huì)造成樣本皮損細(xì)屑組織相互堆疊，且多集中于刀刃處，遮擋讀取視線[13-14]；另外該種刮取方式會(huì)影響真菌分布區(qū)域的均衡性，增加讀取區(qū)域偏差的可能性[15]。而改良取材涂片法鏡檢是利用濕潤(rùn)棉簽擦拭皮損組織，大大減少了皮屑的堆積；與此同時(shí)，在往復(fù)擦拭間還能避免真菌出現(xiàn)分布不均的情況，從而提高真菌陽性檢出率[16]。另外，改良取材涂片法鏡檢在提取組織樣本之前無需對(duì)皮損部位消毒，進(jìn)而避免因酒精消毒造成的真菌損失，最大限度地保留患者足部真菌的真實(shí)狀況，進(jìn)而提高陽性檢出率[17-18]。不僅如此，常規(guī)取材涂片直接鏡檢法在檢查過程中需要滴入氫氧化鉀溶液且需用酒精燈加熱，容易出現(xiàn)角質(zhì)溶解不徹底的情況，進(jìn)而降低陽性檢出率[19-20]。而改良取材涂片法鏡檢無需溶解角質(zhì)，可有效避免以上情況出現(xiàn)，提高真菌陽性檢出率。

研究結(jié)果還顯示，試驗(yàn)組患者取材時(shí)VAS 評(píng)分明顯高于對(duì)照組，說明改良取材涂片法鏡檢可有效減輕患者取材時(shí)的疼痛程度。分析原因，常規(guī)取材涂片直接鏡檢法是使用鈍刃刮取，存在一定的致?lián)p風(fēng)險(xiǎn)；另外刮取時(shí)需施以一定的壓力，易造成患者出現(xiàn)疼痛[21]。而改良取材涂片法鏡檢則是用來回蘸取的方式，不損傷皮損部位，無需施以壓力，因此患者不易感覺疼痛。

值得注意的是，不論是改良取材涂片法鏡檢還是常規(guī)取材涂片直接鏡檢法均為人工采集、檢驗(yàn)。不規(guī)范的操作方式會(huì)影響其結(jié)果的判斷。因此為提高真菌陽性檢出率需注意以下幾點(diǎn)：（1）取材時(shí)應(yīng)盡量做到多部位采集，且保證提取量充足。（2）轉(zhuǎn)運(yùn)過程中避免污染樣本。（3）在鏡檢觀察時(shí)盡量讀取多范圍結(jié)果。（4）取材前應(yīng)告知患者避免涂抹抗菌性藥物。

雖然本研究明確了改良取材涂片法鏡檢對(duì)足癬真菌陽性的檢出價(jià)值，但仍存在諸多不足，例如未對(duì)比改良取材涂片法鏡檢對(duì)不同足癬疾病分型中真菌陽性的檢出價(jià)值；另外真菌培養(yǎng)可以檢出菌種情況，而直接鏡檢在此方面仍有欠缺，是否可以再將其進(jìn)行改良提高對(duì)菌種判定的價(jià)值還有待探究。

綜上所述，相較于常規(guī)取材涂片直接鏡檢法，改良取材涂片法鏡檢對(duì)足癬真菌陽性具有更高的檢出率。