馮法銘 張 倩 崔 燕 何俊峰 靳宏亮

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070）

我國青藏高原的氣候類型為高山高原氣候，主要特點為低氧［1］。高原低氧環(huán)境可導致動物體內氧化還原平衡狀態(tài)被打破，機體過度產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）［2］，使得細胞分裂周期異常，線粒體產(chǎn)生三磷酸腺苷（association of tennis professionals，ATP）水平下降，誘導凋亡基因表達。最終對腦組織造成缺氧性損傷，進而導致神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，引起各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)性高山病、高原性腦昏迷［3］等。

自噬（autophagy）參與細胞中受損細胞器的清除、細胞重建等［4］。高原低氧條件下，機體細胞受低氧影響，線粒體受到不同程度損傷。自噬體可以降解細胞中變性的蛋白質，影響神經(jīng)元的最終轉歸，促進神經(jīng)元存活［5］。NIX（Bcl-2 and adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3-like，BNIP3L/NIX）能夠介導線粒體自噬；LC3-Ⅱ（microtubule associatedprotein light chain 3，LC3-Ⅱ）是與自噬相關的標記蛋白，表達于自噬體膜，其表達量隨自噬水平升高而增多，可在一定程度上反應細胞的自噬水平［6］。最新研究表明，細胞在低氧條件下發(fā)生自噬的水平受HIF2α 調控［7］，即細胞在低氧時會上調HIF2α，NIX作為一個直接接受HIF2α 轉錄調節(jié)的靶基因，是低氧誘導線粒體自噬發(fā)生的重要信號。在自噬過程中NIX 可招募LC3，介導線粒體自噬以對抗低氧脅迫，減少ROS 產(chǎn)生和細胞凋亡，促進細神經(jīng)元的存活，在低氧腦組織中發(fā)揮保護作用［8］。

牦牛（Bos grunniens）是高原特有經(jīng)濟物種，其生存環(huán)境平均海拔高度3 000～6 000 m，作為高原土著物種，長期以來形成了特殊的生理機制以應對高原低氧環(huán)境［9-10］。其中，有研究表明牦牛腦組織對低氧有一定適應性［11-12］。腦組織對低氧的適應性與低氧誘導因子的調控作用直接相關。但目前關于HIF2α/NIX介導的自噬相關蛋白在牦牛腦組織中的分布尚鮮見報道。因此，本研究利用免疫組織化學、免疫熒光、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術，對HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ、Caspase-3mRNA 及其蛋白在成年牦牛腦組織的分布及表達量進行檢測，探討HIF2α/NIX 通路介導的自噬在牦牛腦組織適應低氧過程中可能的調控作用，以期為深入探討高原牦牛腦組織的適應性機制和高原病分子病理機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取甘肅省甘南藏族自治州健康的成年牦牛（3～5 歲）各5 頭份，供采樣的牦牛均生活于海拔3 000～4 000 m 的地區(qū)，每頭牛均為頸動脈放血致死后迅速取下大腦、小腦、丘腦、延髓以及海馬石蠟切片組織樣品和qRT-PCR 分子樣品，并且將組織樣品浸泡在4%的多聚甲醛溶液中，用于制備石蠟切片，分子樣品存放在液氮中之后再轉移至-80 ℃冰箱中備用，用于提取RNA。

1.2 石蠟切片制備

腦組織固定于4%多聚甲醛溶液7 d 以上，將腦組織切為1 cm3大小方塊，自來水持續(xù)沖洗1 d，梯度濃度酒精脫水，二甲苯透明5～10 s，不同熔點石蠟浸潤，包埋，切為4 μm連續(xù)切片。

1.3 腦組織HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ及Caspase-3 的免疫組化染色及光密度分析

石蠟切片通過二甲苯及梯度酒精脫蠟，玻片使用檸檬酸鹽高溫煮沸，以修復抗原，暴露抗體結合位點。滴加0.03% H2O2在37 ℃條件下阻斷15 min，防止內源性過氧化物酶干擾，再滴加山羊血清室溫封閉10 min，然后進行免疫組織化學染色。一抗HIF2α、LC3-Ⅱ和Caspase-3（博奧森，北京）以1∶400 稀釋，NIX 抗體（abcam）以1∶600稀釋，放于4 °C 冰箱過夜孵育。然后與鼠抗家兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）于37 ℃孵育15 min，最后與鏈霉親和素-生物素復合物（streptavidin-biotin complex，SABC）于37 ℃孵育10 min。每次孵育后用0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）浸洗3 次以上。用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色30 s，顯色完成后立即浸入蒸餾水中終止反應。使用蘇木精染液進行細胞核染色處理，自來水返藍10 min，最后進行梯度酒精脫水和二甲苯透明處理，以中性樹脂封片。使用DP71型光學顯微鏡（Olympus，日本）觀察并拍照。用PBS代替一抗作為陰性對照，其余步驟和條件相同。使用Image-Pro plus 6.0 軟件測量免疫組化圖片分析光密度。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 進行單因素方差分析，組內P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

1.4 腦組織HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ及Caspase-3 分布的免疫熒光染色

免疫熒光組織包埋、切片、脫蠟及抗原修復方法與免疫組化相同，滴加一抗工作液時，先滴加一種抗體工作液，37 ℃孵育2 h，PBS 浸洗3 次，再滴加第二種抗體工作液4 ℃過夜孵育，二抗滴加不同熒光的二抗混合液，PBS清洗8次，每次5 min。使用含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）抗熒光淬滅封片劑封片，避光4 ℃保存。陰性對照用PBS取代一抗進行孵育。為了確定四種因子在各組織中的定位情況，該試驗同時對腦組織石蠟切片進行免疫熒光雙染，選擇神經(jīng)元核抗原抗體NeuN （Thermo Scientific，美國），與四種因子雙重免疫熒光染色。其中，NeuN 陽性顆粒鏡下觀察為綠色熒光，其他因子陽性顆粒觀察為紅色熒光。二者重合后觀察熒光呈黃色。

1.5 腦組織HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ及Caspase-3 mRNA水平的qRT-PCR檢測

提取的不同時期RNA，按照EVO-M-MLV 反轉錄試劑盒（北京艾科瑞）分別將各個組織樣本反轉錄得到cDNA，以cDNA 為模板，進行qRT-PCR 擴增。PCR 反應步驟為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，退火40 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸30 s，40 次循環(huán)。為保證結果的準確性，每個樣品設置3 個復孔。將收集到的數(shù)據(jù)通過Excel 2010 整理，目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算，用平均值±標準誤表示計算結果。對計算結果進行單因素方差分析（one-way ANOVA），分析軟件為SPSS 26.0，P＜0.05表示差異顯著。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primer information of qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 腦組織HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ及Caspase-3 的免疫組化染色及光密度分析

光密度分析結果顯示，HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ蛋白表達量在大腦皮層和海馬中最高，與丘腦、延髓和小腦差異顯著（P＜0.05），在丘腦、延髓和小腦中表達量差異不顯著。此外，Caspase-3平均光密度在各個組織中差異不顯著，但顯著低于HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各因子在腦組織中的平均積分光密度Fig.1 The average integrated optical density of each factor in brain tissue

鏡下觀測免疫組織化學陽性著色區(qū)域發(fā)現(xiàn)，NIX、LC3-Ⅱ及Caspase-3 陽性反應分布在細胞質，主要位于大腦皮質的多形細胞層以及海馬的CA 區(qū)錐體細胞層，丘腦、延髓和小腦中均有表達。此外，HIF2α陽性反應在神經(jīng)元細胞核和細胞質中均有分布（圖2～5）。

圖2 腦組織中HIF2α的免疫組化染色Fig.2 Immunohistochemical staining of HIF2α in brain tissue

圖3 腦組織中NIX的免疫組化染色Fig.3 Immunohistochemical staining of NIX in brain tissue

圖4 腦組織中LC3-Ⅱ的免疫組化染色Fig.4 Immunohistochemical staining of LC3-Ⅱ in brain tissue

圖5 腦組織中Caspase-3的免疫組化染色Fig.5 Immunohistochemical staining of Caspase-3 in brain tissue

2.2 HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ和Caspase-3 在腦組織分布的免疫熒光染色分析

分析免疫熒光染色結果可發(fā)現(xiàn)，四種因子的熒光表達位置基本上與免疫組化陽性反應位置相同，在大腦皮質中大多分布于錐體層神經(jīng)元，在海馬中分布于顆粒細胞層神經(jīng)元胞體，在丘腦和延髓中分布于神經(jīng)元胞體，在小腦中分布于浦肯野細胞層，以及顆粒細胞層。通過與NeuN 抗體雙重免疫熒光染色可以發(fā)現(xiàn)，四種因子在重合（merge）之后熒光位置與NeuN 表達位置重合，在圖中呈黃色熒光分布（圖6～9）。

圖6 HIF2α在腦組織分布的免疫熒光染色Fig.6 Immunofluorescence staining of HIF2α distribution in brain tissue

圖7 NIX在腦組織分布的免疫熒光染色Fig.7 Immunofluorescence staining of NIX distribution in brain tissue

圖8 LC3-Ⅱ 在腦組織分布的免疫熒光染色Fig.8 Immunofluorescence staining of LC3-Ⅱ distribution in brain tissue

圖9 Caspase-3在腦組織分布的免疫熒光染色Fig.9 Immunofluorescence staining of Caspase-3 distribution in brain tissue

2.3 腦組織HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ及Caspase-3 mRNA水平分析

qRT-PCR 檢測結果顯示，成年牦牛腦組織中HIF2α、NIX、LC3-ⅡmRNA 水平在大腦皮質和海馬中最高，顯著高于丘腦、延髓和小腦（P＜0.05），在丘腦、延髓和小腦中mRNA水平差異不顯著。Caspase-3mRNA水平趨勢在大腦、海馬、小腦、丘腦和延髓中相似，且差異不顯著（圖10）。

圖10 腦組織各因子mRNA水平的qRT-PCR分析Fig.10 qRT-PCR analysis of mRNA level in brain tissues

3 討論

前人研究發(fā)現(xiàn)，在高原低氧環(huán)境中，機體受低氧因素影響，HIF2α基因轉錄增高，調控下游一系列基因的轉錄和表達［13-14］。如GLUT1［15］、TGFA［16］和OCT-4［17］等基因的表達，能夠提高血腦屏障通透性和葡萄糖的轉運量，維持腦組織能量供給，從而提高細胞對低氧環(huán)境的適應性。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種高原物種體內HIF2α 水平較高，如藏羊［18］、高原鼠兔［19］、藏豬［20］等。本研究發(fā)現(xiàn)，牦牛大腦皮質、海馬、丘腦、延髓及小腦中均有HIF2αmRNA 和蛋白表達，且大腦皮質和海馬中HIF2αmRNA 和蛋白水平最高，顯著高于丘腦、延髓及小腦，這與Chertok［21］等研究結果相似。另外，有研究顯示，低氧能夠激活HIF2α的表達，推測成年牦牛各腦組織對低氧的敏感性不同，大腦和海馬對低氧環(huán)境更為易感［14］。免疫組化試驗結果顯示，HIF2α 主要表達位置為神經(jīng)元胞核與胞質。這與Keith 等［22］的研究結果一致，由于HIF2α已被證實在細胞核中有表達，其可能作為核轉錄基因調控下游基因的表達。

Ma等［23］通過觀察大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的模型，發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后24 h內，神經(jīng)元中NIX 水平升高，且NIX 會介導自噬發(fā)生，從而減輕了創(chuàng)傷性腦損傷。有相關研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注的神經(jīng)元細胞中，NIX 是誘導自噬的必要條件，NIX 介導的自噬通過清除受損線粒體，在急性腦缺血中的起到保護作用［24］。本試驗發(fā)現(xiàn)，NIXmRNA 和蛋白在成年牦牛大腦皮質、海馬、丘腦、延髓及小腦中均有表達，且大腦皮質與海馬表達量較高，這也與HIF2α 結果相對應。有報道顯示，HIF2α 可直接調控NIX 的表達，HIF2α 在NIX 附近顯著富集，且在低氧條件下，HIF2α 能夠與NIX 啟動子結合。另外，研究報道經(jīng)HIF2α 抑制劑預處理和低氧培養(yǎng)后，NIX 的表達明顯低于單純低氧培養(yǎng)的細胞［25］，NIX 在細胞質可誘導細胞自噬。提示綜上，推測本試驗中牦牛腦組織中HIF2α可能誘導NIX的表達，促進自噬。

劉文倩［26］通過小鼠腦組織缺血再灌注試驗，發(fā)現(xiàn)缺血腦組織在自噬初期，NIX可作為受體結合LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ的表達量隨著自噬水平升高而增加。Sheng等［27］發(fā)現(xiàn)小鼠在急性腦缺血后（72 h）觀察到NIX 與LC3的結合增強，且細胞凋亡水平下降，表明一定程度的自噬可能與延遲的神經(jīng)元凋亡相關。本研究通過qRT-PCR、免疫組化光密度分析發(fā)現(xiàn)NIX、LC3-ⅡmRNA 和蛋白表達趨勢相同，兩種因子在大腦和海馬中表達量較高，與其他組織差異顯著。Radak 等［28］發(fā)現(xiàn)在低氧狀態(tài)下LC3-Ⅱ的表達增加，與本研究結果一致。另外，Tao 等［29］對新生大鼠做了缺氧缺血模型研究，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ主要表達于海馬和大腦皮層，這也與本研究結果一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NIX、LC3-ⅡmRNA 和蛋白在牦牛腦組織的表達趨勢與HIF2α表達一致，且通過免疫組化染色結果發(fā)現(xiàn)HIF2α 在部分神經(jīng)元細胞核呈陽性表達，而NIX、LC3-Ⅱ在細胞核中未見陽性產(chǎn)物分布說明在成年牦牛腦組織中，由于HIF2α 的調控NIX 表達，自噬因子LC3-Ⅱ水平可能也隨之升高。

此外，雙免疫熒光染色結果顯示，HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ和Caspase-3 與神經(jīng)元細胞共定位，陽性表達區(qū)域重合后呈黃色熒光，說明四種蛋白可能主要在神經(jīng)元發(fā)揮作用。自噬可以通過降低線粒體外膜通透性和線粒體促凋亡蛋白等來防止細胞凋亡［30］。楊柯等［31］研究發(fā)現(xiàn)，當自噬水平升高時，Caspase-3 表達水平顯著降低。在本試驗中，Caspase-3mRNA 和蛋白水平在大腦和海馬表達水平與腦組織其他部位差異不顯著。Ma 等［23］通過TUNEL 染色觀察缺血性損傷后一定時間段內細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷后退行性神經(jīng)元的凋亡率和數(shù)量顯著增加，但當NIX 蛋白水平上調時，退行性神經(jīng)元的凋亡率和數(shù)量減少。綜上，推測Caspase-3mRNA 和蛋白在牦牛大腦和海馬與腦組織其他部位中無顯著性差異性的表達，可能與NIX 介導的自噬保護作用有關。

4 結論

成年牦牛腦組織中HIF2α、NIX和LC3-ⅡmRNA和蛋白表達量在海馬和大腦皮質較高，其次為丘腦、延髓及小腦，且陽性表達位置主要分布于神經(jīng)元，以上研究結果表明，牦牛腦組織中海馬和大腦皮質相對其他部位可能對低氧更敏感；另外牦牛腦組織中大腦和海馬Caspase-3 表達水平與其他腦組織無差異，提示NIX/LC3-Ⅱ通路相關蛋白的表達，可能提高腦組織自噬水平且維持腦組織的較低凋亡水平，從而抵御低氧環(huán)境不利影響，具體機制有待深入研究。