楊 帥 段宏偉 呂建樹 曾建林 閆振興 胡俊杰 張 勇 趙興緒

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/甘肅省動物生殖生理及繁殖調(diào)控重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

羊皮下膿腫病包括由偽結核棒狀桿菌引起的干酪性淋巴結炎（caseous lymphadenitis，CLA）［1-3］和其他化膿性細菌引起的皮下膿腫［4-5］，在世界范圍廣泛流行，對小反芻動物中的綿羊（Ovis aries）和山羊（Capra hircus）危害較大，發(fā)病率為1%～30%［6-8］。病羊以成年羊為主，表現(xiàn)為食欲減退，逐漸消瘦，生產(chǎn)性能下降，繁殖功能受損。

羊皮下膿腫病是由細菌侵入家畜皮下而引發(fā)的嚴重炎癥反應，導致皮下出現(xiàn)局部腫大、熱痛，引發(fā)功能障礙，如不進行人為處理將導致病情十分頑固，甚至會經(jīng)血液、淋巴管轉移至其他組織，發(fā)生膿毒敗血癥，對生產(chǎn)造成不利影響［9］。該病的特點是亞急性或慢性病程，膿腫多見于面頰、下頜、頸部和肩關節(jié)，常通過外界引種將病原體引入畜群，并主要通過動物間的直接接觸在畜群內(nèi)傳播，皮膚和粘膜是感染的主要途徑，其次是呼吸道和消化道［10］。引起皮下膿腫的病原較復雜，據(jù)目前相關報道，主要致病菌有金黃色葡萄球菌［11-13］和偽結核棒狀桿菌、化膿隱秘桿菌［14］等。另外，有研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌也可以引起牛的軟組織膿腫［15］。

綜上，羊皮下膿腫病在全球范圍廣泛流行，病原菌組成復雜，膿腫類型多種多樣，不同的飼養(yǎng)管理因素也可能對該病的發(fā)生發(fā)展造成影響。目前國內(nèi)對皮下膿腫病的研究以山羊為主［2-4，6-7，11-13］，對綿羊皮下膿腫病的大面積流行缺乏調(diào)查和病原研究。因此，本試驗對慶陽地區(qū)6 個典型發(fā)病湖羊場進行調(diào)查采樣，通過微生物多樣性測序和分離培養(yǎng)鑒定致病菌，并通過動物試驗進行致病菌毒力鑒定及組織病理學檢查，以期為甘肅慶陽地區(qū)湖羊皮下膿腫病的防控及其致病機理研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒，北京Solarbio公司；羊血清，天津康源生物技術有限公司；無菌脫纖維綿羊血，南京森貝伽生物科技有限公司；藥敏片，杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒，北京Tiangen 生化有限公司；DL2000DNA Maker、2×Taq PCR Mix、核酸染料、Safe DNA Dye，北京TransGen有限公司。

1.2 主要儀器與設備

DYCP-31A 電泳儀，北京六一儀器廠；ZQTY-70S恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；DP-73正置光學顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；PCR 擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；LDZX-50 高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；ST8R 低溫高速離心機，美國THERMO公司。

1.3 調(diào)查內(nèi)容及樣品采集

于2022年6月對慶陽地區(qū)存在湖羊皮下膿腫病的3 家育肥場（Q、K、Z）和3 家繁育場（X、Y、M）進行實地調(diào)查，累計調(diào)查湖羊群體數(shù)量17 305 只。統(tǒng)計發(fā)病部位、發(fā)病湖羊性別、年齡及發(fā)病率等。以訪問形式了解該病發(fā)病病程、發(fā)病季節(jié)、養(yǎng)殖場管理和檢疫情況。現(xiàn)場分別隨機采集各場患病湖羊體表膿腫中的膿汁樣本，將用于分離培養(yǎng)的樣本冷藏保存并于當天送至實驗室培養(yǎng)，將用于16S 微生物多樣性測序的樣本立即放入液氮冷凍保存。

1.4 三代微生物多樣性測序分析

將無菌采集冷凍保存的膿汁送至北京百邁客生物科技有限公司進行三代微生物多樣性測序分析，三代微生物多樣性基于PacBio 測序平臺，利用單分子實時測序（single molecule real-time，SMRT）的方法對marker基因進行測序，之后對環(huán)形一致性序列（circular consensus sequencing，CCS）進行過濾、聚類或去噪，并進行物種注釋及豐度分析，以揭示樣品的物種構成。

1.5 細菌的分離培養(yǎng)及鑒定

將無菌采集的膿汁在無菌生理鹽水中按1∶100 的比例充分稀釋，劃線接種于血平板培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待長成單個菌落時觀察其形態(tài)以及是否溶血，挑取單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢鑒定，并進行細菌的分離和純培養(yǎng)。純培養(yǎng)后繼續(xù)進行革蘭氏染色鏡檢鑒定，初步判斷其細菌種屬，保存單一菌種進行16S測序鑒定。根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒的提取步驟進行DNA 提取。以細菌16SrRNA通用引物為引物［16］，序列為：F：5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3'，以提取的細菌DNA 為模板進行PCR 擴增。擴增體系為25 μL：上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，2×Taq PCR Master MIX 15 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。取7 μL 的PCR 擴增產(chǎn)物在含1%瓊脂糖的凝膠上進行電泳。將條帶單一的PCR 擴增產(chǎn)物送至蘭州天啟生物科技有限公司進行測序，測序結果于美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）官網(wǎng)上進行堿基局部對準檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對分析。使用MEGA5.0軟件分析序列，構建分子遺傳樹。

1.6 分離菌株的動物致病性試驗和組織病理觀察

分別挑取一株金黃色葡萄球菌和大腸桿菌單菌落接種于含血清的營養(yǎng)肉湯，培養(yǎng)24 h后收集菌液，根據(jù)平板計數(shù)法計算細菌的菌落形成單位（colony-forming units，CFU），用生理鹽水將菌液濃度調(diào)整至1×108CFU·mL-1。試驗組分金黃色葡萄球菌感染組和大腸桿菌感染組，每組18只小鼠，皮下、腹腔和胃腸分別各接種6 只，每只接種0.2 mL。對照組18 只小鼠分別用等量生理鹽水接種。所有試驗小鼠在相同條件下飼養(yǎng)，觀察并記錄小鼠生長情況，及時剖檢死亡小鼠，采集病料做涂片檢查和病理切片。將小鼠組織固定在4%多聚甲醛溶液中，48 h后進行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，并在光學顯微鏡下觀察拍照。

1.7 分離菌株的藥物敏感性試驗

采用K-B 紙片擴散法對分離菌進行藥物敏感性試驗。接種環(huán)蘸取純化的菌落后，使用無菌生理鹽水分別將其稀釋為0.5麥氏比濁度的菌液［17］。取100 μL至MH肉湯培養(yǎng)基上，用涂布棒涂抹均勻，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。使用游標卡尺對抑菌圈直徑進行測量，根據(jù)抑菌圈直徑大小判定其敏感性。

2 結果與分析

2.1 流行病學調(diào)查結果

對甘肅省慶陽地區(qū)存在湖羊皮下膿腫病的6 個湖羊養(yǎng)殖場發(fā)病情況進行統(tǒng)計調(diào)查，結果見表1。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病全年均可發(fā)生，以育成公羊多發(fā)。發(fā)病常見于湖羊頸部、耳下、乳房等部位（圖1），病初觸摸腫塊質(zhì)地堅實，隨著病程的發(fā)展，膿腫部位逐漸變軟，之后破裂流出大量膿汁，幾天后會自動結痂愈合，但會在周圍或者原處長出新的膿腫，病情十分頑固。該病病程緩慢，在羊群中逐漸蔓延，嚴重者發(fā)病率達20%。

圖1 湖羊皮下膿腫病自然病例Fig.1 Natural case of sheep subcutaneous abscess disease

表1 2022年甘肅省慶陽市湖羊皮下膿腫病發(fā)病情況調(diào)查Table 1 Investigation on the incidence of sheep subcutaneous abscess in Qingyang City，Gansu Province in 2022

2.2 微生物多樣性測序分析結果

對6 個病料樣本進行微生物多樣性測序，結果顯示（圖2），6 份樣本的菌種組成均以金黃色葡萄球菌占優(yōu)勢，尤其在樣本組K、M、Q中的相對豐度達到99%以上。在Y、X、Z 中還發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌、皮爾洛斯頓菌、熒光假單胞菌等菌種。

圖2 細菌物種分布柱狀圖（種水平）Fig.2 Histogram of bacterial species distribution in pus（species level）

2.3 細菌的分離培養(yǎng)及鑒定結果

6 份膿腫病料經(jīng)處理后接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)平板劃線法分離菌株。X、Y、Z 3份樣本分離純化出菌株A，6 份樣本均分離出菌株B。分離菌A 在鮮血瓊脂平板上表現(xiàn)為乳白色，荷包蛋狀，邊緣不平整，菌落周圍產(chǎn)生透明溶血圈（圖3-A），分離菌B 在鮮血瓊脂平板上表現(xiàn)為無色，圓形，菌落表面光滑，無擴展生長特點，菌落周圍產(chǎn)生透明溶血圈（圖3-B）。鏡檢結果顯示，從膿腫病料中分離出革蘭氏陰性桿菌3株，染色特征為兩端鈍圓，中等大小，單個存在（圖3-C）。分離出革蘭氏陽性球菌6 株，染色特征為球型呈葡萄串狀排列（圖3-D）。6 株陽性葡萄球菌和3 株陰性腸桿菌16SrRNA 擴增長度均在1 400～1 500 bp 之間（圖3-E），16SrRNA 測序后經(jīng)GenBank 進行BLAST 比對，結果表明陽性球菌與金黃色葡萄球菌同源性最高，陰性桿菌與大腸桿菌同源性最高。用兩株分離菌的16SrRNA 全長與GenBank 中公布的參考序列構建分子遺傳進化樹（圖3-F），其中分離菌株A 測序得到兩組序列ST1、ST2，分別與不同金黃色葡萄球菌參考序列形成分支；分離菌株B 測序得到的序列EC 與大腸桿菌參考序列形成分支。

圖3 分離菌株的培養(yǎng)和鑒定結果Fig.3 Growth status and identification results of the isolates

2.4 小鼠致病試驗結果

2.4.1 解剖觀察結果 小鼠在腹腔、灌胃接種分離菌后均表現(xiàn)出打堆、精神萎靡、毛發(fā)散亂等癥狀，皮下感染組小鼠狀態(tài)正常。觀察統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染毒性大于大腸桿菌組，腹腔感染毒性大于灌腸組。體內(nèi)感染金黃色葡萄球菌小鼠胸腔背側均出現(xiàn)干酪樣化膿灶（圖4-A），皮下感染小鼠在感染部位出現(xiàn)干酪樣化膿灶，導致背側皮膚粘連，難以剝離（圖4-B）；體內(nèi)感染大腸桿菌小鼠背側出現(xiàn)散在的淡灰色化膿灶，觸摸堅實（圖4-C），皮下感染大腸桿菌小鼠在感染部位出現(xiàn)同樣質(zhì)地較小化膿灶（圖4-D）。最后，采集小鼠膿腫病料后分離培養(yǎng)得到與接種菌株相同的細菌。

圖4 分離菌感染小鼠臨床病變Fig.4 Abscess lesions in infected mice

2.4.2 組織切片觀察結果 小鼠感染兩種分離菌死亡后迅速取材制作病理切片，可見感染金黃色葡萄球菌小鼠心臟充血（淺藍色箭頭）（圖5-A）；肝臟中央靜脈充血（黑色箭頭），肝竇充血（淺藍色箭頭）（圖5-B）；脾臟實質(zhì)細胞壞死，脾小體萎縮（圖5-C），肺臟肺泡隔充血出血（黑色箭頭）（圖5-D）；腎臟腎小管腫脹（黑色箭頭），腎小球充血出血（淺藍色箭頭）（圖5-E）；膿腫部位皮膚表現(xiàn)為化膿壞死性肌炎，肌細胞溶解壞死（淺藍色箭頭），可見大量增生纖維細胞和毛細血管，大量炎性細胞浸潤（黑色箭頭），局灶性壞死（黃色箭頭）（圖5-F）。感染大腸桿菌小鼠心臟心肌纖維變性（黑色箭頭），且可見充血出血（圖5-G）；肝臟肝細胞局灶性病變壞死（黑色箭頭），肝竇充血和大面積的藍紫色壞死灶（淺藍色箭頭）（圖5-H）；脾臟實質(zhì)細胞彌漫性出血型壞死，伴有大量炎性細胞浸潤（圖5-I）；肺臟肺泡隔充血出血，肺泡隔變寬（黑色箭頭）（圖5-J）；腎臟病變與金黃色葡萄球菌感染一致（圖5-K）；膿腫部位同樣增生大量纖維細胞和毛細血管，大量炎性細胞浸潤（黃色箭頭）（圖5-L）。

圖5 分離菌感染小鼠病理切片（HE染色）Fig.5 Pathological sections of isolated bacteria-infected mice （HE staining）

2.5 藥物敏感性試驗結果

藥敏試驗結果顯示（表2），兩種分離菌對幾種常用抗生素藥物均有較好的敏感性。大腸桿菌對環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、氧氟沙星和多粘菌素B 敏感，對頭孢噻吩表現(xiàn)為耐藥。金黃色葡萄球菌對頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、紅霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、苯唑西林和利福平敏感。

表2 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的藥物敏感性Table 2 Drug sensitivity of Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 討論

由于綿羊皮下膿腫病致病病原復雜且癥狀相似，難以通過臨診診斷為CLA 或其他細菌感染，為該病的防治帶來一定困難。本研究對甘肅省慶陽地區(qū)湖羊皮下膿腫病的流行特點及致病病原進行調(diào)查研究，以期對該地區(qū)及全國湖羊皮下膿腫病的防治措施制定提供依據(jù)。本研究得到湖羊皮下膿腫病的病情發(fā)病率與李鄉(xiāng)城［13］的研究結果相似，但調(diào)查結果顯示育肥羊場的發(fā)病率普遍高于繁育羊場。金黃色葡萄球菌與大腸桿菌在環(huán)境中廣泛存在，在養(yǎng)殖場中具有更高的帶菌率，感染造成人和動物其他部位膿腫的病例也較常見［18-19］，當出現(xiàn)如皮膚損傷等易感現(xiàn)象時極易造成皮下化膿感染［20-22］。由此推測育肥羊場發(fā)病率高于繁育羊場可能與短期育肥導致的亞急性瘤胃酸中毒引起的綿羊腸道屏障受損有關，有待進一步研究證實。16S微生物多樣性檢測結果顯示，6 個養(yǎng)殖場病料具有共同的病原菌金黃色葡萄球菌，且種源關系接近，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地區(qū)羊只市場流通頻繁，各養(yǎng)殖場對調(diào)引羊只疏于檢疫，可能是造成病原體在地區(qū)內(nèi)全面流行的風險因素。前人研究表明，羊皮下膿腫病以偽結核棒狀桿菌和金黃色葡萄球菌的單純感染和混合感染為主［23-26］，其他化膿性細菌感染散發(fā)［13-14］。本研究細菌分離鑒定結果表明6 份樣本均為金黃色葡萄球菌感染，另有3 份大腸桿菌的混合感染，并未檢測到偽結核棒狀桿菌，這與國外規(guī)?；B(yǎng)羊場的羊皮下膿腫病大多由偽結核棒狀桿菌引起的結果不同［27-29］，表明金黃色葡萄球菌也可造成類似于CLA 癥狀的膿腫病的廣泛流行，為國內(nèi)湖羊皮下膿腫病的防治研究補充了數(shù)據(jù)。

本研究動物試驗發(fā)現(xiàn)兩種菌對試驗動物具有致病性，解剖觀察可見金黃色葡萄球菌感染面積較大腸桿菌更大，出現(xiàn)膿腫病變更嚴重。小鼠內(nèi)臟器官病理變化主要以充血、出血、壞死和炎性細胞浸潤為主，皮膚組織結構被破壞，發(fā)生廣泛炎癥，這與王銳鴻等［3］、韓曉芳［9］人工感染試驗動物的臨床與病理變化結果相似。藥敏試驗顯示，大腸桿菌對環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、氧氟沙星和多粘菌素B 4 種藥物敏感，對頭孢噻吩表現(xiàn)為耐藥；金黃色葡萄球菌對頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素等藥物均敏感。這與徐志豪等［7］、張斯旂等［12］有關金黃色葡萄球菌對常用抗生素普遍耐藥的結果不同，說明該地區(qū)在治療該病時未長期使用抗生素。根據(jù)本研究流行病學調(diào)查與致病原檢測結果，提出以下防治建議：在調(diào)引羊只時嚴格檢疫，阻止病原體流入；嚴格查群，對病羊及時隔離并進行手術治療，在膿腫部位及全身配合敏感抗生素治療，手術場所需遠離羊群；做好圈舍消毒和手術室消毒。

4 結論

本研究從病原學和流行病學兩方面對甘肅慶陽地區(qū)湖羊皮下膿腫病的爆發(fā)進行了調(diào)查研究。發(fā)現(xiàn)該地區(qū)湖羊皮下膿腫病發(fā)病率較高，繁殖場與育肥場發(fā)病率存在差異，地區(qū)內(nèi)流行病原菌存在同源性。研究確定了金黃色葡萄球菌是該病的主要病原菌，同時存在大腸桿菌的混合感染。手術配合抗生素治療病羊可見成效，地區(qū)疫病的防治需嚴格執(zhí)行程序化檢疫和消毒。