■ 高嫣珺 聶 雅 陳秀云 張思微 劉 瑜 卜仕金*

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

豆粕是當(dāng)前主流的飼料蛋白質(zhì)原料，2022年飼料中豆粕用量為6 580 t，占比為14.5%[1]。我國大豆高度依賴進(jìn)口，2022 年進(jìn)口量達(dá)9 108 萬噸，大部分用于生產(chǎn)飼用豆粕，但自然災(zāi)害等因素使其進(jìn)口有很大的不確定性[2]。為了應(yīng)對外部的不確定性，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2023 年4 月12 日印發(fā)了《飼用豆粕減量替代三年行動方案》的通知，充分挖掘微生物菌體蛋白，實(shí)現(xiàn)2025 年新批準(zhǔn)1～2 種微生物菌體蛋白上市，以減少豆粕依賴，是行動的目標(biāo)之一[3]。莢膜甲基球菌蛋白（Methylococcus capsulatus bacteriameal，MBM）來源于天然存在的非轉(zhuǎn)基因微生物的培養(yǎng)物，粗蛋白含量高達(dá)65%，主要由甲烷氧化菌莢膜甲基球菌在發(fā)酵過程中使用甲烷、氧氣、氨氮和礦物質(zhì)迅速增殖產(chǎn)生，其生產(chǎn)不占用耕地、不使用動植物性原料且僅耗費(fèi)極少的水資源，相比于傳統(tǒng)的動植物蛋白具有顯著的優(yōu)勢[4-6]。研究表明，MBM 不僅可代替魚粉成為大西洋鮭魚、虹鱒、羅非魚等水產(chǎn)動物飼用蛋白質(zhì)來源，在畜禽（斷奶仔豬、育肥豬）養(yǎng)殖業(yè)同樣具有廣闊的應(yīng)用前景[7-10]。為了將MBM 開發(fā)為新飼料原料，本研究進(jìn)行了包括鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變（Ames）試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)在內(nèi)的MBM遺傳毒性研究和大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)，提供MBM開發(fā)為新飼料原料所需的毒理學(xué)安全性評價資料[11]，為MBM 在我國養(yǎng)殖業(yè)作為替代蛋白飼料原料應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 受試物

MBM，粗蛋白含量≥65%，褐色粉末。批號為FNJ012-20210308，由愷迪蘇（重慶）有限公司南京中試基地提供。用于Ames 試驗(yàn)的不同濃度MBM 水溶液使用無菌水溶解；用于小鼠骨髓細(xì)胞微核和精子畸形試驗(yàn)的不同濃度的MBM 混懸液使用0.5%羧甲基纖維素鈉配制；用于被動皮膚過敏試驗(yàn)的MBM 生理鹽水溶液使用生理鹽水溶解。不同濃度的MBM 溶液均采用2倍遞次稀釋法配制。

1.2 主要試劑

環(huán)磷酰胺購自Halle 公司；Giemsa 染液購自Solorbio 公司；疊氮鈉、敵克松、2-氨基芴、2-氨基蒽和1,8-二羥蒽醌購自Sigma公司；羧甲基纖維素鈉、磷酸氫鈉銨、枸椽酸、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、二甲基亞砜、D-生物素、L-組氨酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、氧化型輔酶Ⅱ、瓊脂粉、牛肉膏、胰胨等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

代謝活化系統(tǒng)（S9）在試驗(yàn)前由多氯聯(lián)苯在雄性成年Wistar 大鼠誘導(dǎo)制備，活力經(jīng)診斷性誘變劑鑒定符合試驗(yàn)要求。

1.3 主要儀器

D98-9052B-2 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CX2 光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus 公司；Centrifuge 5415R 高速冷凍離心機(jī)、微量移液器購自Eppendorf 公司；BCD-251WDGW 購自Haier公司。

1.4 試驗(yàn)動物與菌株

試驗(yàn)動物：清潔級ICR小鼠100只，體重25～35 g，其中75 只為雄性，25 只為雌性；清潔級Wistar 大鼠250 只，體重150～180 g，雌雄各半。試驗(yàn)動物均購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2022-0009，使用許可證號為SYXK（蘇）2022-0044。

試驗(yàn)菌株：Ames 試驗(yàn)使用的標(biāo)準(zhǔn)測試菌株為組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535，購自Moltox 公司，經(jīng)生物學(xué)特性鑒定合格后用于試驗(yàn)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 Ames試驗(yàn)

參考《獸藥Ames 試 驗(yàn)指導(dǎo) 原則》[12]和《GB 15193.4—2014 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)》[13]進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)點(diǎn)試法進(jìn)行的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)高（10 mg/皿）、中高（5 mg/皿）、中（2.5 mg/皿）、中低（1.25 mg/皿）、低（0.625 mg/皿）共5 個MBM 劑量組，另設(shè)陰性對照組（無菌水）及陽性對照組，每個劑量組包括有S9（+S9）和無S9（-S9）兩個系列，采用平板滲入法，測試MBM對TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 的致突變作用，每個MBM劑量組或?qū)φ战M每種菌株分別設(shè)3個平行皿，于37 ℃培養(yǎng)48 h 后計(jì)數(shù)每皿的回變菌落數(shù)。如果MBM 劑量組回變菌落數(shù)的增加超過陰性對照組2 倍以上，且滿足以下兩種情況之一：①有劑量-反應(yīng)關(guān)系；②某一測試點(diǎn)有可重復(fù)的陽性結(jié)果，則可判定為陽性結(jié)果。

1.5.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

參考《獸藥小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[12]和GB 15193.5—2014《哺乳動物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)》[14]進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)高（10 000 mg/kg）、中（5 000 mg/kg）和低（2 500 mg/kg）3個MBM 劑量組，另設(shè)陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg）和陰性對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉），每組10 只小鼠，雌雄各半。采用30 h 兩次染毒法，即兩次染毒間隔24 h，第2 次染毒后6 h 采集骨髓樣品制片。MBM 劑量組和陰性對照組經(jīng)口灌胃染毒，陽性對照組腹腔注射，高、中、低MBM 劑量組染毒藥液分別為0.5、0.25、0.125 g/mL 濃度的MBM 混懸液，除陽性對照組外各組均灌胃20 mL/kg。每組采樣10 只小鼠，使用胸骨段骨髓，吉姆薩染色，每只小鼠制片2張。閱片時每張涂片計(jì)數(shù)嗜多染紅細(xì)胞（PCE）1 000個，觀察并計(jì)數(shù)其中含有微核的PCE 細(xì)胞（一個PCE 中含多個微核按一個計(jì)），同時計(jì)數(shù)同一視野下的成熟紅細(xì)胞（RBC）。計(jì)算PCE/RBC 比值和微核率（‰），按照公式計(jì)算微核率。

嗜多染紅細(xì)胞微核率（‰）=含微核的嗜多染紅細(xì)胞/檢查嗜多染紅細(xì)胞總數(shù)×1 000

PCE/RBC應(yīng)在小鼠的參考值（0.6～1.2）范圍內(nèi)，陰性對照組微核率應(yīng)小于5‰，如MBM 劑量組微核率與陰性對照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，則可判定MBM微核試驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.5.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

參考《獸藥小鼠精子畸形試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[13]和GB 15193.7—2003《小鼠精子畸形試驗(yàn)》[15]進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)高（10 000 mg/kg）、中（5 000 mg/kg）和低（2 500 mg/kg）3 個MBM 劑量組和陽性（環(huán)磷酰胺40 mg/kg）、陰性對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉），每組10 只雄性小鼠。MBM 劑量組和對照組連續(xù)經(jīng)口灌胃染毒5 d，高、中、低MBM劑量組染毒藥液分別為0.5、0.25、0.125 g/mL濃度的MBM 混懸液，陽性對照組為濃度為2 mg/mL 的環(huán)磷酰胺溶液（溶劑為生理鹽水），各組灌胃體積均為20 mL/kg。首次染毒后第35天安樂死動物，每組采樣10 只小鼠，取雙側(cè)附睪制片，2%伊紅染色，每只小鼠制片2 張，每只小鼠計(jì)數(shù)共1 000 個精子中的畸形數(shù)，并分類計(jì)數(shù)（分為無鉤、香蕉形、無定性、雙頭、胖頭、尾折疊和雙尾），根據(jù)公式計(jì)算精子畸形率（%）。

精子畸形率（%）=畸形精子數(shù)/（正常精子數(shù)+畸形精子數(shù)）×100

陰性對照組精子畸形率在質(zhì)控范圍（0.8%～3.4%）內(nèi)，且陽性與陰性對照精子畸形率差異極顯著（P<0.01），則表明該試驗(yàn)系統(tǒng)可靠。MBM劑量組小鼠的精子畸形率為陰性的2倍或2倍以上，或有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，則可判斷試驗(yàn)結(jié)果為陽性。

1.5.4 被動皮膚過敏試驗(yàn)

參考《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[16]進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按體重設(shè)高（1 000 mg/kg）、中（500 mg/kg）、低（250 mg/kg）3 個MBM 劑量組，另設(shè)陽性對照組（牛血清白蛋白15 mg/kg）和陰性對照組（生理鹽水）。10只大鼠，雌雄各半，隨機(jī)均分為5組，對應(yīng)各組劑量皮下注射，隔日一次，共3次，MBM劑量組和對照組均注射3 mL/kg，MBM和牛血清白蛋白溶劑均為生理鹽水。末次致敏后第14天采血，2 000 r/min離心10 min 分離抗血清，使用生理鹽水將各組抗血清為1∶2、1∶8、1∶32三個濃度。將240只大鼠分為5組，中、低MBM 劑量組各30 只，其余組各60 只，雌雄各半，在動物背部預(yù)先脫毛3 cm×4 cm 的區(qū)域，皮內(nèi)注射各對應(yīng)組不同濃度的抗血清0.1 mL進(jìn)行被動致敏，中、低MBM 劑量組被動致敏24 h，其余組不同抗血清濃度分別致敏24 h和48 h，每組每個濃度不同時間均致敏10 只大鼠。到達(dá)致敏時間后，皮下注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原進(jìn)行激發(fā)，同時靜脈注射1.0%伊文思蘭染料1.0 mL。30 min 后安樂死各組大鼠，剪取背部皮膚，測量皮膚內(nèi)層的斑點(diǎn)大小，不規(guī)則斑點(diǎn)的直徑為長徑與短徑之和的一半，直徑大于5 mm者判定為陽性，計(jì)算各組的陽性百分率（%）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性比較采用X2檢驗(yàn)，顯著性水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ames試驗(yàn)

Ames 試驗(yàn)結(jié)果見表1，MBM 每皿劑量為0.625～10.000 mg，有或無S9 時，5 種鼠傷寒沙門氏菌試驗(yàn)株的每皿平均回變菌落數(shù)均在陰性對照的兩倍以內(nèi)，未見劑量-反應(yīng)關(guān)系，兩次試驗(yàn)結(jié)果均一致。表明MBM對鼠傷寒沙門氏菌無致突變性，MBM 的Ames 試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表1 MBM鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

由表2 可知，MBM 劑量組和陰、陽性對照組PCE/RBC 均在參考范圍內(nèi)，雌、雄小鼠MBM 劑量組PCE 微核率與陰性對照組比較無顯著差異（P≥0.05），且陽性對照組與MBM 劑量組、陰性對照組比較差異極顯著（P<0.01），同一MBM 劑量組內(nèi)雌、雄小鼠微核率顯著的性別差異（P≥0.05）。結(jié)果表明，MBM 在2 500～10 000 mg/kg 劑量范圍內(nèi)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表2 MBM小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

由表3 可知，陰性對照組精子畸形率在質(zhì)控范圍內(nèi)，MBM 劑量組精子畸形率未達(dá)陰性對照組的2倍且與陰性對照組比較無顯著差異（P≥0.05），而陽性對照組與MBM 劑量組和陰性對照組比較差異均極顯著（P<0.01）。以上結(jié)果表明本試驗(yàn)系統(tǒng)可靠，MBM 在2 500～10 000 mg/kg 劑量范圍內(nèi)小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表3 MBM小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果（n=10）

2.4 被動皮膚過敏試驗(yàn)

由表4 可知，三個MBM 劑量組和陰性對照組在1∶2、1∶8、1∶32抗血清濃度，激發(fā)24 h和48 h，所有大鼠皮膚內(nèi)側(cè)的藍(lán)色反應(yīng)斑直徑均≤5 mm，陽性對照組大鼠皮膚內(nèi)側(cè)的藍(lán)色反應(yīng)斑直徑均>5 mm。MBM劑量組與陰性對照組比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≥0.05），與陽性對照組比較差異極顯著（P<0.01）。以上結(jié)果表明MBM 在250～1 000 mg/kg 劑量范圍內(nèi)對大鼠的被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表4 MBM被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（n=10）

3 討論

MBM 作為一種非動植物源性的新型可持續(xù)功能性蛋白原料在國外沿用已久，商品名為Feed-Kind?，但其首次進(jìn)入我國市場，尚未批準(zhǔn)使用[17]?！缎嘛暳虾托嘛暳咸砑觿┕芾磙k法》[11]中規(guī)定，新飼料原料的申請資料必須包括毒理學(xué)安全評價資料，因此對MBM 進(jìn)行全面的毒理學(xué)安全性評價對其今后在我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用具有重大的推動作用。前期已完成的大、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)和90 d 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，MBM 在大、小鼠的LD50均≥10 g/kg，無作用劑量至少達(dá)到3 100 mg/kg。本研究所涉及的試驗(yàn)根據(jù)前期急性和亞慢性毒性研究結(jié)果和相關(guān)指導(dǎo)原則要求設(shè)置劑量組，保證受試物得到充分暴露。本研究參照《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[12]和食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[13-15]，進(jìn)行MBM 的Ames 試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)研究其遺傳毒性，其中Ames 試驗(yàn)根據(jù)要求設(shè)置在最高劑量下設(shè)4 個劑量組，共設(shè)5 個MBM 劑量組；微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)根據(jù)要求均設(shè)3 個MBM 劑量組。同時，參照人用藥的相關(guān)指導(dǎo)原則[16]進(jìn)行大鼠皮膚被動過敏試驗(yàn)，設(shè)3 個MBM 劑量組，在各劑量組設(shè)1∶2、1∶8、1∶32 共3 個抗血清濃度。在Ames 試驗(yàn)中，每皿劑量在0.625～10 mg 范圍內(nèi)，在加和不加S9時，各MBM 劑 量 組TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535 回變菌落數(shù)均與陰性對照接近，遠(yuǎn)低于陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，表明MBM 對鼠傷寒沙門氏菌無致突變作用。骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)通過測量微核率來評價受試物對染色體的損傷，本試驗(yàn)劑量下，MBM 對小鼠骨髓細(xì)胞的微核率與陰性對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且未達(dá)兩倍，三個MBM 劑量組微核率接近，未呈現(xiàn)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系；同時，小鼠精子畸形試驗(yàn)MBM 劑量組各類精子畸形數(shù)和總精子畸形率均符合陰性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。大鼠被動過敏試驗(yàn)中，三個MBM 劑量組在不同抗血清濃度和激發(fā)時間下，所有動物藍(lán)斑直徑均≤5 mm，均未出現(xiàn)過敏反應(yīng)。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件和劑量下，MBM 未顯示遺傳毒性和潛在的致敏作用，MBM 作為新飼料原料使用具有較高的安全性。