章麗嬌, 趙冬敏, 韓凱凱, 黃欣梅, 楊 婧, 吳鳳瑤, 劉青濤, 劉宇卓, 張小飛, 李 銀

[1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所,江蘇南京 210014; 2.獸用生物制品(泰州)國泰技術(shù)創(chuàng)新中心,江蘇泰州 225300]

坦布蘇病毒病是我國新發(fā)現(xiàn)的一種由坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)引起的以水禽嚴重產(chǎn)蛋下降和神經(jīng)系統(tǒng)異常為主要特征的重要傳染病[1-2]。該病自2010年暴發(fā)以來,傳播迅速,幾乎席卷了我國大部分水禽養(yǎng)殖地區(qū),發(fā)病率高達100%,死亡率為5%～30%[3]。目前,坦布蘇病毒已成為危害我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的主要流行病原之一。

坦布蘇病毒是黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員之一,具有典型的黃病毒屬基因組結(jié)構(gòu)特征,為單股正鏈RNA,全長10 990 nt,編碼單一的開放讀碼框,包括衣殼蛋白(C)、基質(zhì)蛋白(PrM)、囊膜蛋白(E)3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5),5′端有Ⅰ型帽子結(jié)構(gòu),3′端無聚合賴氨酸尾。研究表明,黃病毒屬病毒作為單股正鏈RNA病毒,缺失部分或全部結(jié)構(gòu)蛋白基因后仍可形成具有自主復制能力的病毒亞基因組,即RNA復制子,其可表達病毒自身非結(jié)構(gòu)蛋白和插入的外源基因蛋白,但不會產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒[4]。目前,日本乙型腦炎病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒及寨卡病毒等RNA復制子相繼被成功構(gòu)建與應用[5-8]。病毒復制子是病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能研究、抗病毒藥物篩選及新型疫苗研發(fā)等方面的有力工具。

本研究在坦布蘇病毒JXSP株感染性克隆基礎上[9],利用反向遺傳操作技術(shù),不同程度缺失病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因,同時在缺失部位插入綠色熒光蛋白基因,構(gòu)建RNA復制子,鑒定活性,并應用該平臺表達H9亞型禽流感HA基因,為坦布蘇病毒致病機制和新型疫苗的開發(fā)提供新的技術(shù)手段和平臺。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞和質(zhì)粒

試驗所用坦布蘇病毒JXSP株由中國農(nóng)業(yè)大學蘇敬良教授饋贈;BHK-21細胞系和質(zhì)粒pEGFP-N1均由筆者所在實驗室保存。

1.2 主要試劑和耗材

高保真酶Primer Star Mix,購自Takara公司;凝膠回收純化試劑盒,購自Axygen公司;RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems(T7)和Ribo m7G Cap Analog,均購自Promega公司;酚 ∶三氯甲烷 ∶異戊醇(25 ∶24 ∶1,pH值<5.0)和三氯甲烷 ∶異戊醇(24 ∶1),均購自北京索萊寶科技有限公司;Opti-MEM? I Reduced Serum Medium和Lipofectamine MessengerMAXTM,均購自Invitrogen公司;胎牛血清,購自Hyclone公司;SYBR qPCR Master Mix,購自諾唯贊公司;H9N2 HA鼠單抗,購自北京義翹神州科技有限公司;β-actin鼠單抗,購自康維世紀生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG,購自中杉金橋公司;常規(guī)的試劑和儀器均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所水禽實驗室提供。

1.3 引物設計與合成

根據(jù)GenBank中登錄的坦布蘇病毒JXSP株全基因組序列(登錄號：JQ920423)和綠色熒光蛋白基因序列設計引物(表1)。引物于2022年3月份由南京金斯瑞生物有限公司合成。

表1 TMUV RNA復制子構(gòu)建引物

1.4 4種坦布蘇病毒RNA復制子全長cDNA的構(gòu)建

采用 Axygen體液病毒核酸提取試劑盒,提取坦布蘇病毒JXSP株RNA,利用 Promega 反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA。以病毒cDNA為模板,利用表1引物分段擴增,獲得不同程度缺失結(jié)構(gòu)蛋白基因的病毒基因組PCR片段。以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板,利用EGFP-F/2A+EGFP-R引物對擴增,獲得EGFP-2A片段。各PCR目的片段產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳鑒定,并用Axygen瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒回收與純化。純化后的片段進行雙鏈DNA濃度測定。按圖1所示構(gòu)建策略,采用融合PCR方法,連接各片段,分別使病毒基因組缺失CPrME、CPrM、PrME和PrM結(jié)構(gòu)蛋白,缺失部位插入外源蛋白報告基因EGFP-2A。融合PCR反應體系如下：Primer Star Mix(2×) 25 μL,T7+1F和10990R各 1 μL,各連接片段以相同摩爾數(shù)加入,雙蒸水加至50 μL。PCR反應程序如下：98 ℃預變性5 min;98 ℃ 變性10 s、52 ℃退火15 s、72 ℃延伸3 min 30 s,30個循環(huán);72 ℃延伸7 min。融合片段電泳鑒定后切膠回收純化,送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.5 體外轉(zhuǎn)錄RNA

采用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems(T7)對純化并測序正確的融合PCR產(chǎn)物進行體外轉(zhuǎn)錄,根據(jù)說明書構(gòu)建如下30 μL反應體系：5×Reaction buffer 6.00 μL,ATP、CTP和UTP各2.25 μL,GTP 0.50 μL,Ribo m7G Cap Analog 2.25 μL,DNA模板12.00 μL,Enzyme mix 3.00 μL。37 ℃反應4 h,加入1.80 μL Dnase,37 ℃作用15 min,消化模板。苯酚三氯甲烷抽提體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,測定RNA濃度,-70 ℃保存。

1.6 轉(zhuǎn)染

采用Lipofectamine MessengerMaxTM試劑盒將純化的RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞。具體操作步驟如下：PBS輕輕洗滌細胞3次,每孔加入200 μL Opti-MEM? I Reduced Serum Medium,將1.5 μL Lipofectamine?MessengerMax Reagent與25.0 μL Opti-MEM混勻,將1 μg RNA與25 μL Opti-MEM混勻,將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液和RNA稀釋液等體積混勻,室溫5 min,復合物以50 μL/孔加入24孔板BHK-21單層細胞,同時設立轉(zhuǎn)染試劑對照,37 ℃培養(yǎng)4 h后吸棄轉(zhuǎn)染混合液,加入含3%胎牛血清的DMEM維持液,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.7 EGFP報告基因表達檢測

使用Olympus公司IX-51型熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后不同時間點4種RNA復制子在BHK-21細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達情況。

1.8 復制子中EGPF 轉(zhuǎn)錄能力檢測

采用RNA抽提試劑盒,按說明書操作提取細胞樣品RNA,反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以cDNA為模板,進行SYBR Green相對熒光定量PCR反應。EGFP基因上下游擴增引物：5′-AAGCAGAAGAACGGCATCAAGG-3′和5′-CACGAACTCCAGCAGGACCATG-3′;內(nèi)參基因β-actin上下游擴增引物：5′-TTGGAGGCTCTATCCTGG-3′和5′-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3′。用2-ΔΔCT法計算EGFP RNA相對轉(zhuǎn)錄量。

1.9 應用TMUV RNA復制子表達H9亞型禽流感HA基因

提取H9亞型禽流感病毒NJ01株RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用HA F+191F/2A+HA R引物對擴增HA片段,以ΔCPrME構(gòu)建策略為基礎,將EGFP片段替換為HA片段,利用融合PCR方法獲得基因組全長,體外轉(zhuǎn)錄為mRNA,轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞。收集轉(zhuǎn)染72 h后的細胞樣品,提取細胞總蛋白,測定蛋白濃度后經(jīng)Western blotting檢測蛋白表達。以H9N2 HA鼠單抗為一抗,辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 為二抗,ECL顯影觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種TMUV RNA復制子全長cDNA的構(gòu)建

通過PCR擴增獲得了Pa&b1、Pc&d1、Pegfp-2A、Pa&c(3+4)、Pb&d3、P4、P5、P6、P7、P8等10個目的片段,大小依次為237、504、798、1 747、1 548、1 557、1 876、1 603、2 093、1 491 bp。PCR片段經(jīng)電泳鑒定,由圖2可知,與預期大小一致。純化的PCR片段按圖1所示方案,通過融合PCR,成功獲得了ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME、ΔPrM 4種TMUV RNA復制子全長cDNA,大小依次為9 657、11 094、9 924 、11 362 bp。由圖3可知,電泳結(jié)果與預期相符,測序結(jié)果顯示,序列均與預期一致。純化的全長PCR產(chǎn)物經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和苯酚-三氯甲烷抽提,獲得ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME、ΔPrM體外轉(zhuǎn)錄mRNA,濃度分別為535、531、469、427 ng/μL。

2.2 TMUV RNA復制子活性的鑒定

為鑒定所構(gòu)建的TMUV RNA復制子的活性,將ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME和ΔPrM體外轉(zhuǎn)錄體mRNA轉(zhuǎn)染BHK-21細胞,分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h 在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)EGFP的表達情況。由圖4可知,4種復制子RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞在各檢測時間點均能在胞漿和胞核中觀察到綠色熒光信號。4種復制子中,ΔCPrME熒光信號最強,ΔPrM次之,ΔCPrM和ΔPrME無明顯差異。對照組細胞均未觀察到綠色熒光信號。以上結(jié)果表明,構(gòu)建的4種RNA復制子均能有效地表達外源蛋白EGFP,其中,ΔCPrME效果最佳。

2.3 TMUV RNA復制子表達EGFP基因能力的驗證

為驗證構(gòu)建的TMUV RNA復制子自我復制的能力,將ΔCPrME體外轉(zhuǎn)錄體mRNA轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后,分別于12、24、48、72 h收集細胞樣品RNA,進行相對熒光定量PCR反應。由圖5可知,隨著時間的推移,復制子EGFP RNA量呈現(xiàn)增長趨勢,轉(zhuǎn)染24、48、72 h后細胞樣品中EGFP RNA量分別比12 h增長了約2.9倍、5.8倍和9.8倍,表明TMUV RNA復制子ΔCPrME具有自我復制的能力,能夠表達外源基因。

2.4 應用TMUV RNA復制子表達H9亞型禽流感HA基因

Western blotting結(jié)果(圖6)顯示,插入HA基因的TMUV RNA復制子轉(zhuǎn)染細胞72 h后,能夠檢測到HA蛋白的表達,表明構(gòu)建的TMUV RNA復制子能夠應用于外源蛋白的表達。

3 討論與結(jié)論

病毒復制子技術(shù)是研究病毒復制和翻譯、抗病毒藥物篩選以及新型疫苗開發(fā)的理想工具。研究表明,黃病毒屬病毒作為單鏈正股RNA病毒,在缺失結(jié)構(gòu)蛋白后仍可由自身非結(jié)構(gòu)蛋白完成亞基因組的復制,但復制效率可能與缺失程度相關(guān)。因此,本研究以坦布蘇病毒JXSP株感染性克隆為基礎,分別對病毒基因組進行CPrME、CPrM、PrME和PrM等4種方式結(jié)構(gòu)蛋白基因的缺失,成功構(gòu)建了4種病毒RNA復制子。為檢測復制子的活性和表達外源基因的能力,缺失部位插入綠色熒光蛋白報告基因,并在報告基因序列后面引入口蹄疫病毒2A蛋白基因序列(FMDV 2A),該蛋白具有自剪切功能,可將外源基因有效地分離出來[10]。文獻報道,黃病毒基因組5′UTR下游的C蛋白編碼區(qū)存在多個病毒復制和翻譯必需的功能性元件,包括5′AUG下游序列、衣殼蛋白編碼區(qū)發(fā)卡結(jié)構(gòu)、5′保守序列等[11]。所以為保證復制子的有效復制和翻譯,在構(gòu)建ΔCPrME和ΔCPrM復制子時,本研究保留了C蛋白氨基端的39個氨基酸編碼序列。在構(gòu)建ΔCPrME和ΔPrME復制子時,保留了E蛋白羧基端的30個氨基酸編碼序列,以保證NS1蛋白的正確剪切和加工。同時,在構(gòu)建ΔCPrM、ΔPrME和ΔPrM復制子時,保留了C蛋白和PrM蛋白、PrM蛋白和E蛋白間的信號肽酶裂解位點。

4種病毒RNA復制子活性鑒定結(jié)果顯示,ΔCPrME復制子轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)綠色熒光蛋白信號最強,ΔPrM次之,剩余二者無明顯差異。結(jié)果表明,復制子表達外源基因的能力可能與結(jié)構(gòu)蛋白缺失的方式有關(guān)。在其他構(gòu)建的黃病毒復制子中也觀察到了類似的情況[5,7]。但總體看來,4種復制子轉(zhuǎn)染細胞中陽性信號的細胞比例均不高,可能是因為復制子基因組較長(約10 kb),轉(zhuǎn)染效率低[12]。因此,如何高效地將RNA復制子遞送進靶細胞是影響復制子表達效率的關(guān)鍵因素之一。同時結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染細胞胞核內(nèi)也能觀察到綠色熒光信號,可能是因為分離的綠色熒光蛋白質(zhì)量較小,能夠穿越進入細胞核。此外,本研究利用構(gòu)建的TMUV RNA復制子進行了H9亞型禽流感病毒HA基因的表達,表明該復制子具有開發(fā)新型疫苗的潛力。

總而言之,本研究利用坦布蘇病毒JXSP株感染性克隆,成功構(gòu)建了ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME和ΔPrM等4種病毒RNA復制子,為病毒致病機制的研究提供新的技術(shù)手段,也為新型疫苗開發(fā)奠定基礎。