王 芳 胡潔瓊 馮彥虎 何 東 （蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化科，蘭州 730030）

胃癌是目前第四大常見腫瘤類型，也是癌癥死亡的第二大原因［1］。盡管胃癌治療方法有所改進(jìn)，如手術(shù)、化療和放療，但這些傳統(tǒng)療法在降低胃癌病死率方面效果有限［2］。胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是多數(shù)胃癌相關(guān)死亡和復(fù)發(fā)的主要原因，嚴(yán)重影響療效［3］。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，免疫逃逸對(duì)胃癌細(xì)胞存活和發(fā)展至關(guān)重要［4］。因此，尋找既能有效治療胃癌又能抑制腫瘤活動(dòng)的藥物是臨床急需解決的問(wèn)題。傳統(tǒng)癌癥治療會(huì)引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此，近幾十年來(lái)，植物化學(xué)物質(zhì)抗癌作用研究逐漸流行［5］。次烏頭堿（hypaconitine，HA）是烏頭中最重要的活性成分之一，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用［6］。據(jù)報(bào)道，HA 可抑制肺癌A549 細(xì)胞黏附、遷移和侵襲，表明HA 具有抗癌作用［7］。但HA 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、免疫逃逸的影響鮮有報(bào)道。研究顯示，激活環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶（cyclic GMPAMP synthase，cGAS）/干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon gene，STING）信號(hào)通路可抑制胃癌進(jìn)展［8］。但HA能否通過(guò)調(diào)控cGAS/STING通路影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、免疫逃逸尚不可知。因此，本研究主要探討HA 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、免疫逃逸的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 人胃癌細(xì)胞系BGC-823 購(gòu)自上海美灣生物科技有限公司；人源NK 細(xì)胞購(gòu)自上海繼和生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 HA 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；cGAS 抑制劑RU.521 購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自無(wú)錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；趨 化 因 子 配 體（chemokine ligand，CXCL）2、CXCL8 ELISA 試劑盒購(gòu)自伊艾博（武漢）科技股份有限公司；兔源一抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-9、cGAS、STING、GAPDH、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將BGC-823 細(xì)胞、NK 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，分為對(duì)照組（NC組）、HA低劑量組（HA-L 組）、HA 中劑量組（HA-M 組）、HA 高劑量組（HA-H 組）、RU.521（cGAS 抑制劑）組、HA-H+RU.521 組，參考文獻(xiàn)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組、RU.521 組BGC-823 細(xì)胞分別用2 μmol/L HA、4 μmol/L HA、8 μmol/L HA、1 μmol/L RU.521 處理24 h；HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì)胞用8 μmol/L HA 和1 μmol/L RU.521 同時(shí)處理24 h［7，9］；NC 組BGC-823 細(xì)胞為未經(jīng)任何處理的BGC-823 細(xì)胞。處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞或細(xì)胞上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將上述各組BGC-823 細(xì)胞置于Transwell 上室，分別與置于Transwell 下室的NK細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，共培養(yǎng)細(xì)胞體系依次命名為NC共培養(yǎng)組、HA-L 共培養(yǎng)組、HA-M 共培養(yǎng)組、HA-H 共培養(yǎng)組、RU.521 共培養(yǎng)組、HA-H+RU.521 共培養(yǎng)組，收集共培養(yǎng)的NK細(xì)胞用于NK細(xì)胞殺傷力鑒定。

1.2.2 CCK-8 檢測(cè)BGC-823 細(xì)胞增殖 將BGC-823 細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96 孔板并培養(yǎng)24 h，按照1.2.1 處理后，10 μl/孔加入CCK-8 試劑，37 ℃再孵育1.5 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)處理0 h、24 h時(shí)450 nm處吸光度。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC-823 細(xì)胞克隆形成能力 將各組BGC-823 細(xì)胞以500 個(gè)/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)14 d后4%多聚甲醛固定20 min，加入0.5%結(jié)晶紫溶液室溫染色20 min，拍攝照片并計(jì)算克隆形成率。

1.2.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC-823 細(xì)胞遷移 將各組BGC-823 細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度90%以上，采用200 μl 移液器吸管尖端在細(xì)胞表面劃痕，顯微鏡下對(duì)0 h 和24 h 劃痕進(jìn)行拍照，并計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.5 Transwell 測(cè)定BGC-823 細(xì)胞侵襲 將30 μl Matrigel 基質(zhì)膠均勻涂抹于Transwell 小室，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至基質(zhì)膠完全凝固。各組BGC-823細(xì)胞加入不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，稀釋后的細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml。Transwell 上 室 加入100 μl 細(xì)胞，下室加入500 μl 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取出Transwell 小室，棉簽輕輕擦拭上層細(xì)胞，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照。

1.2.6 ELISA 檢 測(cè)BGC-823 細(xì) 胞 上 清 中CXCL2、CXCL8 水平 嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)BGC-823細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8水平。

1.2.7 檢測(cè)NK 細(xì)胞殺傷力［10］以NK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，BGC-823 細(xì)胞為靶細(xì)胞，將NK 細(xì)胞與BGC-823 細(xì)胞以1∶10 比例加入96 孔板孵育4 h，離心并收集50 μl 上清，加入新的96 孔板，加入50 μl 乳酸脫氫酶孵育30 min，50 μl 終止液孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處吸光度。NK 細(xì)胞殺傷力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 平均值-僅培養(yǎng)BGC-823 細(xì)胞時(shí)OD 平均值-僅培養(yǎng)NK 細(xì)胞時(shí)OD 平均值）/（BGC-823 細(xì)胞用10 μl 30%TritonX-100培養(yǎng)時(shí)OD 平均值-僅培養(yǎng)BGC-823細(xì)胞時(shí)OD平均值）×100%。

1.2.8 Western blot 檢 測(cè)BGC-823 細(xì) 胞PCNA、MMP-9、cGAS、STING 蛋白表達(dá) RIPA 裂解緩沖液提取BGC-823 細(xì)胞總蛋白，定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗PCNA（1∶2 000）、MMP-9（1∶2 000）、cGAS（1∶3 000）、STING（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000） 4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗（1∶4 000）室溫孵育2 h，ECL 試劑觀察蛋白條帶顯色，Image J 軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間差異比較，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HA 對(duì)BGC-823 細(xì)胞增殖的影響 與NC 組比較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì)胞OD450（24 h）、克隆形成率降低（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞OD450（24 h）、克隆形成率升高（P＜0.05）；與HA-H 組比較，HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì)胞OD450（24 h）、克隆形成率升高（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 各組BGC-823 細(xì)胞OD450（0 h、24 h）、克隆形成率比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of OD450 （0 h， 24 h） and clone formation rate of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

表1 各組BGC-823 細(xì)胞OD450（0 h、24 h）、克隆形成率比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of OD450 （0 h， 24 h） and clone formation rate of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group，2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-H group， 4）P＜0.05.

Clone formation rate/%47.75±2.13 41.12±1.811）33.58±1.611）2）19.95±0.841）2）3）58.86±2.271）35.54±2.064）Groups OD450 0 h 0.24±0.02 0.23±0.01 0.23±0.02 0.22±0.02 0.22±0.01 0.24±0.01 24 h 0.87±0.08 0.75±0.061）0.62±0.061）2）0.41±0.031）2）3）0.93±0.081）0.66±0.054）NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521

圖1 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC-823細(xì)胞克隆形成Fig.1 Clone formation assay detects BGC-823 cell clone formation

2.2 HA 對(duì)BGC-823 細(xì)胞遷移的影響 與NC 組比較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與HA-H組比較，HA-H+RU.521組BGC-823細(xì)胞劃痕愈合率升高（P＜0.05），見圖2、表2。

表2 各組BGC-823細(xì)胞劃痕愈合率比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of scratch healing rates of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

表2 各組BGC-823細(xì)胞劃痕愈合率比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of scratch healing rates of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group，2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-H group， 4）P＜0.05.

Scratch healing rates/%43.37±2.08 36.65±1.541）27.74±1.031）2）13.36±0.621）2）3）51.12±2.111）30.66±2.044）Groups NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521

圖2 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC-823細(xì)胞遷移Fig.2 BGC-823 cell migration detected by scratch healing test

2.3 HA 對(duì)BGC-823 細(xì)胞侵襲的影響 與NC 組比較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì)胞侵襲數(shù)減少（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞侵襲數(shù)增多（P＜0.05）；與HA-H 組比較，HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì) 胞 侵 襲 數(shù) 增 多（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 各組BGC-823細(xì)胞侵襲數(shù)比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of invasion numbers of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

表3 各組BGC-823細(xì)胞侵襲數(shù)比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of invasion numbers of BGC-823 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group，2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-H group， 4）P＜0.05.

Number of cell invasion/number 78.85±3.67 65.59±2.491）51.52±2.011）2）22.23±1.361）2）3）89.96±2.951）54.42±2.024）Groups NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC-823細(xì)胞侵襲（×400）Fig.3 BGC-823 cell invasion detected by Transwell assay（×400）

2.4 HA 對(duì)BGC-823 細(xì)胞上清CXCL2、CXCL8 水平的影響 與NC 組比較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 水平降低（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 水平升高（P＜0.05）；與HA-H 組比 較，HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì) 胞 上 清 中CXCL2、CXCL8水平升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 水平比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Comparison of CXCL2 and CXCL8 levels in supernatant of BGC-823 cells in each group （±s，n=6，pg/ml）

表4 各組BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 水平比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Comparison of CXCL2 and CXCL8 levels in supernatant of BGC-823 cells in each group （±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group，2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-H group， 4）P＜0.05.

CXCL8 126.34±4.15 109.94±3.881）94.45±3.751）2）52.23±2.071）2）3）156.67±5.791）98.86±4.174）Groups NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521 CXCL2 169.73±7.21 136.67±4.561）112.26±3.691）2）73.35±2.191）2）3）201.17±8.671）121.23±6.854）

2.5 HA 對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞體系NK 細(xì)胞殺傷力的影響 與NC 共培養(yǎng)組比較，HA-L 共培養(yǎng)組、HA-M 共培養(yǎng)組、HA-H 共培養(yǎng)組NK 細(xì)胞殺傷力增強(qiáng)（P＜0.05）；與NC 共培養(yǎng)組比較，RU.521 共培養(yǎng)組NK細(xì)胞殺傷力減弱（P＜0.05）；與HA-H共培養(yǎng)組比較，HA-H+RU.521 共培養(yǎng)組NK 細(xì)胞殺傷力減弱（P＜0.05），見表5。

表5 各共培養(yǎng)細(xì)胞體系中NK細(xì)胞殺傷力比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of NK cell lethality in various co-cultured cell systems （±s，n=6）

表5 各共培養(yǎng)細(xì)胞體系中NK細(xì)胞殺傷力比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of NK cell lethality in various co-cultured cell systems （±s，n=6）

Note：Compared with NC co-cultured group， 1）P＜0.05； compared with HA-L co-cultured group， 2）P＜0.05； compared with HA-M cocultured group， 3）P＜0.05； compared with HA-H co-cultured group， 4）P＜0.05.

NK cell lethality/%7.69±0.37 17.79±0.861）26.65±1.331）2）40.77±2.191）2）3）3.26±0.211）20.23±1.014）Groups NC co-cultured HA-L co-cultured HA-M co-cultured HA-H co-cultured RU.521co-cultured HA-H+RU.521 co-cultured

2.6 HA 對(duì)BGC-823 細(xì) 胞PCNA、MMP-9 蛋 白 及cGAS-STING 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與NC 組比 較，HA-L 組、HA-M 組、HA-H 組BGC-823 細(xì) 胞PCNA、MMP-9 蛋白表達(dá)降低，cGAS、STING 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與NC 組比較，RU.521 組BGC-823細(xì)胞PCNA、MMP-9蛋白表達(dá)升高，cGAS、STING蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與HA-H 組比較，HA-H+RU.521 組BGC-823 細(xì)胞PCNA、MMP-9 蛋白表達(dá)升高，cGAS、STING 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖4、表6。

表6 各組BGC-823細(xì)胞PCNA、MMP-9、cGAS、STING蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.6 Comparison of protein expressions of PCNA， MMP-9， cGAS and STING in BGC-823 cells of each group （±s，n=6）

表6 各組BGC-823細(xì)胞PCNA、MMP-9、cGAS、STING蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.6 Comparison of protein expressions of PCNA， MMP-9， cGAS and STING in BGC-823 cells of each group （±s，n=6）

Note：Compared with NC group， 1）P＜0.05； compared with HA-L group， 2）P＜0.05； compared with HA-M group， 3）P＜0.05； compared with HA-Hgroup， 4）P＜0.05.

Groups NC HA-L HA-M HA-H RU.521 HA-H+RU.521 PCNA/GAPDH MMP-9/GAPDH cGAS/GAPDH STING/GAPDH 0.22±0.02 0.32±0.031）0.46±0.031）2）0.85±0.071）2）3）0.10±0.011）0.35±0.024）1.72±0.19 1.36±0.151）1.05±0.091）2）0.67±0.051）2）3）2.06±0.181）1.21±0.104）1.06±0.12 0.83±0.081）0.64±0.061）2）0.32±0.031）2）3）1.51±0.161）0.71±0.064）0.31±0.03 0.43±0.031）0.78±0.061）2）1.21±0.141）2）3）0.21±0.021）0.59±0.054）

圖4 Western blot 檢 測(cè)BGC-823 細(xì) 胞PCNA、MMP-9、cGAS、STING蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot detects PCNA， MMP-9， cGAS and STING protein expressions in BGC-823 cells

3 討論

胃癌是消化道惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、病死率高的特點(diǎn)［11］。臨床治療胃癌的一線藥物毒性大、療效差［12］。因此，胃癌治療需要療效和安全性更好的新型藥物。

近年中藥抗腫瘤作用顯著，引起了國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注，具有不良反應(yīng)小、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)［13］。HA 是一種在烏頭根中發(fā)現(xiàn)的二萜生物堿，具有細(xì)胞毒性作用［14］。據(jù)報(bào)道，HA 可抑制肝癌HepG2 細(xì)胞系生長(zhǎng)，表明HA 具有抗腫瘤作用，與本研究結(jié)果一致［15］。本研究顯示，HA 可抑制胃癌BGC-823 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)抑制增殖相關(guān)蛋白PCNA、遷移和侵襲相關(guān)蛋白MMP-9 表達(dá)，且呈劑量依賴性，表明HA 可抑制胃癌惡性進(jìn)展。CXCL2、CXCL8是一類有利于腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育的趨化因子，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞無(wú)法在正確位置發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答［16］；NK 細(xì)胞是免疫系統(tǒng)重要組成之一，可通過(guò)分泌毒性因子發(fā)揮免疫監(jiān)視作用進(jìn)而清除腫瘤細(xì)胞［10］。本研究顯示，HA 可劑量依賴性地抑制BGC-823 細(xì)胞上清中CXCL2、CXCL8 表達(dá)，提高共培養(yǎng)體系中NK 細(xì)胞殺傷力，表明HA 可抑制BGC-823 細(xì)胞免疫逃逸。提示HA 可能成為治療胃癌的潛在有效藥物。

cGAS 是一種細(xì)胞質(zhì)DNA 傳感器，可激活STING 蛋白，隨后誘導(dǎo)針對(duì)各種含DNA 病原體的保護(hù)性免疫防御并提供抗腫瘤免疫［17-18］。據(jù)報(bào)道，激活非小細(xì)胞肺癌的cGAS/STING 信號(hào)通路可促進(jìn)NK 細(xì)胞浸潤(rùn)和抗腫瘤免疫［19］；激活cGAS/STING 信號(hào)通路可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖［20］；抑制cGAS/STING信號(hào)通路可促發(fā)胰腺癌，表明cGAS/STING 信號(hào)通路參與腫瘤進(jìn)展，與本研究結(jié)果一致［21］。本研究顯示，與NC 組比較，RU.521 組BGC-823 細(xì)胞cGAS、STING 蛋白表達(dá)降低，BGC-823 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸能力增強(qiáng)，表明cGAS/STING 信號(hào)通路參與BGC-823 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)HA 可劑量依賴性地上調(diào)BGC-823 細(xì)胞cGAS、STING 蛋白表達(dá)，推測(cè)HA 可能通過(guò)cGAS/STING通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸。為驗(yàn)證該推測(cè)，本研究在高劑量HA 作用基礎(chǔ)上增加cGAS 抑制劑RU.521 干預(yù)BGC-823 細(xì)胞或共培養(yǎng)細(xì)胞體系，結(jié)果顯示RU.521 減弱了高劑量HA 對(duì)BGC-823 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸的抑制作用，證實(shí)HA 可能通過(guò)激活cGAS/STING 通路抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸。

綜上，HA 可能通過(guò)激活cGAS/STING 通路抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸。HA 對(duì)胃癌進(jìn)展的抑制作用可能涉及其他通路，本研究尚未探究，將是后續(xù)研究重點(diǎn)。