徐益平,尚韜
結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是全球常見的消化道惡性腫瘤之一,國際癌癥研究機構統(tǒng)計數據顯示,CRC發(fā)病率在所有腫瘤中位居第三,死亡率僅次于肺癌位居第二[1]。遠處侵襲和轉移是CRC相關死亡發(fā)生的重要原因之一,盡管CRC治療手段不斷發(fā)展,轉移性結直腸癌患者的療效和預后仍不理想[2-3]。因此,開發(fā)新的分子診療手段,防治結直腸癌的轉移,對于提高結直腸癌患者長期生存和改善預后意義重大。上皮細胞-間充質轉化(EMT)指上皮細胞獲得間充質表型的細胞重編程過程,在結直腸癌轉移侵襲過程中發(fā)揮重要作用[3]。LIM和SH3蛋白1(LASP1)是CRC發(fā)展過程中一種轉移相關蛋白,可通過介導EMT、誘導癌細胞侵襲性表型影響結直腸癌進展[4]。粘附斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)/蛋白激酶B(AKT)可介導結直腸癌細胞EMT促進細胞遷移、侵襲能力[5]。研究報道LASP1可通過誘導FAK/AKT信號通路促進非小肺細胞癌的增殖和侵襲能力[6]。LASP1能否通過FAK/AKT信號通路促進結直腸癌發(fā)展、轉移還未明確。本研究擬通過體外實驗探究LASP1介導FAK/AKT在結直腸癌細胞增殖、遷移侵襲中的作用,以期完善CRC轉移的作用機制,為其防治帶來新辦法。
LOVO人結腸癌細胞(賽百慷(上海)生物技術股份有限公司,iCell-h126);pCMV6-ddk-myc、pCMV6-ddk-myc-LASP1、LASP1-siRNA、NC-siRNA(上海吉瑪公司合成提供);Lipofectamine 3000 試劑(美國Invitrogen抗體公司,L3000-008);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone試劑公司, SH30243.01);Transwell小室、Basement Membrane Matrix基質膠(美國康寧試劑公司, 3422、356234);BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技公司, pc0020);FAK、p-FAK、AKT、p-AKT蛋白抗體(美國Affinity抗體公司,AF6397、AF3398、AF6261、AF0016);LASP1蛋白抗體(美國Abcam抗體公司,ab117806);RIPA裂解液、Tunel細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物公司,P0013D、C1090);反轉錄試劑盒(江蘇康為世紀生物公司,CW2569);MTT試劑盒、總RNA提取試劑TRIzol(生工生物工程(上海)公司,E606334-0500、B511311)。
BB150細胞培養(yǎng)箱、Micro17R低溫高速離心機(美國Thermo公司);610020-9Q化學發(fā)光儀(中國上海勤翔儀器公司);CMaxPlus酶標儀(美國MD公司);CFX Connect實時熒光定量PCR儀(美國BIO RAD公司)。
LOVO細胞使用含10%胎牛血清、1%的青霉素改良的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 3000試劑將pCMV6-ddk-myc(空白質粒)、pCMV6-ddk-myc-LASP1(LASP1過表達質粒)、NC-siRNA(sc-37007)(空白沉默質粒)、LASP1-siRNA(sc-105607)(LASP1沉默質粒)轉染至LOVO細胞,并根據轉染的質粒進行相應分組,分別為pCMV6-NC組、pCMV6-LASP1組、NC-siRNA組、LASP1-siRNA組。
提取各組細胞RNA,反轉錄PCR進行DNA擴增,實時熒光定量PCR檢測LASP1表達。反應條件為變性95℃ 10 min,擴增反應,95℃ 15 s,60℃ 60 s,40次,溶解曲線,95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s。采用2-△△CT法對結果進行相對定量分析。引物序列見表1。
表1 引物序列Table 1 Primer sequence
取對數生長期細胞接種于平板。每孔加入10 μl MTT溶液與細胞混合,放回培養(yǎng)箱內孵育24 h后取出。酶標儀測定490 nm處吸光度值,進行細胞存活計算。
平板接種細胞后用4%多聚甲醛通透細胞。每平板細胞中加入50 μl Tunel檢測液,室溫下避光孵育1 h。PBS漂洗三次,制片、封片。熒光顯微鏡下觀察拍照并計數Tunel陽性細胞數量。
Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板,細胞加入上層小室,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出后,棉簽擦掉上室底層細胞。4%多聚甲醛固定下層小室細胞10 min,PBS洗3次,0.1%結晶紫染液染色計數遷移至下室中的細胞數量。30 μl Matrigel稀釋液包被Transwell小室后4℃孵育過夜,上室加入細胞,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棉簽擦掉上室底層細胞和剩余Matrigel稀釋液,4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗3次,0.1%結晶紫染液染色計數侵襲至下室中的細胞數量。
各組細胞接種于平板,200 μl移液器吸頭劃線創(chuàng)建傷痕,分別24、48 h觀察劃線內細胞愈合情況,并拍照計數。
RIPA裂解收集細胞,離心收集底部細胞沉淀。BCA法測定細胞總蛋白濃度,隨后轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉孵育,TBST清洗。加入檢測的稀釋后的FAK、p-FAK、AKT、p-AKT、LASP1一抗抗體,4℃下?lián)u床振蕩孵育過夜。隔天室溫下振蕩30 min,將上層液體輕輕吸出,TBST清洗3遍。5%脫脂奶粉封閉液稀釋,稀釋對應二抗抗體振蕩孵育1.5 h,TBST清洗。ECL化學發(fā)光顯影,計算各蛋白相對表達含量。
采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數據分析,多組間數據比較采用One-way-ANOAY單因素方差分析,組間兩兩比較采用Tukey檢驗。所有數據以均值±標準差(x±s)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
與pCMV6-NC組相比,pCMV6-LASP1組細胞LASP1mRNA表達顯著上升(P=0.002)。與NCsiRNA組比較,LASP1-siRNA組細胞LASP1mRNA表達顯著下降(P=0.001),見表2。結果顯示細胞轉染成功,可用于后續(xù)實驗檢測。
表2 qRT-PCR檢測LOVO細胞轉染后LASP1的表達Table 2 LASP1 mRNA expression in transfected LOVO cells detected by qRT-PCR
MTT實驗結果顯示,與pCMV6-NC組相比,pCMV6-LASP1組的細胞存活率顯著上升(P=0.000),與NC-siRNA組比較,LASP1-siRNA組的細胞存活率顯著下降(P=0.000),見表3。
表3 LASP1過表達或沉默對LOVO細胞存活的影響Table 3 Effects of overexpression or silencing of LASP1 on the survival of LOVO cells
Transwell和劃痕實驗結果顯示,與pCMV6-NC組相比,pCMV6-LASP1組細胞的遷移以及侵襲數量顯著上升(分別P=0.003、P=0.000),24和48 h傷口愈合率均顯著升高(分別P=0.004、P=0.009);與NC-siRNA組比較,LASP1-siRNA組細胞的遷移以及侵襲數量顯著下降(分別P=0.002、P=0.001)、24 h和48 h傷口愈合率均顯著降低(P=0.006、P=0.004),見圖1。
圖1 LASP1過表達或沉默對LOVO細胞遷移及侵襲能力的影響Figure 1 Effects of LASP1 overexpression or silence on migration and invasion of LOVO cells
Tunel染色結果顯示,與pCMV6-NC組相比,pCM V 6-L A S P 1 組細胞凋亡率顯著降低(P=0.003);與NC-siRNA組比較,LASP1-siRNA組細胞凋亡率顯著升高(P=0.000),見圖2。
圖2 LASP1過表達或沉默對LOVO細胞凋亡的影響 (Tunel染色)Figure 2 Effects of LASP1 overexpression or silence on apoptosis of LOVO Cells (Tunel staining)
Western blot實驗結果顯示,與pCMV6-NC組相比,pCMV6-LASP1組細胞LASP1、p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表達顯著上升(分別P=0.002、P=0.010、P=0.004);與NC-siRNA組比較,LASP1-siRNA組細胞LASP1、p-FAK/FAT、p-AKT/AKT蛋白表達顯著下降(分別P=0.000、P=0.005、P=0.002),見圖3。
圖3 LASP1過表達或沉默對LOVO細胞相關蛋白表達的影響Figure 3 Effects of LASP1 overexpression or silence on related protein expression in LOVO cells
LASP1基因位于染色體17q11-21.3,屬于大肌動蛋白結合神經蛋白家族成員,在人體大部分組織內低表達[7-8]。LASP1的兩端為LIM和SH3結構區(qū)域,可分別與肌動蛋白和其他信號受體發(fā)生作用,參與細胞運動、侵襲等過程[8]。LASP1在晚期結直腸癌組織中表達顯著高于早期,可介導EMT促進CRC遷移,而敲除LASP1表達可以抑制CRC的轉移侵襲[9]。而在體模型表明,LASP1過表達促進了小鼠結直腸原位腫瘤生長和進展[10]。本研究通過構建LASP1過表達質粒和干擾質粒轉染人結腸癌LOVO細胞,通過細胞功能實驗檢測LASP1不同表達對LOVO細胞的影響,結果與朱龍海等[11]研究相符,表明LASP1基因的表達與結腸癌細胞遷移侵襲相關。
FAK為促轉移功能蛋白,磷酸化表達增加可促進CRC細胞EMT及遷移和侵襲能力[12-13]。研究表明,FAK表達降低可抑制CRC細胞與胞外基質粘連作用,進而抑制CRC細胞遷移[14]。AKT相關通路為調節(jié)細胞生長、增殖和抗凋亡的重要通路,結直腸癌出現淋巴結轉移、漿膜層浸潤以及腫瘤低分化患者其癌組織p-AKT表達顯著升高,p-AKT表達與CRC發(fā)展、預后相關[15]。Xu等研究表明FAK蛋白與AKT蛋白可相互作用,敲減CRC細胞FAK表達可抑制p-AKT表達,從而抑制CRC細胞干細胞樣特性與轉移能力[16]。其他相關研究表明,FAK/AKT信號通路激活,可增強CRC細胞遷移、侵襲能力和EMT[5,17]。Zhou等研究結果表明LASP1可通過激活AKT促進CRC進展[18]。本研究結果表明,LASP1可調控CRC細胞中FAK/AKT信號通路的表達,由此推測LASP1可介導FAK/AKT信號通路參與CRC細胞增殖、遷移及侵襲過程。
綜上,本研究結果表明LASP1基因表達促進了LOVO細胞增殖、遷移和侵襲能,而敲減LOVO細胞LASP1表達起相反作用,LASP1介導FAK/AKT通路表達是其促進CRC發(fā)展機制之一。由于本課題組條件有限,未能進行動物模型實驗進一步研究LASP1介導FAK/AKT表達對CRC進展的影響。以后我們將繼續(xù)探索LASP1介導FAK/AKT調控CRC進展的機制,為臨床防治CRC轉移提供新的方向。
利益沖突聲明:
所有作者均聲明不存在利益沖突。